生長(zhǎng)激素釋放激素受體激動(dòng)劑MR409對(duì)db/db小鼠糖尿病腎病作用的研究*

唐 琪，蔡瑞平，薛銳澤，劉月陽，姚 陽，周明生△

（1沈陽醫(yī)學(xué)院生理教研室，2沈陽藥科大學(xué)，遼寧沈陽110034）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，是引起終末期腎?。╡ndstage renal disease，ESRD）的主要病因［1-3］。相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，到2030年，全球糖尿病發(fā)病率將比2010年增加近1.5倍［4］。DN表現(xiàn)為持續(xù)性蛋白尿增加，其典型的腎形態(tài)變化包括腎小球和腎小管基底膜（glomerular basement membrance，GBM）增厚、腎小管萎縮、腎臟炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化等［5-6］。DN常伴有腎血管功能障礙［7］，腎臟炎癥，氧化應(yīng)激［8-9］和腎纖維化［10］增加等過程，其中氧化應(yīng)激反應(yīng)被認(rèn)為在DN發(fā)病中起著非常重要的作用。目前，臨床上對(duì)DN的治療主要通過控制血糖以及一些對(duì)癥治療方法來延緩疾病的發(fā)展，延長(zhǎng)患者生存時(shí)間［11-12］，尚缺乏針對(duì)DN的有效治療藥物。

生長(zhǎng)激素釋放激素（growth hormone release hor‐mone，GHRH）是主要由下丘腦分泌的一種神經(jīng)多肽，通過促進(jìn)腦垂體合成和釋放生長(zhǎng)激素而促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用。但近年來發(fā)現(xiàn)除腦垂體和中樞神經(jīng)系統(tǒng)外，機(jī)體中許多細(xì)胞也可表達(dá)GHRH受體，如心臟、血管、胰島細(xì)胞、腎臟和視網(wǎng)膜細(xì)胞等［13］。MR409是由美國邁阿密大學(xué)醫(yī)學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Andrew Schally實(shí)驗(yàn)室合成的一種生長(zhǎng)激素釋放激素類似物（growth hormone releasing hormone analogue，GHRHA），目前尚未在市場(chǎng)銷售。與體內(nèi)天然GHRH多肽相比，MR409具有半衰期長(zhǎng)，作用穩(wěn)定并且無下丘腦-垂體軸刺激等副作用。MR409通過促進(jìn)干細(xì)胞增殖，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)等在實(shí)驗(yàn)性1型糖尿病胰島移植［14］、糖尿病眼?。?5］、各種心臟［16-17］和血管［18］病變等當(dāng)中發(fā)揮保護(hù)作用。MR409對(duì)糖尿病腎病的影響尚無文獻(xiàn)報(bào)道，基于DN與糖尿病眼病均屬于微血管病變，且二者在發(fā)病機(jī)制上如炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)等過程中具有一些相似性，因此本項(xiàng)工作選用MR409治療db/db轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠，探討其對(duì)小鼠腎損傷、腎纖維化及腎臟氧化應(yīng)激的影響。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性10周齡野生型（wild type，WT）小鼠10只，體重（27±2）g，db/db小鼠20只，體重（48±4）g，購買于南京大學(xué)動(dòng)物模型研究中心。

2 主要試劑與儀器

MR409由邁阿密大學(xué)Andrew Schally實(shí)驗(yàn)室合成并贈(zèng)送。尿蛋白定量測(cè)試盒（CBB法）、肌酐（creati‐nine，Cr）測(cè)試盒（肌氨酸氧化酶法）、總膽固醇（total cholesterol，TC）測(cè)定試劑盒（COD-PAP法）和甘油三脂（triglyceride，TG）測(cè)定試劑盒（GPO-PAP酶法）購于南京建成生物工程研究所有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、糖原PAS染色液試劑盒、Masson三色染色試劑盒和天狼星紅染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；二氫乙啶（dihydroethidium，DHE）為Sigma-Aldrich產(chǎn)品；gp91phox抗體（Abcam）；p22phox、纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factorβ1，TGFβ1）抗體均為Santa Cruz產(chǎn)品；β-actin抗體（ABclonal）；實(shí)驗(yàn)中所使用Ⅱ抗（抗羊、抗兔、抗鼠）均為Proteintech產(chǎn)品。熒光酶標(biāo)儀（Omega）；SDS電泳儀（Bio-Rad）。

