原料乳加工過(guò)程中嗜冷菌研究進(jìn)展

張 峰，張雅婷，張虹玉，賽乃瓦爾·艾合坦木，夏永軍，艾連中，熊智強(qiáng)

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品微生物工程研究中心，上海 200093

國(guó)際乳業(yè)聯(lián)合會(huì)提出，7 ℃以下能生長(zhǎng)的細(xì)菌為低溫菌，而20 ℃以下能夠繁殖的細(xì)菌為嗜冷菌[1]。嗜冷菌在原料乳低溫貯藏、加工運(yùn)輸過(guò)程中廣泛存在。原料乳作為奶粉、成品奶和奶酪等乳制品生產(chǎn)的基本原料，其在生產(chǎn)和加工中的質(zhì)量問(wèn)題尤為突出。原料乳污染最常發(fā)生在灌裝和低溫儲(chǔ)存過(guò)程中，而機(jī)器上冷凝水和灌裝機(jī)不清潔也易造成牛奶污染[2]。原料乳中假單胞菌等嗜冷菌產(chǎn)生的耐熱蛋白酶和脂肪酶[3]，會(huì)水解牛奶中的乳清蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白和甘油三脂，導(dǎo)致牛奶品質(zhì)顯著下降。本文針對(duì)嗜冷菌及胞外酶的檢測(cè)和影響機(jī)制展開(kāi)綜述，為原料乳中嗜冷菌及胞外產(chǎn)物的控制提供理論依據(jù)。

1 原料乳加工期間常見(jiàn)嗜冷菌

由于奶牛乳房、擠奶設(shè)備和擠奶室環(huán)境存在微生物[4]，原料乳極易受到嗜冷菌等微生物的污染(表1)。雷鳴等[5]通過(guò)16S rRNA高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)原料乳中嗜冷菌以黃桿菌屬、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬和嗜冷桿菌屬為主，其中假單胞菌屬是危害最大的嗜冷菌。原料乳在加工時(shí)同樣存在污染，如巴殺奶發(fā)生在灌裝作業(yè)中的污染，以假單胞菌為主[6]。我們課題組采用變性梯度凝膠電泳和高通量測(cè)序分析嬰幼兒配方奶粉生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化和分布，發(fā)現(xiàn)原料乳階段主要的微生物污染為假單胞菌屬，而奶粉產(chǎn)品中主要菌群為乳球菌屬、鏈球菌屬、棲熱菌屬、不動(dòng)桿菌屬和擬桿菌屬[7]。乳清干酪也容易受假單胞菌等嗜冷菌的二次污染，主要是工廠包裝過(guò)程的人工污染[8]。原料乳中主要微生物為假單胞菌，而經(jīng)巴氏殺菌后地衣桿菌的比例顯著增加，其次為乳球菌和鏈球菌。

表1 原料乳加工過(guò)程中常見(jiàn)的微生物污染源

2 嗜冷菌在原料乳加工過(guò)程中的影響

嗜冷菌污染在原料乳加工中普遍存在，危害主要表現(xiàn)為嗜冷菌產(chǎn)生具有耐熱性胞外酶，能水解牛奶中蛋白質(zhì)、脂肪和磷脂等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。特別是牛奶儲(chǔ)藏時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或者高溫殺菌后溫度沒(méi)有及時(shí)降低，嗜冷菌快速生長(zhǎng)并產(chǎn)生大量蛋白酶、脂肪酶和磷脂酶，它們能分解乳制品中的脂肪、蛋白質(zhì)和卵磷脂，導(dǎo)致產(chǎn)品凝結(jié)、分層、產(chǎn)生苦味等不良性狀，嚴(yán)重影響產(chǎn)品貨架期[9]。

