犀角地黃湯合銀翹散通過(guò)干預(yù)mtROS-NLRP3通路抑制流感病毒感染的巨噬細(xì)胞焦亡*

趙夢(mèng)繁，蘇日娜，毛 欽，馬璐瑤，劉天怡，吳 珺，游雷鳴，郝 鈺

（北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院免疫與微生物學(xué)系，北京102488）

流感病毒性肺炎是流感的常見(jiàn)并發(fā)癥，流感病毒經(jīng)常會(huì)侵襲下呼吸道，引起過(guò)度的免疫反應(yīng)，繼而進(jìn)一步造成細(xì)胞因子風(fēng)暴，對(duì)肺部造成嚴(yán)重的炎性損傷。目前針對(duì)流感病毒性肺炎西醫(yī)多以口服抗病毒藥奧司他韋作為標(biāo)準(zhǔn)治療［1］，但沒(méi)有達(dá)到令人滿(mǎn)意的效果，因此研究針對(duì)過(guò)度炎癥反應(yīng)的藥物對(duì)流感病毒性肺炎乃至新冠肺炎的防治均有實(shí)際意義。

流感病毒性肺炎隸屬于中醫(yī)“瘟疫”范疇。犀角地黃湯合銀翹散（Xijiao-Dihuang decoction combined with Yinqiao powder，XDY）作為吳鞠通《溫病條辨》中代表方劑的合方，以衛(wèi)氣營(yíng)血為辯證之綱，銀翹散疏風(fēng)解表，清解衛(wèi)分之熱毒；犀角地黃湯清熱涼血，涼解營(yíng)分之熱毒，兩方合用，內(nèi)外兼顧，發(fā)揮清熱涼血、化瘀解毒之功效，可在臨床上用于治療流感病毒性肺炎。我們課題組的前期研究表明，犀角地黃湯合銀翹散對(duì)小鼠流感病毒性肺炎有顯著的治療作用，可顯著減少肺炎小鼠的炎性因子表達(dá)及肺部的炎癥反應(yīng)，對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性有抑制作用［2］，但其抗炎機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

巨噬細(xì)胞在清除病原微生物過(guò)程中起著重要的作用，是機(jī)體面對(duì)外界刺激產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞。巨噬細(xì)胞被流感病毒感染后，發(fā)生強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，生成線(xiàn)粒體活性氧簇（mitochondrial reac‐tive oxygen species，mtROS），激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomeriza‐tion domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體，繼而活化的caspase-1切割gasdermin D（GSDMD），產(chǎn)生GSDMDN端片段（GSDMD-N），介導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生焦亡，促使炎性因子，如白細(xì)胞介素1β（interleu‐kin-1β，IL-1β）大量分泌［3］，發(fā)生細(xì)胞因子風(fēng)暴。前期研究已證明XDY可以改善大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性［4］，抑制流感病毒感染大鼠肺泡巨噬細(xì)胞致炎物質(zhì)的產(chǎn)生［5］。但是XDY對(duì)巨噬細(xì)胞焦亡的作用尚未可知。因此，本研究以流感病毒感染的小鼠巨噬細(xì)胞為模型，以mtROS-NLRP3通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡為切入點(diǎn)，探究XDY的抗炎機(jī)制。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

