針刀松解法治療髕骨半脫位的相關(guān)分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究*

宋寒冰，李遠(yuǎn)峰，劉家興，王革強(qiáng)，任樹軍，徐英杰,姜益常

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

髕骨半脫位是臨床中比較常見的疾病，隨著對(duì)本病認(rèn)識(shí)的不斷深入，在臨床中的診斷率不斷升高。髕骨半脫位是指髕骨未完全脫離股骨髁間溝并向外移位，導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)疼痛、無力、彈響和脫臼感等一系列臨床癥狀[1]，屬中醫(yī)的“膝痹病”的范疇?？勺杂?，但容易復(fù)發(fā)。若此病遷延不愈或病情較重可加速關(guān)節(jié)退變、髕骨軟化等，目前對(duì)髕骨半脫位的臨床研究和實(shí)驗(yàn)研究仍比較匱乏，治療上以開放性手術(shù)或關(guān)節(jié)鏡治療為主[2]，然而手術(shù)治療具有費(fèi)用高、產(chǎn)生創(chuàng)傷、術(shù)后長期關(guān)節(jié)康復(fù)鍛煉及長時(shí)間臥床休養(yǎng)等缺點(diǎn)，且治療后復(fù)發(fā)率較高[3]。

針刀療法為朱漢章教授于1976年發(fā)明的創(chuàng)新性中醫(yī)外科治療方法，其結(jié)合中醫(yī)針灸理論的“針”和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“手術(shù)刀”為一體，在生理解剖及中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，通過松解人體筋脈、刺激穴位進(jìn)行治療[4]。近些年來，針刀療法被廣泛應(yīng)用于臨床治療內(nèi)、外科疾病，取得了滿意療效。針刀松解法治療髕骨半脫位，其操作特點(diǎn)可以在閉合、微創(chuàng)的條件下，直達(dá)病變部位進(jìn)行切割、松解和剝離，從而達(dá)到治療目的[5]。近些年來，通過黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨傷科醫(yī)療科研團(tuán)隊(duì)的10余年臨床觀察和研究總結(jié)，發(fā)現(xiàn)針刀松解法對(duì)于習(xí)慣性髕骨半脫位的治療效果確切，且不易復(fù)發(fā)[6]。通過觀察發(fā)現(xiàn)，髕骨半脫位可出現(xiàn)關(guān)節(jié)腔內(nèi)的韌帶及骨關(guān)節(jié)關(guān)系的改變，亦可發(fā)生無菌性炎性滲出、關(guān)節(jié)積液等情況。這可能因髕骨與股骨髁反復(fù)撞擊、摩擦產(chǎn)生的軟骨碎片壞死、變性刺激周圍組織而產(chǎn)生，進(jìn)而破壞關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜、軟骨和韌帶等結(jié)構(gòu)，尤其導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變顯著，進(jìn)而更易于發(fā)生膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎、髕骨軟化癥和關(guān)節(jié)變形等繼發(fā)病變[7]。

通過前期臨床觀察研究，針刀松解法對(duì)髕骨半脫位的療效可靠，但是其作用機(jī)制仍限于力學(xué)關(guān)系等宏觀層面的認(rèn)識(shí)。通過多年的臨床病例研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)針刀松解法治療后，髕骨半脫位患者的關(guān)節(jié)炎性積液、疼痛、腫脹和關(guān)節(jié)功能障礙等癥狀得到明顯緩解[8]。所以為了進(jìn)一步的發(fā)現(xiàn)和深入的研究，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討針刀松解法治療髕骨半脫位的分子作用機(jī)制，以驗(yàn)證和尋求髕骨半脫位的病理變化，為針刀松解法治療髕骨半脫位提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

所有參與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部為1月齡的新西蘭大兔(動(dòng)物許可證號(hào)：23002000000209；哈爾濱市呼蘭區(qū)白奎鎮(zhèn)天興養(yǎng)殖場(chǎng))，共48只大兔隨機(jī)分為4組，每組12只大兔(6只雌性、6只雄性)，分別為治療組、陽性對(duì)照組、模型組和假手術(shù)組。