2.1 脂肪酶對(duì)原料乳影響

嗜冷菌所產(chǎn)脂肪酶按照家族分為八個(gè)家族I、II(GSDL)、III、IV(HSL)、V、VI、VII和VIII，其最大家族I分為六個(gè)亞家族[10]。脂肪酶屬于水解酶類，作用于羧酸酯的酯鍵，三酰基甘油作為底物水解成脂肪酸，二?；视?，單酰基甘油和甘油，導(dǎo)致腐臭、酸敗或肥皂味[11]。它們大多對(duì)三酰甘油的sn-1和sn-3位置具有特異性，但對(duì)二酰甘油和單酰基甘油的水解速度比三酰甘油快。脂肪酶除水解三?；视屯?，還能夠催化氧化酯化產(chǎn)生酯交換、酸解、醇解及氨解等反應(yīng)[12]。嗜冷菌所產(chǎn)脂肪酶對(duì)包裹脂肪球的脂肪球膜進(jìn)行破壞，使其失去對(duì)脂肪的保護(hù)作用,嚴(yán)重破壞乳制品中的脂肪[13]。假單胞菌、黃桿菌和不動(dòng)桿菌[14]是原料乳中脂肪水解能力較強(qiáng)的嗜冷菌。多數(shù)假單胞菌脂肪酶可抵抗奶制品工業(yè)中的巴氏殺菌和UHT處理。特別是嗜冷菌所產(chǎn)耐熱脂肪酶在130 ℃ 15 s商業(yè)高溫滅菌后仍能保持活性，導(dǎo)致乳脂脂解和酸敗，生成大量游離脂肪酸。

2.2 蛋白酶對(duì)原料乳的影響

耐熱蛋白酶能夠水解a-casein 和β-casein，破壞乳脂肪球和酪蛋白表面結(jié)構(gòu)，引起脂肪與脂肪、脂肪與酪蛋白結(jié)合并聚集，形成小薄片浮于奶上層[15]。嗜冷菌蛋白酶具有高熱穩(wěn)定性和強(qiáng)復(fù)性能力，在高溫處理后，沒(méi)有完全滅活的蛋白酶分子可以重新折疊形成具有空間活動(dòng)的螺旋結(jié)構(gòu)[16]。乳品保藏過(guò)程中蛋白酶會(huì)分解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致乳品感官品質(zhì)和物理環(huán)境化學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)變化，降低乳品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，縮短產(chǎn)品保質(zhì)期。蛋白酶與牛奶中苦味、UHT奶凝膠化密切相關(guān)。由aprX基因編碼的蛋白酶具有非常好的熱穩(wěn)定性。WOODS等[17]發(fā)現(xiàn)aprX-inh-aprDEF-prtAB-lipA構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)錄單位，通過(guò)構(gòu)建突變體和aprX定量分析確定每個(gè)基因的功能。MAIER等[18]研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬有22種aprX-lipA2操縱子，而含prtAB 的I型操縱子結(jié)構(gòu)菌株大部分蛋白水解活性最高。而假單胞中aprX-LipA2基因簇主要以I、II、III和VI類型存在(圖1)，帶有prtAB的I型操縱子(aprXIDEFprtABlipA2)顯示出最強(qiáng)的蛋白水解活性，但目前為止未發(fā)現(xiàn)PrtAB具有活性。具有II型操縱子結(jié)構(gòu) (AprXIDEFlipA2)被認(rèn)為是低酶活菌株。具有III型操縱子(aprXIDEFprtABlipA1A2)，在prtAB的下游有一個(gè)脂肪酶基因(lipA1)，但蛋白水解活性比I型低。具有VI型結(jié)構(gòu)的分離株(aprXIDEF∥prtAB)對(duì)蛋白水解潛力較大，酶活從低到高都存在，而不含aprX-lipA2基因簇的菌株都不具有酶活。

雙斜杠(∥)表示基因簇被分隔圖1 假單胞菌蛋白酶常見(jiàn)的基因類型

2.3 磷脂酶對(duì)原料乳的影響

磷脂在穩(wěn)定乳脂球中起關(guān)鍵作用，磷脂酶降低乳脂球膜的完整性，促進(jìn)天然脂肪酶脂解作用。乳制品的“奶油味”通常由卵磷脂酶活性引起[19]。目前研究最多的是磷脂酶C，它分為溶血和非溶血性，且耐熱性非常好。VITHANAGE等[20]在原料乳中檢測(cè)到假單胞菌屬，芽孢桿菌屬，沙雷氏菌屬，哈夫尼亞屬，不動(dòng)桿菌屬和微細(xì)菌屬中磷脂酶C活性，約25%菌株140 ℃熱處理4 s后還保留50%～75%的活性。KOKA等[21]發(fā)現(xiàn)嗜冷菌產(chǎn)生的磷脂酶能耐受巴氏殺菌和UHT處理，導(dǎo)致牛奶變質(zhì)。因此，在加工過(guò)程中應(yīng)盡可能減少乳制品中殘留的磷脂酶活性。

