基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討紅萸飲治療潰瘍性結(jié)腸炎的分子機制

張馨心 周唯 陸金根 王佳 潘一濱 許言午

摘要 目的：采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對紅萸飲（HYY）治療潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的作用機制進行探討。方法：通過TCMSP平臺和Uniprot數(shù)據(jù)庫對HYY進行活性成分及作用靶點篩選和標準化;在Genecards和在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫中獲取疾病靶點。采用Draw Venny Diagram程序生成藥物活性成分-疾病靶點數(shù)據(jù)集及韋恩圖;String網(wǎng)站生成蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖;Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò);利用R3.6.0軟件進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析。實驗通過DSS建立C57 UC小鼠模型，利用HE染色、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、qPCR檢測來進一步驗證。結(jié)果：共篩選出HYY 4味藥所含50種類藥成分;預(yù)測出110個潛在靶點;其中UC相關(guān)靶點共計3 870個;HYY-疾病共同靶點70個，主要富集于88個生物過程和113條信號通路上。實驗也表明HYY可改善UC模型結(jié)直腸上皮完整性，降低血清IL-6和結(jié)直腸VEGF基因表達。結(jié)論：結(jié)合實驗分析HYY可能通過調(diào)節(jié)CASP3、IL-6、VEGFA等靶點，調(diào)控PI3K-Akt等信號通路，從而調(diào)控細胞凋亡、血管生成，抑制炎性反應(yīng)來達到對UC的治療作用。

關(guān)鍵詞 紅萸飲;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);潰瘍性結(jié)腸炎;炎性反應(yīng);凋亡;血管生成

Mechanism of Hongyu Drink in the Treatment ofUlcerative Colitis Based on Network Pharmacology

ZHANG Xinxin1，ZHOU Wei1，LU Jin′gen1，WANG Jiawen1，PAN Yibin1，XU Yanwu2

（1 Longhua Hospital of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China; 2 College of Basic Medicine of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of the action of Hongyu Drink （HYD） in the treatment on ulcerative colitis （UC） by network pharmacology.Methods：The active ingredients and targets of HHD were screened by TCMSP platform，and the targets′ name of the selected targets were standardized by Uniprot database.The search was performed in Genecards database and online human Mendelian genetic database to obtain disease target points.The Draw Venny Diagram online program was used to generate the pharmaceutically active ingredient-disease target data set and the Venn diagram.Protein-protein interaction network map was generated by using String website; component-target network was constructed by using Cytoscape 3.7.2 software; GO function annotation and KEGG pathway enrichment analysis were performed by R3.6.0 software.The C57 UC mouse model was established by DSS，and HE staining、ELIS、qPCR were used to verify the results of network pharmacology detection.Results：A total of 50 kinds of drug components were included in the 4 herbs of HHY; 110 potential targets were predicted; the total number of UC-related disease targets was 3870; a total of 70 common targets of Pulsatilla chinensis-disease were obtained，and the co-targets were mainly enriched in 88 biological processes and 113 signaling pathways.The experimental results showed that HYDin can improve the colorectal epithelial integrity of UC animal model and reduce the expression of VEGF mRNA in serum IL-6 and colorectal tissues.Conclusion：Combined with experiment，network pharmacology analysis shows that HYDin may regulate the CASP3，IL-6，VEGFA，et al，and PI3K-Akt signaling pathway，et al，which regulates apoptosis，angiogenesis and inhibition of inflammation，achieves a therapeutic effect on ulcerative colitis.Other pathways need our further study.

Keywords Hongyu Decoction; Network pharmacology; Ulcerative colitis; Inflammation; Apoptosis; Angiogenesis

中圖分類號：R285;R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.01.009

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）是一種病因尚不十分清楚的結(jié)腸和直腸慢性非特異性炎癥性疾病。病變部位多位于乙狀結(jié)腸和直腸，也可延伸至降結(jié)腸，甚至整個結(jié)腸。UC病程漫長，常反復(fù)發(fā)作，嚴重影響患者的生命質(zhì)量。2015年世界胃腸組織（World Gastroenterology Organization，WGO）發(fā)布的《炎癥性腸病全球指南》顯示UC在北歐、英國和北美的高患病率已趨于保持穩(wěn)定，而在南歐、亞洲和大多數(shù)發(fā)展中國家，原本較低的患病率正在升高[1]。有研究推測，國內(nèi)UC的患病率為11.6/10萬[2]，且近年呈明顯上升趨勢[3-4]。