1.2 動(dòng)物造模

選擇健康大兔制作髕骨半脫位模型，具體的操作方法為：麻醉成功后對(duì)大兔兩后腿膝關(guān)節(jié)備皮，消毒后，于膝關(guān)節(jié)正中切開約2 cm，逐層暴露髕股關(guān)節(jié)，沿著髕骨內(nèi)外緣切開關(guān)節(jié)囊，將髕骨推移向外側(cè)，使其處于半脫位狀態(tài)，重疊縫合外側(cè)關(guān)節(jié)囊，屈伸膝關(guān)節(jié)驗(yàn)證髕骨未能復(fù)位，術(shù)畢沖洗縫合。假手術(shù)組只做皮膚切開縫合，不做任何處理。造模成功后常規(guī)飼養(yǎng)，術(shù)后1周對(duì)大兔進(jìn)行定期驅(qū)趕，每日2次，每次30 min。4周后將所有造模大兔行X線檢查髕骨軸位片，進(jìn)一步驗(yàn)證造模成功[9]。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

低溫離心機(jī)(山東博科TD-5M型)；超低溫保存箱(澳柯瑪 DW-86L630)；酶標(biāo)分析儀(美國寶特ELX808型)；孵育箱(北京福意電器有限公司，F(xiàn)YL-YS-150L型)；HBS-4009自動(dòng)洗板機(jī)(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；顯微鏡(北京測(cè)維光電廠)。Ⅱ膠原酶試劑盒(美國sigma公司)；高糖培養(yǎng)液(南京迪兆生物科技有限公司)。

1.4 治療方法

1.4.1 治療組 采用針刀松解法進(jìn)行治療(針刀選擇一次性無菌針刀，江西老宗醫(yī)醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)，型號(hào)0.35 mm×45 mm)，盡量伸直大兔膝關(guān)節(jié)，治療部位常規(guī)消毒鋪單，0.75%利多卡因注射液做局部麻醉，尋找兔股四頭肌外側(cè)頭、髕外側(cè)緣緊張位點(diǎn)為進(jìn)針點(diǎn)快速刺入皮膚，保持刀口線與腱束方向垂直。充分松解痙攣的肌筋膜，手感松動(dòng)后即出刀。針刀松解后并將髕骨向內(nèi)側(cè)推擠3～5下，術(shù)畢敷料纏扎[10]，每周1次，4周為一療程。

1.4.2 陽性對(duì)照組 采用電針進(jìn)行治療(針灸針：華佗牌針灸針,型號(hào)0.35 mm×40 mm,蘇州醫(yī)療用品有限公司；脈沖針灸治療儀：KWD-808I常州英迪電子醫(yī)療器械有限公司)。取穴:主要選鶴頂、犢鼻、陽陵泉及足三里穴位;斜刺進(jìn)針0.5 cm，采用瀉法施針，在施針手感得氣之后留針，電針刺激治療15 min(電流3 mA，刺激頻率50 Hz),隔日1次，4周為一療程。

1.4.3 模型組 常規(guī)造模，不作任何處置，同期飼養(yǎng)[11]。

1.4.4 假手術(shù)組 非模型大兔，同期飼養(yǎng)。

1.5 觀察方法

1.5.1 Lequesne MG評(píng)分 利用改良Lequesne MG評(píng)分表進(jìn)行治療前后局部疼痛刺激反應(yīng)、步態(tài)、關(guān)節(jié)活動(dòng)和關(guān)節(jié)腫脹等行為學(xué)分析， 改良Lequesne MG評(píng)分量表與關(guān)節(jié)的活動(dòng)障礙程度及疼痛程度呈正相關(guān),評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1[12]。

表1 改良Lequesne MG評(píng)分表

1.5.2 髕股指數(shù) 髕股指數(shù)指內(nèi)側(cè)髕股關(guān)節(jié)間隙最短距離與外側(cè)髕股關(guān)節(jié)最短距離之比可用于觀察髕骨半脫位程度，正常髕股指數(shù)為≤1∶1.6[13]。將所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行X線拍片，分析各組髕股指數(shù)的變化。

