電芒針對脊髓橫斷大鼠運動功能及損傷區(qū)域GAP-43、SOD、Caspase-3及iNOS表達的影響*

高 瀟，陶嘉隆，王艷麗，齊德玉，董施秋△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江護理高等?？茖W校，黑龍江 哈爾濱 150080)

脊髓橫斷損傷是脊髓損傷(SCI)中最嚴重的分類，多由于脊髓受外力作用導致脊髓完全離斷伴局部水腫及出血，在病理層面表現(xiàn)為脊髓組織完全離斷、損傷區(qū)域內神經元毒性水腫及凋亡壞死，最終出現(xiàn)脊髓物理上的完全損傷，脊髓完全損傷層面以下各種功能完全喪失。隨著我國社會經濟的不斷發(fā)展、人民生活水平的不斷提高、人口老齡化及汽車保有量的不斷提升，墜落、外傷、跌倒及交通意外等因素導致的SCI呈爆發(fā)式增長，特別是脊髓完全損傷的致殘性，其治療方法的基礎研究就顯得意義重大[1-4]。Caspase-3被稱為死亡蛋白酶,是一種特殊的胞漿蛋白酶，Caspase-3活化后可以通過內質網影響Ca2+的調控，致使誘導型一氧化氮合酶(iNOS)活化激活NO信號通路引起氧化應激反應，借此啟動與執(zhí)行神經元的凋亡；超氧化物歧化酶(SOD)可以抑制氧化應激反應，阻斷神經元凋亡的進程[5-6]。GAP-43可以通過改變蛋白的活性促進神經元再生和突觸重構，GAP-43還可以通過骨架蛋白介導軸突的延長達到神經元功能的重構。SCI后導致功能障礙的主要原因是神經元的損傷與凋亡，SCI患者功能障礙的恢復原因主要是軸突的修復和重建，因此GAP-43、SOD、Caspase-3和iNOS在SCI的康復中具有重要的作用[5-7]。綜上所述，應用電芒針干預SCI大鼠模型，觀察損傷區(qū)域Caspase-3、iNOS、GAP-43和SOD表達的變化及BBB評分變化，探討電芒針對SCI大鼠模型運動功能的改善及可能的機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

購自黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心健康雄性SPF級成年SD大鼠36只，體質量(200±20)g，許可證號SCXK(黑)2013-004。飼養(yǎng)環(huán)境嚴格滿足實驗設計，室溫(24±2)℃，濕度50%～70%，亮/暗周期為7:00/19:00(人工)，受試大鼠適應性飼養(yǎng)1周,每籠飼養(yǎng)5只，造模前24 h禁食水，造模后獨籠飼養(yǎng)，墊料24 h更換1次，更換墊料時使用過氧乙酸對籠具噴灑消毒。

1.2 儀器與試劑

電針儀(江蘇華佗，SDZ-2型)；芒針針具(貴州安迪，0.30 mm×25 mm)；酶標儀(美國BIOTEK，ELX-800型)；紫外可見光分光光度計(湖南湘儀，UV752型)；雙垂直蛋白電泳儀(北京六一，DYCZ-24DN型)；凝膠成像分析儀(北京六一，WD-9413B型)；SOD法測定試劑盒(南京建成，A001-1)；Western洗滌液(沈陽萬類，WLA025)；內參抗體(沈陽萬類，WL01845)；Caspase-3抗體(沈陽萬類，WL02117)；GAP-43抗體(沈陽萬類，WL00641)；iNOS抗體(沈陽萬類，WL0992)。

2 實驗方法

2.1 動物分組

將受試大鼠應用隨機數(shù)字列表賦予3位編號進行隨機化處理并應用苦味酸標注，隨機分為假手術組(Sham，12只)、模型組(Model，12只)及電芒針組(Treatment，12只)，造模成功及入組評價標準應用BBB評分。

2.2 模型制備

2.2.1 模型制備前準備 待制備大鼠適應性喂養(yǎng)7 d，模型制備前12 h禁食水，造模前應用10%水合氯醛(劑量為30 mg/kg)腹腔注射完成待造模大鼠的麻醉，待進行模型制備[8-11]。