中醫(yī)學(xué)無UC的病名，主要根據(jù)疾病各時期不同的臨床表現(xiàn)來命名和治療。紅萸飲是龍華醫(yī)院肛腸科陸金根教授臨床治療UC的常用有效方劑，具有急攻緩補，內(nèi)外兼施，益氣溫陽、清熱排毒的功效，但其具體的作用機制仍不十分清楚。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，深入探討紅萸飲治療UC的分子機制。

1 資料與方法

1.1 資料來源

1.1.1 紅萸飲活性成分及其作用靶點的篩選

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）檢索紅萸飲中大血藤、敗醬草、黃芪、山茱萸4味中藥的化學(xué)成分，并根據(jù)化合物類藥性（Drug-Likeness，DL）大于0.18，口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）大于30%篩選藥物的活性成分及靶點。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫，將已篩選出的靶點名稱進行標準化，建立藥物活性成分靶點數(shù)據(jù)集。

1.1.2 UC疾病相關(guān)基因的檢索

以“Ulcerative colitis”作為關(guān)鍵詞，在Genecards（https：//www.genecards.org/）和在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）（https：//omim.org/）中檢索獲取UC相關(guān)的疾病靶點，建立疾病靶點數(shù)據(jù)集。

1.2 方法

1.2.1 紅萸飲活性成分抗UC疾病蛋白靶點的篩選和可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

1.2.1.1 紅萸飲活性成分抗UC疾病作用靶點的篩選

采用Draw Venny Diagram在線程序（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）將藥物活性成分靶點數(shù)據(jù)集和疾病靶點數(shù)據(jù)集相交獲得藥物活性成分與疾病的共同靶點，此交集集合為藥物活性成分治療UC的可能潛在靶點，生成藥物活性成分抗疾病作用靶點數(shù)據(jù)集。

1.2.1.2 紅萸飲活性成分抗UC疾病作用靶點的可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選出的藥物活性成分抗疾病作用靶點數(shù)據(jù)集、藥物活性成分列表等輸入到Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建紅萸飲活性成分抗UC疾病靶點的可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.2.2 構(gòu)建紅萸飲活性成分抗UC疾病作用靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)核心基因統(tǒng)計

1.2.2.1 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物活性成分抗疾病作用靶點數(shù)據(jù)集提交至String網(wǎng)站（https：//string-db.org/）按minimum required interaction score為medium confidence（0.400）生成PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.2.2 網(wǎng)絡(luò)核心基因的統(tǒng)計分析

根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點間的連接度尋找網(wǎng)絡(luò)的核心基因，進行統(tǒng)計分析，生成網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因連接度統(tǒng)計條圖。

1.2.3 紅萸飲活性成分抗UC疾病作用靶點的功能和通路富集性分析

1.2.3.1 紅萸飲活性成分抗UC疾病作用靶點的功能（Gene Ontology，GO）富集分析

利用R3.6.0軟件，安裝Bioconductor的colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview、ggplot2等程集包，以p value Cutoff=0.05，q value Cutoff=0.05為標準，對活性成分抗疾病作用靶點數(shù)據(jù)進行GO富集分析。

1.2.3.2 紅萸飲活性成分抗UC疾病作用靶點的通路（Pathway）富集分析

利用R3.6.0軟件，安裝Bioconductor的colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview等程集包，以p value Cutoff=0.05，q value Cutoff=0.05為標準，利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome（KEGG）數(shù)據(jù)庫對活性成分抗疾病作用靶點數(shù)據(jù)進行通路富集分析。

經(jīng)上述GO和KEGG分析將成分、靶點及通路的關(guān)聯(lián)度更加數(shù)據(jù)化，以便得出更加明確的結(jié)果，進一步說明活性成分靶蛋白和信號通路在紅萸飲治療潰瘍性結(jié)腸炎中的作用。