3 方法

3.1 動(dòng)物模型的建立及分組 SPF級(jí)10周齡雄性db/db小鼠和WT小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后進(jìn)行治療，治療8周后處死所有小鼠。db/db小鼠是一種先天瘦素受體基因缺失的小鼠，用于復(fù)制2型糖尿病模型，長(zhǎng)期的高血糖可導(dǎo)致腎臟損傷。所有小鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，光/暗循環(huán)12 h。WT小鼠為正常對(duì)照組（WT組），將db/db小鼠隨機(jī)分為模型組（db/db組）和MR409治療組（MR409-db/db組），MR409治療組隔天皮下給予MR409（每只15μg；MR409溶解于含有1‰DMSO的10%的丙二醇溶液中），對(duì)照組和模型組注射等量的溶劑對(duì)照，治療8周，治療期間每周測(cè)定體重并觀察小鼠的生長(zhǎng)情況。MR409藥物劑量和方法是參考Zhang等［14］治療小鼠使用的劑量（每只10μg），考慮到db/db小鼠的體重大于一般小鼠體重，劑量調(diào)整為每只15μg，隔日皮下注射，該劑量經(jīng)本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證有效。

3.2 樣本收集 小鼠禁食8～10 h，用1%的戊巴比妥鈉（100 mg/kg）處死小鼠后取血，室溫放置血液凝固后1 000×g離心10 min取上清，-80℃保存；小鼠尿液由膀胱穿刺收集。取出小鼠腎臟后剔除周圍多余脂肪組織，稱量雙側(cè)腎臟濕重后去除腎臟外包膜，取小鼠左腎放入?80℃冰箱保存，用于提取蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)，右腎放入4%多聚甲醛保存，做成石蠟切片后行病理檢測(cè)。以腎重（g）÷體重（g）×100%作為腎臟指數(shù)（kidney index，KI）。

3.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 尿蛋白定量測(cè)試盒（CBB法），肌酐測(cè)定試劑盒（肌氨酸氧化酶法，微板法），膽固醇測(cè)定試劑盒（單試劑GPO-PAP法），甘油三酯測(cè)定試劑盒（單試劑GPO-PAP法）和血糖試紙條（葡萄糖氧化酶法）檢測(cè)各項(xiàng)生化指標(biāo)。

3.4 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 將4%多聚甲醛固定過的腎臟部分取出，流水沖洗，經(jīng)包埋、固定，連續(xù)切片制作成3μm厚的石蠟切片，將切片脫蠟至水，進(jìn)行PAS和Masson等化學(xué)染色，中性樹膠封片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察各組腎臟組織形態(tài)學(xué)變化。PAS染色評(píng)估腎小球損傷，腎小球中深紫色被認(rèn)為是腎小球硬化，用ImageJ軟件分析腎小球硬化區(qū)域百分比。Masson和天狼星紅染色評(píng)估腎纖維化程度，Masson染色中藍(lán)色被認(rèn)為是膠原纖維，天狼星紅染色中紅色被認(rèn)為是膠原纖維，用ImageJ軟件評(píng)估陽性染色區(qū)域的百分比來評(píng)價(jià)腎臟組織纖維化程度。

3.5 Western blot 用組織細(xì)胞裂解液對(duì)小鼠腎臟進(jìn)行裂解，BCA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)濃度加入適量上樣緩沖液，充分混勻后，放入恒溫干浴器中進(jìn)行蛋白變性，100℃加熱10 min。上樣后經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用5%的BSA室溫封閉2 h，再分別加入Ⅰ抗［β-actin（1∶3 000），p22phox（1∶200），gp91phox（1∶1 000），TGFβ1（1∶200），F(xiàn)N（1∶200）］，搖床上室溫孵育2 h，放入4℃冰箱過夜，用TBST洗膜3次，每次10 min，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫孵育2 h，用TBST洗膜3次，用ECL顯影液孵育1 min，吸去膜上多余顯影液，用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，拍照后用Image J進(jìn)行灰度值分析，結(jié)果用目的蛋白與β-actin的比值表示。