2.2.2 模型制備方法 將麻醉后的待造模大鼠腹臥固定于操作臺，通過觸及大鼠T7～T9脊椎棘突(T7～T9脊椎棘突比其他棘突明顯增大)確定T8棘突位置，以T8棘突為中心，局部剔除鼠毛后碘伏消毒，應用手術刀沿棘突中線切開皮膚、淺筋膜及肌肉，切口長度大約為4 cm，清理術野并止血，用顯微撐開器鈍性分離并固定椎旁肌肉并暴露T7～T9棘突，后應用眼科剪清除T7～T9棘突并暴露椎板，進一步剃除椎板、椎弓周圍結締組織后暴露T10節(jié)段脊髓，清理術野并止血后取脊髓探針，脊髓探針為去除針尖并對斷端進行鈍化處理的眼針(貴州安迪，0.25 mm×25 mm)，其遠端應用止血鉗彎曲成半圓環(huán)，從一側脊髓腹側穿至對側，輕輕上提脊髓，確定探針下方為椎管且脊髓組織完好后，將兩側端與刀架固定，應用消毒后犀牛刀片制作的5 mm寬微型刀片，將T10節(jié)段脊髓沿刀架方向(刀架方向與試驗臺呈90°角)垂直切斷，清理術野并止血后應用消毒粉、凝膠海綿覆蓋消毒固定橫斷脊髓，逐層縫合術口。

2.2.3 模型制備成功標志 ①模型制備完成后，脊髓探針可從脊髓斷端中滑出且脊髓斷端呈外翻樣;②模型大鼠后肢抖動并迅速痙攣回縮之后呈完全松弛性癱瘓;③BBB評分為0分。

2.2.4 術后護理 造模成功后模型大鼠保暖2 h待其清醒后分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在(23±2)℃，每日更換墊料以保持干燥清潔，每日腹部按摩幫助其排二便，排便后清潔會陰區(qū)以預防壓瘡及腸梗阻。造模成功后模型大鼠每日腹腔注射青霉素20萬單位持續(xù)注射1周以預防感染。

2.3 干預方法

2.3.1 假手術組 該組受試大鼠麻醉后，應用眼科剪清除T7～T9棘突并暴露椎板，進一步剃除椎板、椎弓周圍結締組織后暴露T10節(jié)段脊髓后，應用消毒粉、凝膠海綿覆蓋消毒覆蓋脊髓后逐層縫合術口。分籠正常飼養(yǎng)，不進行其他干預。自由飼養(yǎng)3 d，于7、28 d后完成BBB評定及取材。

2.3.2 模型組 模型制備完成3 d后，每日上午9:00—10:00，固定受試模型大鼠15 min后釋放，1次/d。干預7、28 d上午完成BBB評定及取材。

2.3.3 電芒針組 模型制備完成3 d后，每日上午9:00—10:00，固定受試模型大鼠，捏術口瘢痕上端輕輕提起皮膚，應用芒針針刺夾脊及膀胱經(夾脊定位沿棘突連線兩側旁3 mm處)。單日夾脊刺法：T6脊椎水平45°進針破皮后沿皮下結締組織水平繼續(xù)進針至T10脊椎水平處；膀胱經刺法：T10胸椎下兩旁與肋間交點處45°進針破皮后沿皮下結締組織水平繼續(xù)進針至T6胸椎下兩旁與肋間交點。雙日夾脊刺法：T10脊椎水平45°進針破皮后沿皮下結締組織水平繼續(xù)進針至T6脊椎水平處；膀胱經刺法：T6胸椎下兩旁與肋間交點處45°進針破皮后沿皮下結締組織水平繼續(xù)進針至T10胸椎下兩旁與肋間交點[12-14]。同側兩針接電針儀(江蘇華佗，SDZ-2)，調2 Hz疏密波，強度為(14±2)mV，表現(xiàn)為針周圍肌肉呈輕微抖動狀態(tài)，每次持續(xù)15 min，1次/d。治療后7、28 d上午完成BBB評定及取材。