2 結(jié)果

2.1 紅萸飲活性成分及其作用靶點

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中的檢索、篩選表明，紅萸飲4味中藥中滿足OB>30%，DL>0.18的單體成分共有58種，對應(yīng)499個相關(guān)靶點;去除不同單味藥間重疊活性單體成分計有50種，見表1，對應(yīng)110個相關(guān)靶點，見圖1。

2.2 UC疾病相關(guān)蛋白靶點的獲取

通過Genecards和OMIM數(shù)據(jù)庫進行檢索，刪除檢索結(jié)果中重復(fù)的靶點，獲得UC相關(guān)的疾病靶點共計3 870個。

2.3 紅萸飲活性成分抗UC疾病作用蛋白靶點的篩選和可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

2.3.1 紅萸飲活性成分抗UC疾病作用靶點的篩選

獲得藥物活性成分與疾病的共同靶點計70個，見圖1，生成活性成分抗疾病作用靶點數(shù)據(jù)集。此集合為藥物活性成分治療疾病的潛在靶點。

2.3.2 紅萸飲活性成分抗UC疾病靶點可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

進一步利用Cytoscape建立藥物活性成分和活性成分抗疾病作用靶點數(shù)據(jù)集的相關(guān)聯(lián)系的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。

2.4 紅萸飲活性成分抗UC疾病靶點的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

經(jīng)STRING分析后得到PPI網(wǎng)絡(luò)，共獲得693條相互作用關(guān)系，平均節(jié)點連接數(shù)（Average Node Degree）為19.8，PPI enrichment p-value：<1.0e-16，見圖3;按節(jié)點連接度從大到小為標準篩選網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因統(tǒng)計，見圖4（只顯示前30條）。

2.5 紅萸飲活性成分抗UC作用蛋白靶點的GO和KEGG富集分析

2.5.1 紅萸飲活性成分抗UC作用靶點的功能富集分析

以p value Cutoff=0.05，q value Cutoff=0.05為標準，對活性成分-疾病靶點數(shù)據(jù)進行GO功能富集性分析，共獲得88個統(tǒng)計學(xué)顯著的結(jié)果。這些結(jié)果顯示與核受體活性（Nuclear Receptor Activity）、轉(zhuǎn)錄因子活性，配體直接調(diào)控序列特異性DNA結(jié)合（Transcription Factor Sctivity，Direct Ligand Regulated Sequence-specific DNA Binding）、蛋白質(zhì)異二聚活性（Protein Heterodimerization Activity）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（Ubiquitin-like Protein Ligase Binding）、類固醇激素受體活性（Steroid Hormone Receptor Activity）等功能相關(guān)，見圖5。

2.5.2 紅萸飲活性成分抗UC作用靶點的KEGG分析

以p value Cutoff=0.05，q value Cutoff=0.05為標準，對活性成分抗疾病靶點數(shù)據(jù)進行KEGG通路富集性分析，共獲得113個統(tǒng)計學(xué)顯著的結(jié)果。主要富集在PI3K-Akt信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、人巨細胞病毒感染通路、乙肝病毒通路、前列腺癌通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路上，其中按P值由小到大排列前20條通路的氣泡見圖6。

3 實驗驗證

3.1 實驗材料

3.1.1 實驗動物

C57BL6小鼠（上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可號：SYXK（滬）2015-0020）70只，雌性，體質(zhì)量18～20 g。造模前在復(fù)旦大學(xué)清潔級動物房飼養(yǎng)1周，給予充足食料，自由飲水，每日光照12 h，溫度21～25 ℃，空氣濕度40%～70%。

