肝素非還原端飽和結(jié)構(gòu)的紫外吸收研究及在肝素寡糖測序中的應(yīng)用

梁群燾，鄒 強(qiáng)，林江慧，劉樹滔，魏 崢

（1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,福州 350108；2.福州大學(xué)化肥催化劑國家工程研究中心糖生化研究所,福州 350002；3.泉州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心,泉州 362000）

肝素（Hep）是一種廣泛使用的抗血栓藥物，是糖胺聚糖（GAGs）家族的一員，由50～200個(gè)重復(fù)的二糖單元構(gòu)成.Hep 二糖是由己糖醛酸（Hex A）與葡萄糖胺（Glc N）以β1-4 糖苷鍵連接而成的線性多聚糖，帶有強(qiáng)負(fù)電荷.

對(duì)Hep 進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析很困難，主要因?yàn)镠ep 具有變化的鏈長、硫酸基團(tuán)和乙?；鶊F(tuán)；并且艾杜糖醛酸和葡萄糖醛酸之間的構(gòu)象會(huì)相互轉(zhuǎn)換［1］.許多先進(jìn)技術(shù)已被用于分離表征聚糖，如紫外光譜［2］、強(qiáng)陰離子交換（SAX）［3］、毛細(xì)管電泳（CE）［4］、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）［5］、尺寸排阻色譜（SE-HPLC）［6］和半制備型多孔性石墨化碳（PGC）色譜［7］等.近年來，隨著質(zhì)譜（MS）快原子轟擊電離（FAB）、電噴霧（ESI）和基質(zhì)輔助激光誘導(dǎo)解離（MALDI）等軟電離技術(shù)的進(jìn)步，MS串聯(lián)低濃度易揮發(fā)性鹽或者無鹽的色譜分離體系，如多孔的石墨化碳色譜（PGC）［8］、親水作用色譜（HILIC）［9］或反向離子對(duì)試劑色譜（IPRP）［10］，已經(jīng)成為Hep/HS 寡糖及其衍生物結(jié)構(gòu)分析的強(qiáng)有力工具.如王仲孚等［11］用在線紫外光色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-UV-ESI-MS/MS2）對(duì)銀杏種子來源的N-糖鏈進(jìn)行了定性定量分析.特別是IPRP-HPLC的運(yùn)用，加入易揮發(fā)的親脂性的離子對(duì)試劑，可顯著提高分析檢測的靈敏度，獲得更多的結(jié)構(gòu)信息［12］，并且在MS分析過程中能減少基團(tuán)的丟失［13］.

用肝素酶裂解Hep 生成的低分子量肝素（LMWHs），如Tinzaparin［14］，由于在酶解過程中糖醛酸片段的非還原端（NRE）會(huì)生成一個(gè)C4－C5不飽和的結(jié)構(gòu)，在UV 232 nm處有紫外吸收，可很容易被檢測到.而用化學(xué)解聚Hep生成的LMWHs，如HNO2裂解法生成的Dalteparin，由于在非還原端不會(huì)形成不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)，沒有發(fā)色團(tuán)，很難用色譜分離UV檢測方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析［15］.對(duì)GAGs寡糖結(jié)構(gòu)的分析可通過還原胺化反應(yīng)，在寡糖的還原端標(biāo)記上疏水的熒光團(tuán)，再結(jié)合RP-HPLC/UPLC串聯(lián)MS方法進(jìn)行分析檢測［16～18］.這種方法常用于分析具有不飽和結(jié)構(gòu)［19］及飽和結(jié)構(gòu)［20］的GAGs二糖.此外，也可以通過放射性同位素標(biāo)記方法分析HNO2降解獲得的肝素寡糖［21，22］.但這些方法都需要繁瑣的樣品前處理過程.