1.5.3 癥性因子檢測(cè) 將髕骨的軟骨細(xì)胞進(jìn)行分離提取，細(xì)胞培養(yǎng)后，ELISA試劑盒分別檢測(cè)細(xì)胞中IL-1、TNF-α和MMP- 3等相關(guān)炎性因子的治療前后變化；軟骨組織進(jìn)行免疫組化定性分析。應(yīng)用到的試劑有高糖培養(yǎng)液、定時(shí)定量熒光檢測(cè)及免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)[14]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0軟件對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行常規(guī)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均采用K-S檢驗(yàn)對(duì)比，治療評(píng)分結(jié)果進(jìn)行T檢驗(yàn)。多重檢驗(yàn)方法進(jìn)行組間分析，并利用P值檢驗(yàn)是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組改良Lequesne MG評(píng)分比較

各組結(jié)果見表2，治療前，治療組陽性對(duì)照組、模型組與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可見模型制作成功。治療后，陽性對(duì)照組及治療組Lequesne MG評(píng)分與模型組比較均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且治療組評(píng)分最低?？梢婈栃詫?duì)照組(電針治療組)緩解了髕骨半脫位癥狀，而治療組(針刀松解法)更為有效。

表2 各組改良Lequesne MG評(píng)分比較

2.2 各組髕股指數(shù)比較

對(duì)髕股指數(shù)變化分析，可見陽性對(duì)照組及治療組髕骨指數(shù)顯著高于模型組(P<0.05)，治療組較陽性對(duì)照組髕骨指數(shù)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組髕股指數(shù)變化

2.3 各組髕骨軟骨細(xì)胞IL-1、TNF-α及MMP-3含量比較

髕骨半脫位的軟骨損傷程度與炎癥因子的表達(dá)含量變化相關(guān)，通過ELISA法對(duì)髕骨軟骨細(xì)胞中IL-1、TFN-α及MMP-3等炎癥因子的含量觀察，可見治療組較陽性對(duì)照組及模型組IL-1、TFN-α及MMP-3含量均呈顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表4。

表4 各組髕骨軟骨細(xì)胞中IL- 1、TNF-α、MMP-3的含量

2.4 各組軟骨組織MMP-3、TNF-α及IL-1免渡表達(dá)比較

本研究中，軟骨組織免疫組化定性分析顯示MMP-3、TNF-α及IL-1的陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，陽性信號(hào)呈現(xiàn)棕黃色。以IL-1的免疫組化染色為例，結(jié)果如圖1所示，假手術(shù)組MMP-3、TNF-α及IL-1染色呈陰性，胞質(zhì)內(nèi)無明顯棕黃色染色;模型組，MMP-3、TNF-α和IL-1免疫組化染色呈陽性，鏡下呈棕黃色異染顆粒;而治療組和陽性對(duì)照組棕黃色異染顆粒明顯減少，治療組黃色異染顆粒最少。各組陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中治療組降低作用最為顯著。見表5。

注:A.假手術(shù)組;B.模型組;C.治療組;D.陽性對(duì)照組。圖1 炎性因子IL-1免疫組化表達(dá)(100×)

表5 IL-1免疫組化分布對(duì)比 (%)

3 討論

目前，在臨床上髕骨半脫位尚無確效的保守治療方法，開放性手術(shù)治療對(duì)于膝關(guān)節(jié)的副損傷較大，且較易復(fù)發(fā)[15]。近年來，關(guān)節(jié)鏡在臨床關(guān)節(jié)疾病治療中廣泛應(yīng)用[16]，然而在髕骨半脫位的治療上仍然得不到較好的效果，復(fù)發(fā)率較高。康復(fù)鍛煉和外固定治療是現(xiàn)階段臨床中治療髕骨半脫位常見的療法[17]，通過這些方法治療，可以暫時(shí)緩解癥狀，但是無法根本性地解決髕骨內(nèi)、外側(cè)肌力失衡，除去治療后仍會(huì)復(fù)發(fā)。

髕骨半脫位如果遷延不愈或逐漸加重，則會(huì)引起關(guān)節(jié)加速退變、關(guān)節(jié)軟骨損傷和繼發(fā)性滑膜炎等進(jìn)一步功能障礙[18]。其主要癥狀為突發(fā)疼痛、膝關(guān)節(jié)伸膝無力和髕骨彈響,甚至偶發(fā)脫臼感。