流感病毒鼠肺適應(yīng)株［A/PR/8/34（H1N1），PR8］由本教研室液氮保存。小鼠巨噬細(xì)胞系J774A.1購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)。犀角地黃湯合銀翹散（含水牛角30 g、生地30 g、芍藥12 g、丹皮9 g、連翹9 g、銀花9 g、苦桔梗6 g、薄荷6 g、竹葉4 g、生甘草5 g、荊芥穗5 g、淡豆豉5 g和牛蒡子9 g，購(gòu)自北京同仁堂藥店）制成水煎劑，再制成凍干粉，提取率14.53%，即每100 g生藥提取14.53 g凍干粉。小鼠IL-1βELISA檢測(cè)試劑盒、anti-NLRP3抗體、anti-GSDMD-N抗體、山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG（Abacam）；MitoTrack‐er?Red CMXRos（Invitrogen）；ROS檢測(cè)試劑盒和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè)試劑盒（碧云天生物）；FAMFLICA?Caspase-1 Assay Kit（Im‐munoChemistry）；胎牛血清（HyClone）。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞分組及處理 將巨噬細(xì)胞J774A.1置于37℃、5%CO2的無(wú)菌培養(yǎng)箱，在含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組（control組，正常培養(yǎng)不予PR8病毒感染）、模型組（PR8組，PR8感染24 h）、XDY干預(yù)組（PR8+XDY組，PR8感染+XDY作用24 h）、H2O2對(duì)照組（H2O2組，H2O2作用24 h）和H2O2+XDY組（H2O2+XDY作用24 h）。PR8感染量為100 TCID50，XDY終濃度為162.5 mg/L，H2O2終濃度為100 mmol/L。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) （1）各組細(xì)胞刮下后，用PBS洗滌細(xì)胞2次，之后每組細(xì)胞用FLICA?caspase-1染色工作液（1∶30）重懸細(xì)胞并混勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育60 min后，用1×Wash Buffer洗滌細(xì)胞2次，并加入PI染色液（1∶100）重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。（2）將各組刮下來(lái)的細(xì)胞用PBS洗滌2遍，加入DCFH-DA（終濃度10μmol/L），37℃孵育30 min，棄去染料用PBS洗滌2遍并重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.3 Western blot檢測(cè) 收集各組巨噬細(xì)胞，提取細(xì)胞中的蛋白并進(jìn)行蛋白定量。蛋白變性后每組蛋白上樣質(zhì)量為40μg，進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)條件180 mA電轉(zhuǎn)120 min至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1 h，加入兔源抗NLRP3抗體、鼠源抗GSDMD-N抗體及鼠源抗β-actin抗體（均按1∶1 000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，加入相應(yīng)的羊抗兔Ⅱ抗和羊抗鼠Ⅱ抗（均按1∶5 000稀釋?zhuān)?，室溫?fù)u床孵育1 h。TBST洗膜3次，HRP-ECL超敏發(fā)光劑顯色、曝光。以目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值進(jìn)行半定量。

2.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β和LDH的檢測(cè) 收集各組細(xì)胞的上清液，參照IL-1βELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定IL-1β分泌水平，依照LDH檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)LDH釋放水平。

2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法 將巨噬細(xì)胞J774A.1接種到激光共聚焦培養(yǎng)皿中（每皿2×106個(gè)細(xì)胞），細(xì)胞處理24 h后棄去培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞，加入線(xiàn)粒體膜染料MitoTracker Red（1∶1 000）和ROS熒光探針DCFH-DA（終濃度10μmol/L），37℃孵育30 min，棄去染料用PBS洗2遍，加入DMEM，在激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察線(xiàn)粒體和ROS的共定位情況和ROS熒光強(qiáng)度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，則采用單因素方差分析，多重比較采用SNK法（方差齊時(shí)）或Games-Howell法（方差不齊時(shí)）。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 XDY對(duì)流感病毒感染的巨噬細(xì)胞LDH釋放水平的影響

對(duì)巨噬細(xì)胞釋放的LDH進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型組及H2O2對(duì)照組巨噬細(xì)胞釋放的LDH水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）；與模型組相比，PR8+XDY組巨噬細(xì)胞釋放的LDH水平顯著降低（P<0.05）；與H2O2對(duì)照組相比，XDY也能夠顯著降低H2O2刺激巨噬細(xì)胞所釋放的LDH水平（P<0.05），見(jiàn)圖1。

Figure 1.Effects of XDY on release of LDH in J774A.1 cells in‐fected with influenza virus PR8.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；#P<0.05 vs PR8 group；△P<0.05 vs H2O2 group.圖1 XDY對(duì)PR8感染的巨噬細(xì)胞LDH釋放水平的影響

2 XDY對(duì)流感病毒感染的巨噬細(xì)胞中GSDMD-N表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，巨噬細(xì)胞經(jīng)PR8感染或H2O2刺激后，其GSDMD-N的相對(duì)表達(dá)量顯著增高（P<0.05或P<0.01）；與模型組和H2O2對(duì)照組相比，XDY干預(yù)顯著下調(diào)GSDMD-N的表達(dá)量（P<0.05），見(jiàn)圖2。