3.1.2 藥物與試劑

大血藤中藥配方顆粒（廣東一方制藥有限公司，批號：408124K）、敗醬草中藥配方顆粒（廣東一方制藥有限公司，批號：407071K）、黃芪中藥配方顆粒（廣東一方制藥有限公司，批號：407250K）、山萸肉中藥配方顆粒（廣東一方制藥有限公司，批號：405142K）依據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》計算出中藥人鼠等效劑量比例為大血藤：敗醬草：黃芪：山萸肉=5∶10∶10∶4;Dextran Sulfate Sodium Salt（DSS，M.W.36000-50000購于MP Biomedicals LLC，CAS#9011-18-1）;美沙拉秦緩釋顆粒劑（艾迪莎，上海愛的發(fā)制藥有限公司，批號：15237）;RayBioMouse IL-6 ELISA Kit（購于美國RayBiotech公司，批號：ELM-IL6）;TaKaRa SYBRòPremix Ex TaqTM試劑盒（貨號RR420A）。

3.1.3 儀器

Synergy2多功能酶標儀（BioTek公司，美國，型號：Synergy2）、Applied Biosystems 7300 Fast Real-Time PCR System（ABI公司，美國，型號：Stepone）。

3.2 實驗方法

3.2.1 實驗分組與給藥

配置2.5%DSS，小鼠自由飲用10 d。造模后隨機分為6組，每組10只。正常組（Norm）：消毒蒸餾水自由飲用10 d，第11天處死5只;消毒蒸餾水灌胃（10 mL/kg，2次/d）7 d，第18天處死5只。模型組（DSS）：2.5%DSS自由飲用10 d，第11天處死10只?？瞻讓φ战M（DSS+NS）：2.5%DSS自由飲用10 d，消毒蒸餾水灌胃（10 mL/kg，2次/d）7 d，第18天處死10只。陽性藥物對照組（DSS+5ASA）：2.5%DSS自由飲用10 d，美沙拉秦灌胃（0.5 g/kg，2次/d）7 d，第18天處死10只。紅萸飲高劑量組（DSS+HH）：2.5%DSS自由飲用10 d，紅萸飲灌胃（3.0 g/kg，2次/d）7 d，第18天處死10只。紅萸飲低劑量組（DSS+HL）：2.5%DSS自由飲用10 d，紅萸飲灌胃（1.5 g/kg，2次/d）7 d，第18天處死10只。

3.2.2 HE染色檢測小鼠結(jié)直腸組織病理學(xué)改變

給藥7 d后處死所有小鼠，在小鼠直腸及結(jié)腸處各取1段長約1 cm的結(jié)腸組織，4%甲醛溶液固定，制備石蠟切片，行HE染色，10×10倍光鏡下觀察腸黏膜損傷情況，按參考文獻方法進行病理組織學(xué)評[5-7]，具體見表2。

3.2.3 ELISA檢測血清IL-6水平

給藥7 d后處死所有小鼠，摘眼球取血，取血清-80 ℃凍存，待測IL-6水平。測定時每份樣本取50 μL血清，2倍稀釋后取100 μL稀釋液，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，酶標儀450 nm處檢測樣本吸光值，根據(jù)標準品不同濃度的吸光值繪制標準曲線，再通過樣本吸光值根據(jù)標準曲線算出相應(yīng)的IL-6濃度。

3.2.4 qPCR檢測直腸組織VEGF水平

設(shè)計引物，見表3，采用Trizol法提取各組小鼠直腸組織RNA并行反轉(zhuǎn)錄。取反轉(zhuǎn)錄后的cDNA行q-PCR檢測基因表達。液氮保存組織常規(guī)提取RNA，紫外分光光度計法定量后取10 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。q-PCR條件：95 ℃，30 s;95 ℃，5 s;60 ℃，34 s;40個循環(huán)，10 μL體系上機分析。以VEGF產(chǎn)物量/β-actin產(chǎn)物量的比值為最終結(jié)果。

3.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用IBM SPSS Statistics 21統(tǒng)計軟件。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）進行描述，2組正態(tài)分布計量資料組間比較采用t檢驗，多組正態(tài)分布計量資料組間比較采用單因素方差分析，2組及多組偏態(tài)分布計量資料組間比較采用秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.4 實驗結(jié)果