2.4 受試大鼠BBB評定、取材及指標檢測

受試大鼠BBB評定：脊髓損傷主要以四肢癱瘓和截癱為主要表現(xiàn)，大鼠脊髓損傷截癱模型主要表現(xiàn)為后肢運動功能障礙，BBB評分主要用于評定受試大鼠的后肢運動功能，可評定為22個等級，0分最低，分值越高運動功能越好，28分以上為正常[15-17]。評定在1個0.01 m2光滑的評定板上進行。動物取材方法：各組受試大鼠于干預7、28 d后麻醉，暴露T6～T10脊椎內脊髓組織，以T10節(jié)段為中心截取5 mm損傷區(qū)域內脊髓置入液氮罐內備用。分光光度計評價與分析：損傷區(qū)脊髓組織打碎勻漿，再應用酶標儀進行蛋白定量分析用分光光度計測定OD值，帶入公式計算出SOD的表達情況。Western Blot評價與分析：損傷區(qū)脊髓組織裂解液融化提取蛋白質后進行蛋白質定量測定后，進行電泳轉印封閉，后用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析獲得膠片。

2.5 統(tǒng)計學分析

3 實驗結果

3.1 各組大鼠干預前后BBB評分變化

通過觀察和分析研究所獲得的BBB評分數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，假手術組大鼠不同時間段BBB評分均為28分，為正常大鼠BBB評分。模型組及電芒針組大鼠在造模后BBB評分均為0分。分別干預7 d及28 d后，模型組及電芒針組大鼠BBB評分與假手術組大鼠BBB評分比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。分別干預7、28 d后，模型組與電芒針組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，電芒針組大鼠BBB評分高于模型組大鼠BBB評分。見表1。

表1 各組大鼠干預前后BBB評分變化

3.2 各組大鼠干預后脊髓前角損傷區(qū)域GAP-43和Caspase-3表達值的變化

通過觀察和分析研究所獲得的脊髓前角損傷區(qū)域GAP-43表達值數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)：各組大鼠在分別干預7、28 d后，模型組及電芒針組模型大鼠脊髓前角損傷區(qū)域GAP-43表達數(shù)據(jù)均與假手術組同節(jié)段脊髓前角區(qū)域GAP-43表達數(shù)據(jù)比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。分別干預7、28 d后，模型組與電芒針組模型大鼠之間脊髓前角損傷區(qū)域GAP-43表達數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，電芒針組大鼠脊髓前角損傷區(qū)域GAP-43表達數(shù)據(jù)多于模型組。

通過觀察和分析研究所獲得的脊髓前角損傷區(qū)域Caspase-3數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)：各組大鼠在分別干預7、28 d后，模型組及電芒針組模型大鼠脊髓前角損傷區(qū)域Caspase-3表達數(shù)據(jù)均與假手術組同節(jié)段脊髓前角區(qū)域Caspase-3表達數(shù)據(jù)比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。分別干預7、28 d后，模型組與電芒針組模型大鼠之間脊髓前角損傷區(qū)域Caspase-3差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，電芒針組大鼠脊髓前角損傷區(qū)域Caspase-3表達數(shù)據(jù)少于模型組。見表2、圖1～2。

表2 各組大鼠干預后脊髓前角損傷區(qū)域GAP-43和Caspase-3表達的變化

圖1 各組大鼠干預后脊髓前角損傷區(qū)域GAP-43表達的變化

圖2 各組大鼠干預后脊髓前角損傷區(qū)域Caspase-3表達的變化

3.3 各組大鼠干預后脊髓前角損傷區(qū)域SOD與iNOS表達的變化

通過觀察和分析研究所獲得的脊髓前角損傷區(qū)域SOD表達數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)：各組大鼠在干預7 d時，各組大鼠脊髓前角損傷區(qū)域SOD表達比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，電芒針組SOD表達多于模型組。各組模型大鼠在分別干預28 d時，各組大鼠脊髓前角損傷區(qū)域SOD表達比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，電芒針組SOD表達多于模型組。

通過觀察和分析研究所獲得的脊髓前角損傷區(qū)域iNOS表達數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)：各組大鼠在干預7 d時，各組大鼠脊髓前角損傷區(qū)域iNOS表達比較，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，電芒針組iNOS表達少于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。各組大鼠在分別干預28 d時，各組大鼠脊髓前角損傷區(qū)域iNOS表達比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，電芒針組iNOS表達少于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表3、圖3。