2.4 毒素對(duì)原料乳的影響

原料乳中毒素主要由芽孢桿菌等嗜冷菌產(chǎn)生，毒素影響原料乳品質(zhì)且潛在危害人體健康。例如，SAMARIJA等[22]從乳品生產(chǎn)鏈中分離的嗜冷菌等菌株本身不具有致病性，但適宜條件下能夠產(chǎn)生腸毒素、外毒素和蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)毒素等致病因子，導(dǎo)致致病性。MIKKOLA等[23]分離出地衣芽孢桿菌毒素，鑒定為地衣素A，是一種環(huán)狀內(nèi)酯七肽，其3-羥基脂肪酸的長(zhǎng)度為13～15個(gè)碳原子。NIEMINEN等[24]從牛乳汁中分離出短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等菌株，其產(chǎn)生的毒素?zé)岱€(wěn)定性好，可溶于甲醇，不屬于蛋白質(zhì)。短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌不但能產(chǎn)生毒素，還能以孢子形式在巴氏殺菌和其它商業(yè)熱處理中存活，而這些微生物的來(lái)源可能是有乳腺炎病史的奶牛，含有這些細(xì)菌的牛奶甚至?xí)?duì)奶粉產(chǎn)品安全性造成威脅。

3 原料乳中嗜冷菌及其胞外酶檢測(cè)

3.1 原料乳中嗜冷菌檢測(cè)

LAW等[25]研究表明當(dāng)原料乳中嗜冷菌數(shù)低于8×106CFU/mL，UHT乳的貨架期約為六個(gè)月；但嗜冷菌數(shù)達(dá)5.0×107CFU/mL時(shí)，UHT乳僅12 d就會(huì)陳化凝膠。為保證乳產(chǎn)品的保質(zhì)期，原料乳中嗜冷菌的檢測(cè)尤其重要。國(guó)標(biāo)SN/T 2552.4-2010中嗜冷菌檢測(cè)方法是將原料乳在6.5 ℃下培養(yǎng)10 d計(jì)數(shù)，該方法能夠準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，但周期過(guò)長(zhǎng)和只能檢測(cè)活菌數(shù)[26]。VILAR等[27]采用ATP生物熒光法對(duì)乳品廠牛奶設(shè)備表面細(xì)菌數(shù)(主要是革蘭氏陰性嗜冷菌)進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果可作為擠奶設(shè)備清潔的依據(jù)。MANZANO等[28]建立兩種基于嗜冷菌的氨基肽酶檢測(cè)方法，可2.5 h內(nèi)對(duì)生奶質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，具有良好相關(guān)性，其間接法靈敏度為2×104CFU/mL，滿足多數(shù)國(guó)家規(guī)定所需檢測(cè)水平，且該方法成本低，需要的設(shè)備在許多實(shí)驗(yàn)室都能滿足(如培養(yǎng)箱、恒溫浴，離心機(jī)和分光光度計(jì)等)。國(guó)內(nèi)外關(guān)于嗜冷菌快速檢測(cè)技術(shù)已有大量報(bào)道(表2)。例如，關(guān)晶巖等[29]采用熒光測(cè)定方法結(jié)果與已知標(biāo)準(zhǔn)菌液濃度復(fù)原乳的嗜冷菌平板計(jì)數(shù)結(jié)果一致，檢出限低于103CFU/mL，線性范圍為103CFU/mL～108CFU/mL，檢測(cè)時(shí)間10 h。XIN等[30]優(yōu)化一種用于檢測(cè)生牛奶中脂解性熒光假單胞菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)檢測(cè)方法，檢測(cè)限為7.4×101CFU/反應(yīng)，可以改善原奶耐熱脂肪酶的影響。

表2 嗜冷菌常見(jiàn)的檢測(cè)技術(shù)

3.2 原料乳中嗜冷菌所產(chǎn)胞外酶檢測(cè)