3.4.1 HE染色檢測小鼠結(jié)直腸組織病理學(xué)改變

在10×10光鏡下觀察，正常組小鼠結(jié)、直腸形態(tài)完整，無明顯異常;模型組小鼠結(jié)腸黏膜間或固有層上皮細胞脫落、炎性細胞浸潤、有潰瘍且面積較大;空白對照組部分有潰瘍，炎性細胞浸潤;各用藥組小鼠結(jié)腸黏膜炎癥明顯改善，黏膜較完整，部分有潰瘍且面積較小，輕微炎性細胞浸潤，見圖8、10。分析病理組織學(xué)評分，見表4、5，與正常組比較，空白對照組和模型組結(jié)、直腸組織病理學(xué)評分顯著提升（P<0.01）;與模型組比較，紅萸飲高劑量組和低劑量組結(jié)、直腸組織病理學(xué)評分顯著降低（P<0.01）;與空白對照組比較，陽性藥物對照組結(jié)、直腸組織病理學(xué)評分降低（P<0.05）;紅萸飲高劑量組、紅萸飲低劑量組與陽性藥物對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖7、9。

3.4.2 ELISA檢測血清IL-6水平

與正常組比較，模型組及空白對照組血清中IL-6表達明顯升高（P<0.01）;與模型組和空白對照組比較，紅萸飲高劑量組、紅萸飲低劑量組和陽性藥物對照組IL-6表達均明顯下降（P<0.01）;紅萸飲高劑量組、紅萸飲低劑量組與陽性藥物對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表6、圖11。

3.4.3 qPCR檢測直腸組織VEGF水平

與正常組比較，模型組及空白對照組結(jié)腸組織中VEGF表達明顯降低（P<0.01）;與模型組和空白對照組比較，紅萸飲高劑量組、紅萸飲低劑量組和陽性藥物對照組VEGF表達均上升（P<0.05）;紅萸飲高劑量組、紅萸飲低劑量組與陽性藥物對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表7、圖12。

3.4.4 結(jié)論

中藥紅萸飲對DSS誘導(dǎo)的UC小鼠結(jié)直腸上皮完整性及IL-6和VEGF指標有明顯調(diào)節(jié)作用。與對照組比較，模型組結(jié)直腸病理分數(shù)明顯降低，血清IL-6含量明顯升高，VEGF mRNA表達上調(diào)。中藥紅萸飲能夠降低DSS誘導(dǎo)的UC小鼠結(jié)直腸病理分數(shù)，血清IL-6含量，抑制VEGF mRNA的表達。這從一定程度上證實了我們在中藥-成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)中連接度最高的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)檢測。

4 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是整合了系統(tǒng)生物學(xué)、藥物化學(xué)、藥理學(xué)和生物化學(xué)的一門新興學(xué)科[8]。其借助已研究出的大量生物學(xué)信息，構(gòu)建藥物分子-作用靶點-疾病的生物網(wǎng)絡(luò)，分析三者之間可能的關(guān)聯(lián)，從而給出了藥物對疾病作用機制的線索，為多靶點藥物的開發(fā)和機制研究提供了依據(jù)[9-10]。中藥作用機制的研究具有有效成分過于復(fù)雜、作用機制不夠明確等特點，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)恰好可以為此類研究提供有力的工具。對復(fù)方中藥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究業(yè)已成為研究中藥分子機制的新策略和新模式。順應(yīng)了中醫(yī)藥現(xiàn)代化的潮流，適應(yīng)了推動中藥復(fù)方深入研究和擴大臨床適應(yīng)證發(fā)展的需要，有力保障了中醫(yī)藥的世界發(fā)展[11]。