3.6 原位O2-的測(cè)定 3μm厚度的腎臟石蠟切片脫蠟后浸入含有2μmol/L DHE的HEPES緩沖液中，37℃避光孵育30 min。采用Leica熒光顯微鏡攝取圖片，采用雙盲設(shè)計(jì)評(píng)估圖像的氧化熒光強(qiáng)度，平均熒光強(qiáng)度用于目標(biāo)定量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Image J圖像分析軟件對(duì)染色攝取圖片以及Western blot結(jié)果進(jìn)行定量分析，結(jié)果均重復(fù)3～5次。采用IBM SPSSStatistics 24進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MR409降低db/db小鼠血清中TC和TG水平并改善腎臟功能

MR409治療對(duì)db/db小鼠血糖無明顯改變。與WT小鼠相比，db/db小鼠血清中TC和TG水平顯著增加（P<0.01），MR409治療后db/db小鼠血清中TC和TG水平降低（P<0.05），見表1。與WT小鼠相比，db/db小鼠尿蛋白/肌酐比顯著升高（P<0.01），MR409治療可降低該比值（P<0.05）；小鼠糖尿病后期腎臟萎縮，腎功能下降，經(jīng)MR409治療后，db/db小鼠腎臟指數(shù)顯著升高（P<0.01），見圖1。

表1 各組代謝及生化指標(biāo)Table 1.Metabolic and biochemical indexes of each group（Mean±SEM.n=10）

2 MR409治療減輕db/db小鼠的腎組織結(jié)構(gòu)損傷

HE染色可見，WT組小鼠腎小球，腎小管及系膜結(jié)構(gòu)排列整齊，輪廓清晰，基底膜較完整。db/db組小鼠腎小球充血擴(kuò)張，系膜基質(zhì)增多，腎小囊壁細(xì)胞部分萎縮。為了評(píng)估MR409的治療對(duì)db/db小鼠腎損傷的作用，將腎組織用PAS染色，腎小球中紫紅色被認(rèn)為是陽性，計(jì)算出腎小球硬化面積的百分比。與WT組小鼠相比，db/db小鼠腎小球硬化程度顯著增加（P<0.01），而MR409治療可顯著改善腎小球硬化程度（P<0.01）。見圖2。

3 MR409治療降低db/db小鼠的腎臟纖維化程度

為了確定MR409對(duì)腎臟纖維化的影響，進(jìn)行了Masson染色和天狼星紅染色，并對(duì)膠原纖維染色區(qū)域做定量分析。Masson染色模型組小鼠腎臟中有明顯的藍(lán)色膠原纖維，天狼星紅染色模型組小鼠腎臟中有明顯的紅色膠原纖維。Masson染色和天狼星紅染色均顯示，與WT小鼠比較，db/db小鼠腎臟間質(zhì)陽性膠原纖維顯著增加（P<0.01），MR409治療后db/db小鼠腎臟間質(zhì)陽性膠原纖維顯著降低（P<0.01），見圖3。

Figure 1.The ratio of albuminuria/creatinine（A）and kidney index（B）in each group.Mean±SEM.n=10.**P<0.01 vs WT group；#P<0.05，##P<0.01 vsdb/db group.圖1 各組小鼠尿蛋白/肌酐比及腎臟指數(shù)情況

Figure 2.Morphological observation of renal tissues in each group（A）and quantitative assessment of glomerular sclerosing area（B）.Mean±SEM.n=6.**P<0.01 vs WTgroup；##P<0.01 vsdb/db group.圖2 各組腎組織的形態(tài)學(xué)觀察

4 MR409治療降低db/db小鼠腎臟組織TGFβ1和FN蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組相比，db/db小鼠的腎臟組織TGFβ1和FN顯著增加(P<0.05)，MR409治療后TGFβ1和FN表達(dá)均降低（P<0.05），見圖4。