Hep/HS寡糖測序方法主要依靠外切糖苷酶酶解、熒光標(biāo)記或同位素標(biāo)記，隨后用聚丙烯酰胺凝膠電泳、HPLC或LC/CE分離得到寡糖片段［21，23～26］.近年來，也有研究報(bào)道基于多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)［9，27］和離子遷移質(zhì)譜技術(shù)［28］的HS寡糖測序方法.目前，HNO2裂解法結(jié)合HPLC或電泳已運(yùn)用于Hep/HS寡糖的結(jié)構(gòu)測定；但需要用放射性同位素標(biāo)記［21，23，29］.當(dāng)HNO2的pH≤1.5 時(shí)，GlcNS 殘基發(fā)生斷裂；而當(dāng)pH=4.0時(shí)，殘基發(fā)生斷裂.由于對(duì)含的Hep/HS 寡糖缺乏有效的分離檢測方法，且檢測靈敏度低，目前對(duì)其結(jié)構(gòu)分析只局限于二糖.一直以來人們都認(rèn)為非還原端（NRE）飽和結(jié)構(gòu)的肝素寡糖在C4和C5間沒有不飽和雙鍵，所以在紫外區(qū)（UV）232 nm處沒有吸收，這為其結(jié)構(gòu)分析帶來不便.前文［30］結(jié)合HNO2（pH=4.0）裂解法、SE-HPLC 和RPIP-LC/MS-IT-TOF，建立了一種簡單靈敏針對(duì)N-未取代Hep/HS 寡糖結(jié)構(gòu)序列的測定方法.同時(shí)發(fā)現(xiàn)HNO2裂解產(chǎn)物雖然在非還原端C4－C5之間沒有不飽和結(jié)構(gòu)，但在HPLC 系統(tǒng)UV 232 nm處具有顯著的吸光值.這為檢測非還原端飽和結(jié)構(gòu)的肝素寡糖提供了更簡便方法，也為肝素寡糖序列分析提供一種簡便的紫外檢測方法.

為了研究還原端飽和結(jié)構(gòu)的肝素寡糖在UV 232 nm的吸收情況，本文以市售的肝素為原材料，采用部分脫N位硫酸化的方法和HNO2（pH=4.0）裂解法制備了4種飽和結(jié)構(gòu)的肝素二糖，并用LC/MS-ITTOF表征了它們在UV 232 nm的吸收情況.同時(shí)，通過UV 232 nm檢測方法簡化了N-未取代Hep六糖測序方法.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

肝素鈉（Hep-Na，分子量4000～20000，B.R.級(jí)，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；12種肝素標(biāo)準(zhǔn)二糖（結(jié)構(gòu)見表1，英國Idroun 公司）；Amberlite IR-120 H+型強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂（Alfa Aesar 公司）；吡啶、二甲基亞砜和1-甲基-2-吡咯烷酮均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（優(yōu)級(jí)純）和脫硫酸根相關(guān)試劑均購自Sigma Aldrich公司（上海）；透析膜（MWCO：500）購自上海Suolaibao生物技術(shù)公司；亞硝酸鈉（純度99%）、碳酸鈉（純度99%）、硼氫化鈉（純度96%）和硫酸（A.R.級(jí)）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碳酸氫銨（A.R.級(jí)）、甲酸（純度98%）、醋酸（純度99%）、正戊胺（PTA，純度99%）和三氟乙酸（TFA≥99.5%，GC）均購自Sigma-aldrich 公司；乙腈（GC）購自德國Merck KGaA 公司；HPLC有關(guān)溶液均用Milli Q（英國Millipore公司）超純水配制.

Table 1 Structures of the 12 unsaturated heparin disaccharides and the 4 heparin disaccharides with a saturated structure at the non-reducing end

Agilent 1200型尺寸排阻高效液相色譜（SE-HPLC，美國Agilen公司）用于分離制備4種具有飽和結(jié)構(gòu)的肝素二糖.LC/MS-IT-TOF（日本Shimadzu公司）用于分析肝素二糖和寡糖，質(zhì)譜儀配備電噴霧電離（ESI）源，液相色譜配備二元梯度泵（LC-20AD）、自動(dòng)進(jìn)樣器（SIL-20AC）、脫氣器（DGU-20A3R）、光電二極管陣列檢測器（SPD-M20A）、通訊模塊（CBM-20A）和柱溫箱（CTO-20A）.CT02-50SR型恒溫真空冷凍濃縮儀和Christ Alpha 1-4 LD Plus 冷凍干燥機(jī)（德國Christ 公司）.17-5176-01 SuperdexTMPeptide 10/300GL 和SephadexTMG-10（10 mm×400 mm）尺寸排阻色譜柱（SEC）購自瑞典GE Healthcare Life Sciences公司；Eclipse Plus C18色譜柱（3.5 μm，2.1 mm×150 mm）購自美國Agilent公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 含不同亞硫酸基團(tuán)數(shù)目的N-未取代Hep 的制備 參考文獻(xiàn)［31，32］方法制備了4 種N-未取代Hep，分別由不同的二糖組成，將其分別命名為.

最后，將所有制備的Hep 過Amberlite IR-120（H+型）柱，然后用NaOH 滴定，使其全部轉(zhuǎn)化為鈉鹽形式.