為確保乳制品保質(zhì)期，乳制品中蛋白酶活力檢測(cè)(表3)至關(guān)重要。馮巖等[39]比較甲醛法、茚三酮法、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)法及鄰苯二甲醛(OPA)法檢測(cè)堿性蛋白酶水解乳清蛋白的情況，結(jié)果表明甲醛法與茚三酮法所測(cè)結(jié)果偏低，不能準(zhǔn)確反映乳清分離蛋白水解液中游離氨基濃度；TNBS法和OPA法的靈敏度都很高，尤其OPA法的顯色劑穩(wěn)定性好，精確度高于TNBS法。ZHANG等[40]使用偶氮酪蛋白法測(cè)定牛奶中假單胞菌蛋白質(zhì)水解活性，結(jié)果表明蛋白水解活性隨黃油濃度增加而增加，黃油能誘導(dǎo)蛋白水解活性，該方法容易受到乳脂的影響。岳喜慶等[41]也使用該法定量牛乳中蛋白酶活性，檢測(cè)限為1 U/mL，具有良好的線性關(guān)系。此外，實(shí)驗(yàn)室常用的GB/T 23527-2009 Folin-酚法，方便簡(jiǎn)單，劉晶等[42]使用該方法測(cè)定原料乳中蛋白酶活力，通過(guò)測(cè)定蛋白酶活力來(lái)對(duì)原料奶品質(zhì)進(jìn)行分級(jí)和評(píng)價(jià)，結(jié)果表明原料乳中嗜冷菌蛋白酶活性與產(chǎn)品長(zhǎng)期保存的品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)。反向液相色譜(RP-HLPC)則更適用于蛋白酶活力精確定量，MERHEB-DINIC等[43]使用RP-HPLC分析粗酶提取物對(duì)酪蛋白組分水解活性，結(jié)果表明其對(duì)酪蛋白組分水解作用較低，但該方法耗時(shí)較長(zhǎng)，樣品較多時(shí)不宜適用。

表3 不同酶活力檢測(cè)方法的比較

原料乳中脂肪酶活力的檢測(cè)同樣重要，BORAN等[44]利用對(duì)硝基苯棕櫚酸酯(p-NPP)為底物，用分光光度法定量菌株脂肪酶活性，脂肪酶活性在10.03～22.16 U/mL。瓊脂擴(kuò)散法適用于細(xì)菌脂肪酶菌株的篩選和粗略測(cè)定，β-奈酚法適用于不含乳脂肪樣品。江慧芳等[45]比較并改進(jìn)了滴定法、對(duì)硝基苯酚法和銅皂法等三種常用脂肪酶活力測(cè)定方法，改進(jìn)的對(duì)硝基苯酚法具有檢測(cè)快捷、結(jié)果穩(wěn)定等特點(diǎn)，對(duì)銅皂法的改進(jìn)具有毒性小、結(jié)果穩(wěn)定和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

4 展望

確保乳制品安全加工和延長(zhǎng)乳制品保質(zhì)期是乳品企業(yè)控制成本關(guān)鍵因素，但乳品污染是加工生產(chǎn)過(guò)程中持續(xù)面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。污染控制措施必須從奶場(chǎng)開(kāi)始，保證奶場(chǎng)周?chē)蛿D奶設(shè)備環(huán)境清潔、奶牛本身健康性，實(shí)時(shí)檢測(cè)奶牛乳腺炎等疾病。更需嚴(yán)格把控原料乳在農(nóng)場(chǎng)到工廠運(yùn)輸過(guò)程的污染，而工廠中好的灌裝和包裝技術(shù)可以限制巴氏殺菌后的污染，在銷售和分銷過(guò)程中控制冷藏溫度可以改善，牛奶中嗜冷菌的數(shù)量。

目前原料乳中嗜冷菌、蛋白酶和脂肪酶的檢測(cè)，普遍缺乏特異性，需建立具有針對(duì)性的方法，要求操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、成本低廉、結(jié)果具有重復(fù)性和精確性，適用于工業(yè)化大生產(chǎn)，這也將是未來(lái)乳品行業(yè)需要重點(diǎn)突破的方向?？傊?，關(guān)于處理原料乳污染檢測(cè)技術(shù)及污染治理問(wèn)題，從奶場(chǎng)到市場(chǎng)對(duì)嗜冷菌的控制還需建立一套完整的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)和信息鏈，實(shí)時(shí)為乳制品安全提供保障。