龍華醫(yī)院肛腸科陸金根教授經(jīng)歷將近10年的臨床經(jīng)驗總結(jié)，結(jié)合潰瘍性結(jié)腸炎中醫(yī)證候的濕毒內(nèi)蘊、氣血壅滯、脾腎虧虛病機，創(chuàng)立紅萸飲，以清熱解毒、涼血活血，兼職溫補脾腎。方中君藥大血藤具有清熱解毒、活血通絡(luò)的功效，也是治療腸癰的要藥。在TCMSP檢索到的大血藤主要成分中，類藥性最高的前兩位活性成分是β-谷甾醇（Beta-Sitosterol）和谷甾醇（Sitosterol）。谷甾醇是真核生物生物膜的重要組成部分，其中的β-谷甾醇對免疫調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)、疼痛、潰瘍具有較強的抵抗作用。有研究表明，β-谷甾醇具有抵抗大鼠慢性乙酸型與冷應(yīng)激型胃潰瘍的活性，并具有抵抗多種胃潰瘍模型的胃黏膜保護效果[12]，這與潰瘍性結(jié)腸炎的病理表現(xiàn)的治療有一定的相似關(guān)聯(lián)性。同時這兩位活性成分在方中敗醬草和山茱萸中均有較高的表達。敗醬草為方中臣藥，與紅藤合用，加強清熱解毒，活血排膿的作用。在TCMSP檢索到的敗醬草的主要活性成分中，蒙花苷（Linarin）、槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Kaempferol）含量較高。研究表明蒙花苷作為黃酮類化合物不僅具有抗炎作用，而且還具有血管保護的作用，可以減少炎性反應(yīng)遞質(zhì)IL-6、TNF-α等的產(chǎn)生，并可以通過PI3K-Akt信號通路而發(fā)揮其作用[13-14]。槲皮素是多羥基黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多方面生物活性[15-17]。研究表明，槲皮素可以抑制細胞中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯(lián)激活，對LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞RAW264.7炎性反應(yīng)具有保護作用[18]。也有研究顯示槲皮素和山柰酚對腸道炎性反應(yīng)有抑制作用[19]，此外槲皮素和山柰酚也是方中佐使藥黃芪的主要活性成分。以上結(jié)果均從另一個角度證實了本研究預(yù)測結(jié)果的可靠性，也無疑為深入探討紅萸飲抗UC有效單體成分及其機制的研究提供了重要指導(dǎo)依據(jù)。

在中藥-成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)中連接度最高的前6位靶點為CASP3，IL-6，VEGFA，EGFR，MAPK8和MYC。CASP3是一種蛋白剪切酶，屬于凋亡家族的重要成員，在細胞凋亡機制網(wǎng)絡(luò)中居中心地位，是致使凋亡發(fā)生的關(guān)鍵。它一旦被激活，即可發(fā)生下游的級聯(lián)反應(yīng)，從而發(fā)生凋亡，不可逆轉(zhuǎn)，因而CASP3也被稱為“死亡蛋白酶”[20]。IL-6是白細胞介素家族的一員，也是重要的炎性反應(yīng)遞質(zhì)，可以結(jié)合其受體以激活其一系列的炎性反應(yīng)。在由死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑中，炎性反應(yīng)遞質(zhì)IL-6可以激活CASP8，從而進一步介導(dǎo)CASP3的活化最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[21]。研究表明，在細胞內(nèi)介導(dǎo)凋亡及炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的通路中，CASP3的升高與腸道炎性反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)[22]。也有研究表明IL-6與炎性反應(yīng)、腸道炎性反應(yīng)以及潰瘍性結(jié)腸炎的關(guān)系密切[23]，IL-6作為黏膜固有層產(chǎn)生的一種在炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的細胞因子，可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及多種細胞的增殖和分化。IL-6和其受體相結(jié)合可以激活JAK產(chǎn)生磷酸化，并進一步特異地激活STAT3發(fā)生磷酸化轉(zhuǎn)移入核，從而誘導(dǎo)STAT3異?；罨瘜?dǎo)致炎性反應(yīng)的發(fā)生;也可以調(diào)節(jié)STAT3下游基因如VEGF的表達，在細胞凋亡的調(diào)控等過程中發(fā)揮重要作用[24]。VEGFA是PDGF/VEGF生長因子家族的成員。它可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞的增殖，促進細胞遷移，抑制凋亡并誘導(dǎo)血管通透性。有研究顯示VEGF在活動性UC炎性組織中表達增強可以加速血管和內(nèi)皮細胞的增殖以及細胞代謝，可引起血小板大量激活，血管收縮、微血栓形成等，影響腸黏膜微循環(huán)，加重腸黏膜缺氧損傷和導(dǎo)致病情的惡化[25]。而EGFR本身具有酪氨酸激酶活性，一旦與表皮生長因子（EGF）組合可啟動細胞核內(nèi)的有關(guān)基因，從而促進細胞分裂增殖。在紅萸飲自由度較高的生物學(xué)功能中，EGFR和泛素樣蛋白連接酶結(jié)合功能有密切的關(guān)聯(lián)，EGFR和VEGFA也同蛋白質(zhì)異二聚化活性功能密切。臨床上潰瘍性結(jié)腸炎也表現(xiàn)有黏膜及黏膜下層的損傷[26]，而結(jié)直腸黏膜的不典型增生也被認為與潰結(jié)最嚴重并發(fā)癥結(jié)腸癌的發(fā)生密切相關(guān)[27]，這也進一步印證了VEGFA和EGFR與潰瘍性結(jié)腸炎病理的密切關(guān)聯(lián)。我們在實驗驗證中也證明，紅萸飲可以調(diào)節(jié)c57 UC模型小鼠結(jié)腸組織中VEGF mRNA水平的降低，也進一步證實了VEGF的關(guān)鍵性。MAPK8是促有絲分裂原活化蛋白激酶家族（MAPKs）的重要成員，MYC為原癌基因，二者均是PI3K-Akt信號通路上的重要組成因子，二者共同作用發(fā)揮該通路在細胞凋亡和炎性反應(yīng)上的重要作用[28]。因此，紅萸飲可能主要是通過影響CASP3、IL-6、VEGFA、EGFR、MAPK8和MYC等靶點發(fā)揮對潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用的。

