腺苷-3’, 5’-環(huán)磷酸-氧蒽酮希夫堿的合成及其與LC3B的綁定結合

周超群，湯石鵬，錢亮亮，甄政安，程如梅

溫州醫(yī)科大學 眼視光學院（生物醫(yī)學工程學院） 納米生物材料研究所，浙江 溫州 325027

正確的蛋白折疊形態(tài)是維持細胞與組織穩(wěn)定生化過程的基礎[1]?；蛲蛔?、應激以及不良的翻譯后修飾常常導致蛋白錯誤折疊[2]。錯誤折疊蛋白的堆積易引發(fā)一系列疾病，例如阿爾茨海默病、亨廷頓病、白內障等[3]。最近，科學家嘗試利用自噬標志物微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）作為靶標，設計引導型藥物分子，識別并誘導致病的錯誤折疊蛋白定位到自噬體膜上，利用自噬降解相關致病蛋白，保留結構相近的功能性蛋白，達到治療目的，取得了理想的結果[4]。

本研究將氧蒽酮與腺苷-3’，5’-環(huán)磷酸反應，得到腺苷-3’，5’-環(huán)磷酸-氧蒽酮希夫堿（S1），研究其與自噬標志物LC3B的作用，得到二者的結合模式和穩(wěn)定常數(shù)，從分子水平上揭示如何通過LC3B的作用來開發(fā)誘導自噬的潛在藥物。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 氧蒽酮、腺苷-3’，5’-環(huán)磷酸、三乙胺、磷酸系PBS緩沖溶液、乙醇，均由國藥集團上海試劑公司提供。重組人LC3B蛋白（ab103506）購自艾博抗（上海）貿易有限公司。LC3B溶液使用時新鮮配制。所有溶液均用去離子水配制。

1.2 實驗儀器 紫外可見分光光度計（Lamda 35，美國Perkin Elmer公司），熒光光譜儀（AB-series 2 luminescence spectrometer，日本Hitachi High-Technologies公司），元素分析儀（Vario EL III型，德國Elmentar公司）。

1.3 S1的合成 將0.1961 g（1 mmol）氧蒽酮溶解于20 mL無水乙醇中，加入0.3292 g（1 mmol）腺苷-3’，5’-環(huán)磷酸和0.3 mL冰醋酸，加熱回流450 min，冷到室溫，過濾，收集淺黃色沉淀，分別用水、乙醇、無水乙醚洗滌多次。真空干燥。產率：73%。元素分析：計算值C22H18N5O7P，C 53.34%，H 3.66%，N 14.14%，O 22.61%；測試值：C 53.32%，H 3.86%，N 14.11%，O 22.63%。

1.4 光譜測試 所有測試均在pH 7.4的PBS緩沖溶液中進行，使用時將LC3B新鮮配成濃度為1× 10-4mol/L工作溶液；測試前將LC3B溶液和S1溶液混合后放置160 s，再進行紫外-可見光譜或者熒光光譜測定。反應動力學測定，將LC3B溶液和S1溶液調成所需要的濃度，混合后，間隔一定時間測定 352 nm附近的紫外-可見光譜變化。

2 結果

2.1 LC3B與S1作用的動力學 圖1為濃度 2.0×10-5mol/L的S1與LC3B作用160 s后的紫外-可見光譜圖。由圖1可見，S1有三個典型的譜峰，分別在239、260、341 nm處。位于大約270 nm處的一個弱而寬的峰，歸屬于LC3B芳基氨基酸殘基的弱的n-π*吸收峰。將濃度相同的S1和LC3B溶液混合，每隔一段時間對體系進行掃描，所得的紫外-可見光譜圖見圖2。從圖可知，在剛開始時S1的紫外-可見光譜處于最上端，加入LC3B后吸光度下降。在160 s之內，隨時間的推移，光譜逐步從341 nm紅移，最后穩(wěn)定在350 nm，吸收強度緩慢下降。

圖1 S1和LC3B相互作用的紫外-可見光譜圖

圖2 S1和LC3B隨時間變化的紫外-可見光譜圖（S1和LC3B濃度均為1.0× 10-5 mol/L）

由一級反應動力學方程和朗伯比爾定律[5]，得

式中A0、A分別為S1全部處于自由狀態(tài)下的吸光度和S1與LC3B完全結合后的吸光度（這里取波長為352 nm處的吸光度），At為時刻t時的吸光度，k是反應速率常數(shù)。通過ln(A-A0)對t作圖，可以得到S1與LC3B結合后的反應速率常數(shù)（見圖3、表1）。

表1 LC3B與S1不同比例的反應動力學參數(shù)

圖3 不同[LC3B]/[S1]比例的反應動力學關系圖

2.2 LC3B與S1作用的熱力學研究 圖4顯示在239 nm 激發(fā)下，LC3B在278 nm處有一個很寬的熒光峰，而S1在315 nm發(fā)出較強的熒光，覆蓋了大部分的LC3B譜峰。S1熒光峰隨著LC3B濃度變化（見圖5）的測定結果表明隨著LC3B濃度的增大，S1在315 nm處的熒光峰并沒有成比例提高，反而呈現(xiàn)出下降趨勢。