5 MR409治療降低db/db小鼠腎臟的氧化應(yīng)激水平

與對(duì)照組比較，db/db小鼠腎組織細(xì)胞平均氧化熒光強(qiáng)度顯著增加（P<0.01），MR409治療后顯著降低db/db小鼠腎組織內(nèi)平均氧化熒光強(qiáng)度（P<0.01），見圖5。與DHE染色平均氧化熒光強(qiáng)度變化相一致，在db/db小鼠腎組織中兩個(gè)NADPH氧化酶亞基gp91phox和p22phox的蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.05），而MR409治療后兩個(gè)NADPH氧化酶亞基gp91phox和p22phox的蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），見圖6。

討 論

糖尿病患者長(zhǎng)期血糖失控可引發(fā)各種并發(fā)癥，其中近三分之一的1型或2型糖尿病最終可發(fā)展為DN［5］。DN是糖尿病慢性微血管并發(fā)癥的腎臟表現(xiàn)，也是導(dǎo)致糖尿病患者終末期腎病及死亡的主要病因之一，主要表現(xiàn)為腎小管及間質(zhì)持續(xù)進(jìn)展的纖維化［19］。目前對(duì)DN的治療缺乏有效的方法，特別是終末期糖尿病腎病主要依賴透析治療來延緩生命。本研究結(jié)果顯示用GHRHR激動(dòng)劑MR409長(zhǎng)期治療可以明顯減少db/db糖尿病小鼠的蛋白尿，改善腎組織的結(jié)構(gòu)損傷和纖維化，并降低腎臟氧自由基和氧化應(yīng)激反應(yīng)，而且MR409治療對(duì)糖尿病小鼠的血糖水平無明顯影響。以上結(jié)果提示GHRHR激動(dòng)劑有望成為一類新的治療糖尿病腎病的藥物。

Figure 3.Renal fibrosis in each group.Masson staining observation：blue collagen fibers are positive；Sirius red staining observa‐tion：red collagen fibers are positive.Mean±SEM.n=6.**P<0.01 vs WT group；##P<0.01 vsdb/db group.圖3 各組小鼠腎臟纖維化情況

Figure 4.The expression levels of fibrosis-related proteins FN（A）and TGFβ1（B）in renal tissues of each group.Mean±SEM.n=6.*P<0.05，**P<0.01 vs WTgroup;#P<0.05，##P<0.01 vsdb/db group.圖4 各組腎組織中纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)水平

Figure 5.Reactive oxygen species in renal tissues of each group.Mean±SEM.n=6.**P<0.01 vs WT group；##P<0.01 vs db/db group.圖5 各組腎臟組織活性氧產(chǎn)生情況

Figure 6.The expression levels of oxidative stress-related proteins NADPH oxidase subunits p22phox（A）and gp91phox（B）.Mean±SEM.n=6.**P<0.01 vs WTgroup；#P<0.05，##P<0.01 vsdb/db group.圖6 各組腎組織中氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平

MR409是人工合成的一個(gè)GHRHR激動(dòng)劑，GHRHR是細(xì)胞膜上的一個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體，GHRHR激動(dòng)劑與受體結(jié)合后主要通過激活與G蛋白偶聯(lián)-腺苷酸環(huán)化酶-cAMP信號(hào)通路，后者進(jìn)一步激活蛋白激酶A和PI3K/AKT通路發(fā)揮各種生物效應(yīng)［20］。GHRHR可在下丘腦-垂體軸外的外周細(xì)胞和組織表達(dá)［13］，GHRHR激動(dòng)劑可直接與這些中樞外細(xì)胞受體結(jié)合而影響這些細(xì)胞功能。在血管平滑肌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中，GHRHR激動(dòng)劑通過激活PKA而抑制NADPH氧化酶以及NF-κB活性，從而降低氧自由基產(chǎn)生和發(fā)揮抗炎效應(yīng)［18］。研究顯示某些人工合成的GHRHR激動(dòng)劑如MR409治療可以改善實(shí)驗(yàn)性充血性心力衰竭的心功能和心肌結(jié)構(gòu)損傷。在急性心肌梗死的小鼠模型中，MR409能促進(jìn)干細(xì)胞入駐到缺血組織并修復(fù)心肌損傷［16］。GHRHR激動(dòng)劑對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病具有良好的治療效應(yīng)，Zhang等［14］報(bào)告用GHRHR激動(dòng)劑包括MR409體外預(yù)處理胰島干細(xì)胞可明顯提高胰島細(xì)胞移植的存活率和療效，降低1型糖尿病小鼠的血糖和改善胰腺功能。MR409治療能明顯改善糖尿病視網(wǎng)膜病變，其機(jī)制可能與抑制視網(wǎng)膜血管的炎癥和降低氧自由基有關(guān)［15］。GHRHR激動(dòng)劑治療糖尿病腎病尚無文獻(xiàn)報(bào)道，本研究顯示MR409能顯著降低db/db糖尿病腎病小鼠蛋白尿和腎損傷，提示GHRHR激動(dòng)劑在DN中的治療價(jià)值。盡管本研究沒有對(duì)機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)研究，我們研究結(jié)果顯示，MR409治療可顯著降低腎內(nèi)氧化應(yīng)激水平，因此，降低腎臟氧化應(yīng)激可能是MR409減輕糖尿病腎損傷的一個(gè)機(jī)制。