從通路富集分析結(jié)果可知，在該治療過程中主要涉及通路可能是PI3K-Akt信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、人巨細胞病毒感染通路、乙肝病毒通路、前列腺癌通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路等。PI3K/Akt信號通路參與細胞的分化、增殖、凋亡及血管生成等病理生理過程，是目前研究細胞凋亡信號調(diào)控通路之一。在中藥-成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)中自由度最高的前6位靶點中，EGFR、VEGFA、MYC也均是上述兩條通路上的關(guān)鍵因子，其中IL-6也作為PI3K通路上的一個重要的外源性細胞因子而存在，同樣也可以激活細胞衰老信號通路和TNF炎性反應(yīng)通路從而發(fā)生一系列的反應(yīng)[29];此外也有研究證實PI3K信號通過與樹突狀細胞表面的CD80/CD86相互作用，可以調(diào)節(jié)IL-6的分泌[30]。我們通過實驗驗證紅萸飲確對c57 UC小鼠模型血清水平的IL-6有抑制作用，進一步證實了IL-6在紅萸飲治療UC疾病中的關(guān)鍵性。由此我們可以發(fā)現(xiàn)，紅萸飲可能是通過調(diào)控細胞凋亡、血管生成和抑制炎性反應(yīng)來達到對潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法與技術(shù)，挖掘到紅萸飲中50種類藥性成分及110個潛在靶點，潰瘍性結(jié)腸炎疾病相關(guān)靶點3 870個，其中紅萸飲活性成分抗UC作用靶點70個。通過對這些靶點進行GO生物過程及KEGG信號通路的富集性分析，預(yù)測紅萸飲可能是通過調(diào)節(jié)CASP3，IL-6，VEGFA，EGFR，MAPK8，MYC等靶點，調(diào)控PI3K-Akt信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、人巨細胞病毒感染通路、乙肝病毒通路、前列腺癌通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路等，從而通過調(diào)控細胞凋亡、血管生成和抑制炎性反應(yīng)來達到對潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用。由于各種平臺數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)及相應(yīng)分析算法和軟件功能的限制，得出的其他結(jié)論還有待實驗研究的進一步證實。

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（2020-02-24收稿 責任編輯：楊覺雄）

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年基金項目（81202696）;上海中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新培養(yǎng)專項（Y201920）

作者簡介：張馨心（1993.11—），女，醫(yī)學(xué)碩士，規(guī)培醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥治療肛腸疾病的研究，E-mail：agathazkitazawa@163.com

通信作者：潘一濱（1975.11—），女，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥治療肛腸疾病的研究，E-mail：panyibin29@163.com

;許言午（1974.04—），男，理學(xué)博士，副教授，研究方向：中藥藥理及其機制，E-mail：xyw551268@sina.com