圖4 S1和LC3B溶液的熒光光譜

圖5 LC3B對S1的熒光滴定圖

從分子相互碰撞能量轉移的角度研究，當熒光體與猝滅劑由于熱運動發(fā)生碰撞時，可引起熒光體的熒光猝滅。這種碰撞猝滅服從Stern-Volmer方 程[6]：

其中F0是自由的S1的熒光強度，F(xiàn)是加入LC3B后的熒光強度，C為LC3B的濃度，Ksv為Stern-Volmer熒光猝滅常數(shù)。從圖6和表2看，S1和LC3B作用符合Stern-Volmer方程。在這樣的情況下，碰撞分子形成復合物的結合常數(shù)K和位點數(shù)n與熒光強度存在以下關系：

圖6 不同溫度下的Stern-Volmer線性圖

綜合Stern-Volmer方程關系，得到表2的Stern-Volmer方程和分子復合物參數(shù)。

表2 LC3B滴定S1的熒光特征參數(shù)

由表2所得到的S1和LC3B結合常數(shù)K可以進一步計算出S1和LC3B結合的熱力學參數(shù)ΔH、ΔS和ΔG：

式中ΔG、ΔH、ΔS分別為吉布斯自由能、焓變及熵變。其結果列于表3。

表3 S1結合到LC3B上的熱力學參數(shù)

3 討論

藥物分子與蛋白質分子的相互作用包括靜電力、氫鍵、疏水作用力和范德華力。不同類別的作用力將會影響藥物分子與蛋白質結合、藥物代謝、轉運等過程。為此，本研究從分子動力學和熱力學角度去探討與自噬相關的LC3B靶向化合物的作用模式。由圖1紫外-可見光譜可知，S1在239和260 nm處顯示出兩處典型的共軛環(huán)π-π*躍遷峰，290 nm的寬的肩峰為雜環(huán)的n-π*吸收峰，而希夫堿的C=N強烈的n-π*則出現(xiàn)在341 nm處。LC3B只顯示很弱的芳基氨基酸殘基的n-π*吸收峰。通過時間變化觀察LC3B與S1的變化過程，發(fā)現(xiàn)隨著時間的增加S1的C=N吸收峰下降，并逐步紅移，最后平衡在352 nm。說明S1與LC3B作用有一個緩慢的滯后期，時間為 4 min，希夫堿就與LC3B發(fā)生了強烈的作用。且當S1作用于LC3B時，LC3B在反映蛋白質螺旋結構的210 nm處吸光度有所下降，顯示出S1有嵌插進入LC3B主鏈的情況，螺旋結構稍微變松散[7]。改變S1和LC3B濃度比，可以發(fā)現(xiàn)所得的反應速率常數(shù)基 本維持不變，符合準一級反應和藥物的定比轉運規(guī)律[8]。

熒光光譜表明隨著LC3B的加入，S1位于315 nm的熒光發(fā)射峰緩慢下降，而該峰與S1分子中的C=N雙鍵和幾乎共平面的氧蒽酮三環(huán)共軛結構相關[9]， 表明S1和LC3B的相互作用的確發(fā)生在希夫堿的碳氮雙鍵上，與紫外-可見光譜的結果一致。S1和LC3B作用符合Stern-Volmer方程，隨著溫度的升高，斜率下降，表明溫度的升高，分子運動增強，并沒有引起熒光猝滅的增強，體系不是動態(tài)猝滅，為靜態(tài)猝滅，二者形成了復合物。且在不同實驗溫度下，Stern-Volmer方程具有良好的線性關系，說明復合物只有一種結合模式。通過方程（3）計算得到S1和LC3B的結合位點數(shù)為1。熱力學結果表明，吉布斯自由能ΔG＜0，S1和LC3B的結合為一個自發(fā)的過程。而研究[10]表明，當ΔH＜0、ΔS＞0，藥物分子與蛋白質之間主要是疏水作用，當ΔH＜0、ΔS＜0時為典型的氫鍵和范德華力結合，而當ΔH接近0、ΔS＞0或者當ΔH＜0，忽略ΔS的情況下，主要為靜電作用。結合前述光譜研究和表3，可以發(fā)現(xiàn)S1和LC3B的作用力主要為靜電作用，這種靜電力，影響了C=N上的電子共軛，從而導致熒光猝滅。

綜上所述，本研究合成得到了一種具有LC3B結合綁定功能的腺苷-3’，5’-環(huán)磷酸-氧蒽酮希夫堿，其與LC3B的結合滿足準一級動力學方程和藥物分子的定比轉運規(guī)律。分子熱力學研究表明二者的結合為靜電作用的結果，S1與LC3B以一種復合物的結合模式存在，結合位點數(shù)為1。