高效液相色譜-柱后光化學(xué)衍生法測定變性淀粉中黃曲霉毒素含量的研究

楊 娟

上海工微所科技有限公司，上海 200233

黃曲霉毒素(aflatoxins，AFT)是一種天然毒素，在很多食品中普遍存在，它毒性大，致癌性強(qiáng)，對人類健康危害極大[1]。目前常見的黃曲霉毒素有G2、G1、B2和B1。由于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在食物加工過程中不易被破壞，如不慎食用，對人體傷害極大，為了保障食品安全，我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2017《食品國家安全標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》[2]中規(guī)定了黃曲霉毒素B1的最高限量，但未列出B2、G1和G2的限量要求，因此有必要建立一種快速簡便、穩(wěn)定可靠的檢測黃曲霉毒素含量的方法，為食品中黃曲霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

目前檢測黃曲霉毒素的方法很多，如液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，液相色譜-柱前柱后衍生法，酶聯(lián)免疫法，薄層色譜法等[3]，其中高效液相法/熒光檢測是較為常見的一種檢測方法，然而由于熒光檢測器對黃曲霉毒素具有選擇性，即對AFTB1和AFTG1的檢測靈敏度較低，所以需要通過柱前或柱后衍生增強(qiáng)其熒光性，提高檢測靈敏度[4]。而高效液相色譜-光化學(xué)衍生法是在高效液相色譜儀上連接光化學(xué)衍生器，利用環(huán)狀化合物在紫外光照射下能產(chǎn)生熒光這一特性[5]，實(shí)現(xiàn)了對黃曲霉毒素的在線衍生和檢測，大大增強(qiáng)黃曲霉B1和G1的熒光強(qiáng)度，有效地提高了檢測效率[6]。

本試驗(yàn)采用高效液相色譜-光化學(xué)柱后衍生法檢測變性淀粉中黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1含量。變性淀粉使用乙腈-水溶液(84∶16，v/v)提取，提取液經(jīng)免疫親和柱或多功能凈化柱凈化處理，用HPLC光化學(xué)衍生-熒光檢測器檢測樣品中黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1含量，快速可靠。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：市售羥丙基二淀粉磷酸酯。

美國Beacon黃曲霉毒素總量免疫親和柱(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；MycoSep 226多功能凈化柱(Romer國際貿(mào)易(北京)有限公司)；黃曲霉標(biāo)準(zhǔn)品(G1：1.00 μg/mL；G2：0.300 μg/mL；B1：1.00 μg/mL；B2：0.300 μg/mL;上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；甲醇，乙腈(色譜純，DIKMA)；氯化鈉，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，氯化鉀(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；吐溫-20，分析純(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀配熒光檢測器(U3000，賽默飛世爾科技公司)，柱后衍生裝置(SSIAllChrom Derivatization Unit柱后光衍生系統(tǒng)FCR-1，美國科學(xué)系統(tǒng)公司)，電子天平(MS204TS，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，超聲波清洗器(KQ-100，昆山市超聲儀器有限公司)，離心機(jī)(TDL-5A，上海安亭科學(xué)儀器廠)，固相萃取儀(Supelco SPE)，漩渦混勻器(IKA VORTEX 3，德國IKA公司)，隔膜真空泵(LH-95D，臨海市永昊真空設(shè)備有限公司)，EFTT-DC12 防腐氮吹儀(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)，超純水機(jī)(RiOs Essential默克化工技術(shù)(上海)有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18；Analytical 4.6×250 mm 5-Micron.

流動相：乙腈∶甲醇∶水=10∶30∶60(v/v)；

流速：1.0 mL/min；柱溫:40 ℃；進(jìn)樣量：75.0 μL

熒光檢測器檢測波長：激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm；

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用乙腈將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋100倍，至黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1濃度分別為3.00 μg/L、10.0 μg/L、3.00 μg/L和10.0 μg/L，再將儲備液逐步稀釋，即得標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，見表1。

表1 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度

1.3.3樣品處理

提?。悍Q取變性淀粉樣品5.00 g于50 mL離心管中，加入20.0 mL乙腈-水溶液(84∶16，v/v)提取，震蕩搖勻。超聲20 min，4 000 r/min離心5 min，過濾，備用。

免疫親和柱凈化：移取4.00 mL提取液，加入46 mL 1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，混勻，將免疫親和柱連接上樣器，將上述混合液轉(zhuǎn)移至上樣器中，使液滴以2 mL/min速度下滴，試樣液滴完后用20 mL水淋洗親和柱，待水滴完后，抽干親和柱，棄去淋洗液，再用2 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于離心管中。在50 ℃下氮吹至近干，冷卻后用0.40 mL流動相復(fù)溶，0.45 μm濾膜過濾，待測。

MycoSep 226多功能凈化柱凈化：移取提取液置多功能凈化柱凈化，取凈化液4.00 mL于離心管中。在50 ℃下氮吹至近干，冷卻后用0.40 mL流動相復(fù)溶，0.45 μm濾膜過濾，待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC檢測色譜圖