1.2.2 飽和結(jié)構(gòu)Hep二糖的制備 HNO2在pH=4.0條件下會(huì)特異裂解N-未取代GlcN，由此可確定Hep鏈上N-未取代基團(tuán)的位置.參考文獻(xiàn)［30］方法，現(xiàn)配pH=4.0 的亞硝酸（0.5 mol/L H2SO4和5.5 mol/L NaNO2的體積比為2∶5），加入干燥的Hep寡糖樣品，常溫下反應(yīng)15 min后，加入1 mol/L Na2CO3調(diào)節(jié)pH至8.0～9.0，終止反應(yīng).裂解產(chǎn)物用0.5 mol/L NaBH4于55 ℃還原8 h；接著用4 mol/L 醋酸調(diào)節(jié)pH 至4.0，然后用氨水調(diào)節(jié)pH 至中性.最后用SephadexTMG-10 柱（10 mm×400 mm）脫鹽，流動(dòng)相為蒸餾水，流速1.3 mL/min.凍干后，進(jìn)一步用SE-HPLC分離純化制備的含飽和結(jié)構(gòu)的Hep二糖.

1.2.3 SE-HPLC 分析 對(duì)制備的4 種非還原端C4－C5 飽和結(jié)構(gòu)的Hep 二糖分別進(jìn)行SE-HPLC 分析，使用SuperdexTMPeptide 10/300 GL 色譜柱于UV 232 nm檢測，進(jìn)樣量10 μL（0.5 μg/μL），流動(dòng)相為0.2 mol/L NH4HCO3，流速0.4 mL/min.收集其中的二糖組分部分，然后采用旋轉(zhuǎn)真空濃縮，進(jìn)行LC/MS-ITTOF表征.

1.2.4 LC/MS-IT-TOF 表征 液相色譜部分使用Eclipse Plus C18分離柱（3.5 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫35 ℃；流動(dòng)相A為H2O，B相為75%乙腈（體積分?jǐn)?shù)），兩相均含有15 mmol/L正戊胺（PTA）離子對(duì)試劑，并用甲酸調(diào)節(jié)pH 為8.8；B 相線性梯度洗脫（10%～100%，2～20 min）；流速0.2 mL/min；肝素標(biāo)樣二糖進(jìn)樣量9 μg（0.9 μg/μL）；光電二極管陣列檢測范圍190～800 nm.

質(zhì)譜檢測選擇負(fù)離子模式；錐孔電壓-3.5 kV；m/z掃描范圍200～1800；氮?dú)饬魉?.5 L/min；曲形脫溶劑管（CDL）溫度為200 ℃；加熱模塊溫度200 ℃；檢測電壓1.7 kV；IT和TOF真空分別保持在1.8×10－2Pa 和1.6×10－4Pa.質(zhì)譜質(zhì)量軸校準(zhǔn)用直接注入標(biāo)準(zhǔn)樣品的方法，標(biāo)準(zhǔn)樣品為0.25 mL/L 三氟乙酸和0.1 g/L NaOH混合物；m/z范圍為150～2100，流速0.2 mL/min，所有的質(zhì)量數(shù)偏差不超過5×10－6.

1.2.5 肝素二糖的紫外吸收特征 采用LC/MS-IT-TOF 系統(tǒng)的光電二極管陣列檢測器分析Hep 二糖的UV吸收情況，掃描范圍190～800 nm.每個(gè)二糖樣品進(jìn)樣3次.UV掃描圖依據(jù)二糖的離子流圖（EIC）和液相色譜圖的保留時(shí)間進(jìn)行提取.UV 206 nm和232 nm的吸收值直接從UV掃描圖中獲得，讀取3次進(jìn)樣的UV值后再求其平均值.

2 結(jié)果與討論

UV 232 nm檢測法是一種檢測肝素酶酶解獲得的Hep二糖和寡糖的常用而簡便的方法，這類二糖和寡糖在非還原端具有不飽和結(jié)構(gòu).而HNO2裂解制備的Hep寡糖在非還原端為飽和結(jié)構(gòu)，在UV 232 nm處缺乏吸收，很難分析其結(jié)構(gòu).然而，已有研究表明，HNO2裂解生成的Hep寡糖，無論是具有飽和或不飽和結(jié)構(gòu)，在HPLC UV 232 nm 都均可被檢測到［28］.因此，進(jìn)一步研究飽和結(jié)構(gòu)Hep 二糖的UV 232 nm吸收情況，結(jié)合HNO2裂解和酶解，將有助于簡化Hep寡糖結(jié)構(gòu)序列的測定.