Figure 2.Effects of XDY on the protein expression of GSDMD-Nin J774A.1 cells infected with influenza virus PR8.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs PR8 group；△P<0.05 vs H2O2 group.圖2 XDY對(duì)PR8感染的巨噬細(xì)胞中GSDMD-N蛋白表達(dá)的影響

3 XDY對(duì)流感病毒感染的巨噬細(xì)胞焦亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組和H2O2對(duì)照組caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡率顯著升高（P<0.01）；而PR8+XDY組和H2O2+XDY組cas‐pase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡率比相應(yīng)的模型組和H2O2對(duì)照組顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖3。

Figure 3.Effects of XDY on the pyroptotic rate of J774A.1 cells infected with influenza virus PR8.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs PR8 group；△P<0.05 vs H2O2 group.圖3 XDY對(duì)PR8感染的巨噬細(xì)胞焦亡率的影響

4 XDY對(duì)流感病毒感染的巨噬細(xì)胞中NLRP3蛋白表達(dá)的影響

Figure 4.Effects of XDY on the protein expression of NLRP3 in J774A.1 cells infected with influenza virus PR8.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs PR8 group；△P<0.05 vs H2O2 group.圖4 XDY對(duì)PR8感染的巨噬細(xì)胞中NLRP3蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組和H2O2對(duì)照組巨噬細(xì)胞中的NLRP3蛋白表達(dá)量顯著增高（P<0.05）；加入XDY進(jìn)行干預(yù)后，細(xì)胞中的NLRP3表達(dá)量顯著減少（P<0.05），見(jiàn)圖4。

5 XDY對(duì)流感病毒感染的巨噬細(xì)胞IL-1β分泌水平的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組和H2O2對(duì)照組的IL-1β分泌水平顯著升高（P<0.01）；PR8+XDY組和H2O2+XDY組的IL-1β分泌水平相對(duì)于模型組和H2O2對(duì)照組均相應(yīng)降低（P<0.05或P<0.01），見(jiàn)圖5。

6 XDY對(duì)流感病毒感染的巨噬細(xì)胞內(nèi)mtROS的影響

激光共聚焦顯微鏡顯示，模型組巨噬細(xì)胞生成的ROS與線(xiàn)粒體有明顯的共定位關(guān)系且ROS生成顯著增多，與模型組相比，XDY干預(yù)后mtROS顯著下降，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果與其一致，見(jiàn)圖6。

討 論

Figure 5.Effects of XDY on the secretion of IL-1βin J774A.1 cells infected with influenza virus PR8.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group；#P<0.05 vs PR8 group；△△P<0.01 vs H2O2 group.圖5 XDY對(duì)PR8感染的巨噬細(xì)胞分泌IL-1β的影響

Figure 6.Effects of XDY on the production of mtROSin J774A.1 cells infected with influenza virus PR8.A：detection of the subcel‐lular location of mtROSwas performed by labeling with the probe DCFH-DA and MitoTracker CMXRos in J774A.1 cells ob‐served under confocal fluorescence microscope；B：overlap confficient of ROS and MitoTracker quantification of A；C：overlay map of fluorescence histogram of ROSin J774A.1 cells；D：relative fluorescence intensity of DCFH-DA.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group；##P<0.01 vs PR8 group.圖6 XDY對(duì)PR8感染的巨噬細(xì)胞mtROS產(chǎn)生的影響

細(xì)胞焦亡是近些年發(fā)現(xiàn)的一種促炎癥反應(yīng)的細(xì)胞程序性死亡方式。細(xì)胞發(fā)生焦亡后，喪失了胞膜的完整性，從而使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)釋放到胞外［6］。細(xì)胞焦亡過(guò)程中，GSDMD-N聚集在胞膜表面，形成直徑約1.1～2.4 nm的孔洞，導(dǎo)致胞膜兩側(cè)的離子濃度平衡喪失，引起滲透性腫脹和裂解死亡。另一方面，細(xì)胞中的LDH大量釋放到胞外，成熟的IL-1β和IL-18等炎性物質(zhì)也在形成孔洞的同時(shí)從胞內(nèi)大量滲出，其對(duì)周邊細(xì)胞產(chǎn)生促炎信號(hào)，誘導(dǎo)其他炎性物質(zhì)的形成，誘發(fā)級(jí)聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起嚴(yán)重的細(xì)胞損傷［7-8］。最近針對(duì)流感病毒的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，用A型流感病毒感染小鼠巨噬細(xì)胞，可導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性喪失、乳酸脫氫酶以及促炎性細(xì)胞因子的外溢，提示細(xì)胞焦亡參與了流感病毒的致炎過(guò)程［9］。焦亡的發(fā)生有利于清除病原微生物而抵御其危害，但同時(shí)因大量炎性因子的產(chǎn)生和釋放所引起的炎癥反應(yīng)被無(wú)限擴(kuò)大，給感染機(jī)體造成更為嚴(yán)重的后果［10］。本研究結(jié)果表明，流感病毒感染巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞LDH釋放量顯著增多，GSDMD-N的蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)，并且caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡也顯著增加，而XDY加入后能起到明顯的抑制作用，說(shuō)明流感病毒感染誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生焦亡，XDY可抑制流感病毒誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡。