針刀療法目前在臨床中應(yīng)用十分廣泛，在中醫(yī)理論基礎(chǔ)、現(xiàn)代解剖理論及生物力學(xué)的指導(dǎo)下，通過臨床實(shí)踐不斷總結(jié)和探索，針刀治療方法不斷改善，其治療適應(yīng)癥亦不斷的拓展[19]。其主要特點(diǎn)是既體現(xiàn)了中醫(yī)治療的“簡(jiǎn)、便、廉、驗(yàn)”，又可有現(xiàn)代醫(yī)學(xué)微創(chuàng)、快速康復(fù)的理念,其治療過程簡(jiǎn)便、安全、微創(chuàng)、不用縫合、低感染風(fēng)險(xiǎn)、不易引起不良反應(yīng)、患者易于接受、治療時(shí)間短、術(shù)后能夠快速恢復(fù)及不影響正常工作和學(xué)習(xí)，治療優(yōu)勢(shì)突顯[20]。

膝關(guān)節(jié)是人體中最大的負(fù)重關(guān)節(jié)，其結(jié)構(gòu)的失穩(wěn)、力學(xué)的平衡破壞是膝關(guān)節(jié)病變的主要原因之一。運(yùn)用針刀松解法治療髕骨半脫位，主要于髕外側(cè)支持帶、股四頭肌外側(cè)頭處進(jìn)行充分松解，剝離黏連組織，平衡髕周肌力，松解緊張痙攣的肌肉及韌帶，恢復(fù)髕骨的生理解剖結(jié)構(gòu)及髕骨周圍的力學(xué)平衡[21]。治療后減輕髕骨對(duì)股骨外髁撞擊而產(chǎn)生的髕軟骨面損傷，預(yù)防關(guān)節(jié)磨損退變而導(dǎo)致的膝關(guān)節(jié)韌帶、滑膜等組織的紊亂,減輕無菌性炎癥、促進(jìn)血液循環(huán)和改善關(guān)節(jié)內(nèi)代謝，使膝關(guān)節(jié)恢復(fù)動(dòng)態(tài)平衡[22]。

髕骨半脫位發(fā)病機(jī)制與平衡關(guān)節(jié)內(nèi)、外不均衡的應(yīng)力對(duì)髕骨及股骨髁軟骨產(chǎn)生壓力及不良摩擦相關(guān)，從而影響了軟骨細(xì)胞的代謝，通過軟骨細(xì)胞的力學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響軟骨細(xì)胞代謝及基因表達(dá)，所產(chǎn)生的炎性因子進(jìn)一步刺激關(guān)節(jié)軟骨及周圍組織，產(chǎn)生疼痛及退變?cè)錾鷮?dǎo)致關(guān)節(jié)內(nèi)系統(tǒng)性惡性循環(huán)[23]。 TNF-α和IL-1與軟骨損傷破壞密切相關(guān)。當(dāng)髕骨半脫位處于發(fā)生、發(fā)展過程中，髕骨軟骨遭到破壞，往往上述TNF-α和IL-1含量升高。已經(jīng)被證實(shí)上述兩種因子的高水平表達(dá)可以抑制軟骨細(xì)胞生長和軟骨細(xì)胞的再生，亦可產(chǎn)生軟骨相關(guān)蛋白變性，減少了軟骨細(xì)胞的合成。其亦可以抑制軟骨細(xì)胞MMPs 酶的水平升高，破壞MMPs 酶的活性，進(jìn)一步促進(jìn)軟骨細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)(如一氧化氮、地諾前列酮等)，最終導(dǎo)致髕骨軟骨加速損傷[24]。通過針刀松解法治療，減輕髕骨軟骨所承受的機(jī)械壓力及摩擦力，促進(jìn)軟骨自我修復(fù)機(jī)制，有效阻斷IL-l 和TNF-α炎性因子的合成，減少對(duì)MMPs酶合成的抑制作用，糾正軟骨細(xì)胞內(nèi)的無菌性炎癥因子水平，促進(jìn)軟骨蛋白生成，促進(jìn)軟骨修復(fù)與再生[25]。

本研究采用針刀松解法對(duì)大鼠髕骨半脫位模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，并對(duì)小針刀療法可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討，驗(yàn)證了針刀松解療法不僅能夠促進(jìn)髕骨的生理解剖結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，亦能夠調(diào)節(jié)IL-1、TNF-α以及MMPs-3的異常表達(dá)，從而對(duì)髕骨半脫位產(chǎn)生治療作用，初步解釋了針刀松解法治療髕骨半脫位的分子作用機(jī)制，并為臨床的治療和推廣提供了可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。