AFTG2、AFTG1、AFTB2和AFTB1標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖見圖1。由圖1可知，AFTG2、AFTG1、AFTB2和AFTB1均達(dá)到了很好的基線分離，目標(biāo)峰未出現(xiàn)變形、拖尾等現(xiàn)象，出峰時間分別在10.0 min、12.0 min、14.3 min和17.5 min。由表2可知，在0.075 0 μg/L～10.0 μg/L，AFTG1和AFTB1具有良好的線性關(guān)系。在0.022 5 μg/L～3.00 μg/L，AFTG2和AFTB2具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.999 3～0.999 7之間。

表2 黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.2 檢出限

以3倍信噪比作為儀器檢出限，得出黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1的儀器檢出限依次為0.022 5 μg/L、0.075 0 μg/L、0.022 5 μg/L和0.075 0 μg/L，方法檢出限為為0.010 0 μg/kg、0.030 0 μg/kg、0.010 0 μg/kg和0.030 0 μg/kg。

2.3 回收率

對變性淀粉樣品進(jìn)行3個不同水平加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，每個加標(biāo)水平重復(fù)六次，按照1.3.3方法進(jìn)行提取、凈化檢測，結(jié)果如表3所示。四種黃曲霉毒素在不同水平加標(biāo)中，其平均回收率為96%～104%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1%～3%之間，說明該方法能較好地檢測樣品中黃曲霉毒素含量，且重復(fù)性較好。

表3 黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1的加標(biāo)回收率(n=6)

2.4 與高效液相色譜-柱前衍生方法的比較

食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》GB 5009.22—2016中[3]第二法(高效液相色譜-三氟乙酸柱前衍生法)和第三法(高效液相色譜-柱后光化學(xué)衍生法)是較為常見的兩種檢測方法。高效液相色譜-三氟乙酸柱前衍生法是基于使AFTB1和AFTG1的熒光性增強(qiáng)，解決了黃曲霉毒素B1和G1因靈敏度低而達(dá)不到痕量檢測要求的問題[7]。

圖2是高效液相色譜-三氟乙酸柱前衍生法所得的色譜圖。由圖可知，柱前衍生法的檢測時間為35 min，而柱后光化學(xué)衍生的檢測時間為25 min，提高了檢測效率。同時減少了三氟乙酸、正己烷等有害試劑的使用。兩種方法色譜圖均能達(dá)到較好的分離，且回收率較好。

圖2 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液柱前衍生色譜圖

2.5 免疫親和柱與多功能凈化柱的比較

黃曲霉毒素常用的凈化方式有免疫親和柱和多功能凈化柱[8]。本試驗(yàn)比較了免疫親和柱及MycoSep 226多功能凈化柱對測定變性淀粉中黃曲霉G2、G1、B2、B1的凈化效果。選擇變性淀粉作為樣品并進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，采用上述兩種凈化柱分別凈化，得到的樣品色譜圖如圖3所示。

由圖3B可見，經(jīng)過免疫親和柱凈化的樣品，基本可以消除雜質(zhì)對黃曲霉毒素的干擾問題。兩種凈化柱測定樣品中黃曲霉毒素B1的含量分別為0.063 8 μg/kg和0.065 8 μg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.18%，說明兩種凈化柱得出的數(shù)據(jù)沒有顯著差異，均能用于檢測變性淀粉中黃曲霉毒素時的凈化。然而，采用MycoSep 226多功能凈化柱凈化，在目標(biāo)峰前面出現(xiàn)大量雜峰，而免疫親和柱能夠特異性的吸附樣品中的黃曲霉毒素，使其與雜質(zhì)分離，大量雜質(zhì)被淋洗除去，因此，相對來說免疫親和柱凈化效果更好，檢測靈敏度更高。總體而言，免疫親和柱凈化去除機(jī)制干擾能力較強(qiáng)，凈化效果好；而多功能凈化柱操作簡單，價(jià)格便宜[7]。

(A：MycoSep 226多功能凈化柱樣品；B：免疫親和柱樣品；C：MycoSep 226多功能凈化柱樣品加標(biāo)；D：免疫親和柱樣品加標(biāo))圖3 不同凈化柱對變性淀粉中黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1凈化效果的比較

3 結(jié)論

本方法采用高效液相色譜-光化學(xué)衍生法測定變性淀粉中黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1含量，試驗(yàn)通過改變流動相比例，樣品凈化方法以及柱前衍生法和柱后光化學(xué)衍生法的方法進(jìn)行對比。結(jié)果表明，與國標(biāo)GB 5009.22—2016相比，采用本實(shí)驗(yàn)的流動相比例(乙腈∶甲醇∶水=10∶30∶60，v/v)縮短了儀器檢測時間，且分離度較好。多功能凈化柱和免疫親和柱均能用于黃曲霉毒素的凈化，兩者測定結(jié)果無顯著差異，相對于柱前衍生，柱后光化學(xué)衍生法能很大程度上節(jié)省儀器檢測時間和檢測成本，且能減少化學(xué)試劑對檢測人員的傷害。因此，采用乙腈-甲醇-水作為流動相，多功能凈化柱或免疫親和柱凈化，柱后光化學(xué)衍生，能有效檢測變性淀粉樣品中黃曲霉毒素G2、G1、B2和B1的含量，且該方法簡便，快速，檢測成本較低，對檢測人員傷害較小。