在進(jìn)行性腎臟疾病中，纖維化是終末期腎衰竭的常見途徑［21］。在診斷為腎萎縮和腎衰竭的患者的腎纖維化組織中，纖連蛋白水平顯著升高［22］。FN和IV型膠原在腎小球系膜和腎小管間質(zhì)中的積累最終導(dǎo)致上皮向成纖維細(xì)胞過渡，從而導(dǎo)致纖維化，這是DN的標(biāo)志性特征［23］。除FN外，TGFβ1也已被確立為腎臟纖維化的主要介質(zhì)［21，24］。TGFβ1在各種腎細(xì)胞中表達(dá)，它能調(diào)節(jié)多種途徑影響腎纖維化的進(jìn)展［25-26］。TGFβ1的過表達(dá)則誘導(dǎo)了腎纖維化，而TGFβ1或其下游信號(hào)通路的抑制作用顯著限制了腎纖維化［26］。多項(xiàng)研究證明在db/db小鼠模型中，腎臟中的TGFβ1蛋白表達(dá)過量［5，27］。依帕司他可以下調(diào)db/db小鼠腎臟組織中FN、TGFβ1和III型膠原的表達(dá)，對(duì)DN具有保護(hù)作用［28］。在我們的研究中，MR409通過抑制TGFβ1和FN蛋白的表達(dá)，從而阻礙DN腎臟纖維化的發(fā)展。同時(shí)，氧化應(yīng)激與TGFβ1之間存在相互聯(lián)系，TGFβ1能促進(jìn)ROS的產(chǎn)生并抑制抗氧化酶，導(dǎo)致氧化還原失衡；反之，ROS也能激活TGFβ1［29］。NADPH氧化酶還促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子TGFβ、TNFα等的激活［30］。當(dāng)ROS產(chǎn)生和清除之間的平衡被破壞時(shí)，它們會(huì)引起氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致組織損傷［31］。糖尿病患者的高血糖狀態(tài)通常會(huì)誘發(fā)葡萄糖代謝異常，從而產(chǎn)生大量ROS［32］。Nakayama等［33］研究中首次發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶亞基gp91phox和p22phox蛋白表達(dá)的增加與db/db小鼠胰島氧化應(yīng)激增加相關(guān)［33］。糖尿病引起的氧化應(yīng)激可能是糖尿病大鼠腎病發(fā)生的誘因?？诜J薈可通過減少脂質(zhì)改變，減少腎臟氧化應(yīng)激并提供直接的腎臟保護(hù)作用來預(yù)防糖尿病誘發(fā)的腎?。?4］。我們的研究結(jié)果顯示，db/db小鼠腎臟中NADPH氧化酶亞基p22phox和gp91phox表達(dá)增加，活性氧含量也明顯增加，MR409治療后3重指標(biāo)都顯著降低。

綜上所述，GHRHR激動(dòng)劑MR409對(duì)db/db小鼠糖尿病腎病具有良好的治療效應(yīng)，其機(jī)制可能涉及到降低糖尿病引起腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制腎纖維化過程，其確切機(jī)制還需要進(jìn)一步研究進(jìn)行澄清。