表3 各組大鼠干預后脊髓前角損傷區(qū)域SOD和iNOS表達的變化

圖3 各組大鼠干預后脊髓前角損傷區(qū)域iNOS表達的情況

4 討論

SCI在中醫(yī)學中屬于“痿證”范疇，主要病機是外傷致脊髓、督脈與足太陽膀胱經受損，督脈與足太陽膀胱經經氣運行受阻，氣血不能循督脈與足太陽膀胱經輸布，故所支配的骨、筋、肉和皮失于濡養(yǎng)，出現(xiàn)肢體痿廢失用、肌膚甲錯不仁；本病病位在脊髓，與督脈、足太陽膀胱經密切相關，督脈主一身之陽，為陽脈之海，膀胱經與所有臟腑都有密切聯(lián)系，故治療外傷痿病多選針刺膀胱經與督脈，受試大鼠T6～T10椎管已不完整，所以在治療時以針刺督脈旁夾脊與膀胱經為主[4，18]。芒針為上古九針之一，承于長針，其體長,善于沿經脈透刺，這種刺法取穴少、效力強，筆者應用芒針透刺受試大鼠夾脊與膀胱經，以調督脈與足太陽膀胱經氣血、疏通樞機，力求“疏針力專”、通調經脈氣血之效[14，19]。通過分析本研究所獲得的BBB評分數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，電芒針組受試大鼠BBB評分明顯高于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示應用電芒針干預后，受試模型大鼠運動功能得到明顯的恢復。

橫斷SCI是脊髓受外力作用導致脊髓完全損傷伴局部水腫及出血，主要病理機制為完全損傷區(qū)域內神經元毒性水腫及凋亡壞死；主要癥狀是完全損傷脊髓層面以下各種神經功能完全喪失[3，20]?；赟CI主要病理機制，一些臨床研究認為Caspase-3與iNOS在其中起到了重要的作用，SCI一旦發(fā)生，Caspase-3與iNOS在損傷區(qū)域內會大量活化，活化的iNOS可激活NO通路，加重神經元損傷，進一步導致Caspase-3的活化，活化后的Caspase-3可以通過內質網影響Ca2+的調控，造成損傷區(qū)域內神經元出現(xiàn)Ca2+超載并導致神經元毒性水腫，最終出現(xiàn)不可逆的神經元凋亡[5-7]。通過分析本研究所獲得的脊髓前角損傷區(qū)域Caspase-3與iNOS表達數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，電芒針組受試大鼠脊髓前角損傷區(qū)域 Caspase-3與iNOS表達明顯低于模型組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)提示電芒針干預可以使脊髓前角損傷區(qū)域 Caspase-3與iNOS表達減少，抑制了NO信號通路的同時抑制了氧化應激反應，同樣抑制了損傷區(qū)域內神經元出現(xiàn)Ca2+超載并導致神經元毒性水腫，最終挽救了一些脊髓神經元。這些數(shù)據(jù)結合BBB評分結果提示電芒針組模型大鼠運動功能的恢復可能與脊髓前角損傷區(qū)域 Caspase-3與iNOS表達減少有關。GAP-43是促進神經元再生和突觸重構的重要因子，GAP-43可以通過改變蛋白的活性及促進由骨架蛋白介導軸突延長促進損傷神經元的修復、抑制神經元的凋亡；SOD可以抑制氧化應激反應，阻斷神經元凋亡的進程，二者可以共同抑制損傷的脊髓神經元出現(xiàn)不可逆的壞死[5,7]。通過分析本研究所獲得的脊髓前角損傷區(qū)域GAP-43與SOD表達數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，電芒針組受試大鼠脊髓前角損傷區(qū)域GAP-43與SOD表達明顯高于模型組。這些數(shù)據(jù)提示電芒針干預可以使脊髓前角損傷區(qū)域GAP-43與SOD表達增多，增多的GAP-43與SOD因子可以阻斷氧化應激反應及改變蛋白的活性以抑制神經元的凋亡；可以通過促進由骨架蛋白介導軸突延長而促進損傷神經元的修復。這些數(shù)據(jù)結合BBB評分結果提示電芒針組模型大鼠運動功能的恢復可能與脊髓前角損傷區(qū)域GAP-43與SOD表達增多有關。

綜上所述，電芒針可能通過抑制脊髓前角損傷區(qū)域 Caspase-3與iNOS的表達、促進脊髓前角損傷區(qū)域GAP-43與SOD的表達，抑制脊髓損傷后的氧化應激反應，減少SCI導致的神經元的損傷及凋亡，促進神經元的修復及功能重構，從而改善脊髓橫斷模型大鼠的運動功能、提高BBB評分。