細(xì)胞焦亡的發(fā)生與炎癥小體活化密切相關(guān)。炎癥小體由受體蛋白、銜接蛋白、pro-caspase組成。正常狀態(tài)下，炎癥小體各個(gè)成分以穩(wěn)定狀態(tài)存在于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中，在接受刺激后，它們會(huì)聚集形成復(fù)合物，這一過(guò)程稱(chēng)為炎癥小體激活。在固有免疫發(fā)生的過(guò)程中，模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）通過(guò)病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）對(duì)外來(lái)微生物病原體進(jìn)行識(shí)別，NLRP3則是在炎癥反應(yīng)中常見(jiàn)的模式識(shí)別受體。受到刺激的NLRP3與ASC在PYD-PYD結(jié)構(gòu)域結(jié)合，ASC再通過(guò)CARD-CARD結(jié)構(gòu)域與caspase-1前體（procaspase-1）發(fā)生結(jié)合并產(chǎn)生相互作用，在水解酶原的作用下，procaspse-1發(fā)生自體水解，此時(shí)的caspase-1具有酶活性［11］。活化的caspase-1使proIL-1β和proIL-18成熟，并能切割GSDMD使其N(xiāo)端釋放，GSDMD-N與細(xì)胞膜的表面發(fā)生結(jié)合，在細(xì)胞膜表面形成孔洞，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生焦亡［12］。本研究結(jié)果顯示，流感病毒感染的巨噬細(xì)胞中NLRP3表達(dá)量顯著增高，caspase-1活性增強(qiáng)，IL-1β分泌量顯著增多，說(shuō)明流感病毒可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化，介導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，而XDY可通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體活化起到明顯的干預(yù)作用。

ROS是NLRP3炎癥小體活化的途徑之一，本研究中用H2O2處理細(xì)胞，構(gòu)建線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激損傷模型，證明了mtROS與NLRP3炎癥小體活化的關(guān)系。我們的前期研究證明，流感病毒感染的巨噬細(xì)胞mtROS產(chǎn)生增多是由于線(xiàn)粒體損傷所致，通過(guò)清除mtROS可顯著抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生［13］。本研究中也發(fā)現(xiàn)流感病毒感染的巨噬細(xì)胞mtROS顯著增多，并誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的活化，這些結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［14-16］。XDY干預(yù)后，流感病毒感染的巨噬細(xì)胞mtROS顯著減少，NLRP3炎癥小體活化受到抑制，并減少了細(xì)胞焦亡的發(fā)生。

綜上所述，流感病毒感染的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，ROS誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體形成，caspase-1活化；活化的caspase-1促使pro-IL-1β形成成熟的IL-1β，并切割GSDMD，產(chǎn)生的GSDMD-N在細(xì)胞膜上形成孔道，釋放大量的IL-1等炎性因子，引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。XDY通過(guò)減少線(xiàn)粒體釋放的ROS，抑制NLRP3炎癥小體活化，進(jìn)而抑制caspase-1誘導(dǎo)的GSDMD-N表達(dá)，抑制流感病毒感染的巨噬細(xì)胞發(fā)生焦亡，減少I(mǎi)L-1β等炎癥因子的分泌，從而發(fā)揮抗炎作用。本研究進(jìn)一步完善了XDY抗炎相關(guān)分子機(jī)制，為今后深入研究其抗炎作用提供了方向。