2.1 SE-HPLC分析非還原端飽和結(jié)構(gòu)的肝素二糖

本文采用多種化學(xué)修飾方法制備了4種N-未取代Hep，二糖組分分析結(jié)果表明（數(shù)據(jù)未顯示），它們的主要二糖（約占總二糖的50%）分別為ΔHexA（2S）-（6S），ΔHexA（2S）-，ΔHexA-6S）和ΔHexA-.用pH=4.0的HNO2裂解這4種N-未取代Hep，可分別得到4種在非還原端具有飽和結(jié)構(gòu)的Hep二糖.HNO2（pH 4.0）能特異地裂解，并將其轉(zhuǎn)化為末端C2，C5脫水的甘露糖（2，5-aMan），再用硼氫化物還原，生成穩(wěn)定的甘露醇（aManR），SE-HPLC結(jié)合MS可分離和表征生成的二糖［30］.本實(shí)驗(yàn)采用SE-HPLC（UV 232 nm）分離HNO2裂解生成的二糖.

SE-HPLC對(duì)二糖樣品的分離是根據(jù)其分子量大小來實(shí)現(xiàn)的，與它們含有的亞硫酸基團(tuán)數(shù)目大致成比例.作為參考標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)4種N-未取代的不飽和標(biāo)準(zhǔn)Hep二糖進(jìn)行了SE-HPLC分析［圖1（E）］，檢測到3 個(gè)主要的吸收峰.含有2 個(gè)亞硫酸基團(tuán)的ΔHexA（2S）-（6S）首先被洗脫，保留時(shí)間（RT）為39.35 min；含1 個(gè)亞硫酸基團(tuán)的同分異構(gòu)體ΔHexA（2S）-和ΔHexA-（6S）同時(shí)被洗脫（RT=41.79 min）；ΔHexA-的洗脫時(shí)間為43.82 min.4種HNO2裂解生成的二糖的SE-HPLC分析譜圖分別見圖1（A）～（D）.如圖1（A）所示，1 個(gè)主峰（組分A，RT=39.75 min）的位置靠近標(biāo)樣ΔHexA-（2S）-（6S），表明它可能含有HexA（2S）-aMan（6S）R，因?yàn)樗鼈兊姆肿恿肯嘟?另2個(gè)主峰，組分B［RT=41.56 min，圖1（B）］和組分C［RT=41.53 min，圖1（C）］，均與含1個(gè)亞硫酸基團(tuán)的同分異構(gòu)體標(biāo)樣二糖的出峰時(shí)間［RT=41.79 min，圖1（E）］相近，表明它們分別為HexA-aMan（6S）R和HexA（2S）-aManR.同樣，圖1（D）中的組分D 可能為HexA-aManR.此外，SE-HPLC 譜圖也表明，HNO2裂解產(chǎn)物雖然沒有不飽和結(jié)構(gòu)，但在HPLC系統(tǒng)UV 232 nm處也有吸收.這與前文［30］研究結(jié)果一致，這為檢測在肝素制藥物中化學(xué)解聚產(chǎn)生的肝素寡糖提供了一種簡單的方法.

Fig.1 SE-HPLC chromatograms of four heparin disaccharides with saturated structures

分別收集圖1（A）～（D）中用水平條表示的組分，進(jìn)一步進(jìn)行RPIP-LC/MS-IT-TOF表征.

2.2 RPIP-LC/MS-IT-TOF分析

RPIP-LC/MS 是微量分析Hep/HS 二糖強(qiáng)有力的工具［33～35］.離子對(duì)試劑和分析物在空間位阻和疏水性方面存在復(fù)雜的相互競爭關(guān)系［36］.前文［30］采用RPIP-LC/MS-IT-TOF分析了飽和結(jié)構(gòu)的Hep二糖和寡糖，本文采用RPIP-LC分離HNO2裂解生成的4種二糖（圖1），并用MS和EIC進(jìn)一步表征（見圖2）.

Fig.2 Characterization by RPIP-LC/MS-IT-TOF with MS(A―D)and EIC(A′―D′)detection for four saturated heparin disaccharides

組分A 的RPIP-LC/MS-IT-TOF 譜圖見圖2（A），離子峰m/z499.0081 對(duì)應(yīng)HexA（2S）-aMan（6S）R的［M-H］-離子（理論分子量500.0136），提取離子流圖（EIC）的出峰時(shí)間（RT）為6.6307 min［圖2（A′）］，表明組分A 是飽和的HexA（2S）-aMan（6S）R.另外2 個(gè)峰（m/z419.0498 和339.0925）的RT 也在6.6307 min，表明HexA（2S）-aMan（6S）R在離子源內(nèi)發(fā)生了亞硫酸基團(tuán)丟失.m/z419.0498 的EIC 圖中在RT 6.0030 min處有1個(gè)小峰，可能是SE-HPLC收集組分時(shí)混入的HexA-aMan（6S）R或HexA（2S）-aManR.

組分B的質(zhì)譜圖［圖2（B）和（B′）］顯示，m/z419.0503的EIC圖的RT=5.9760 min，表明組分B為含1個(gè)亞硫酸基團(tuán)飽和結(jié)構(gòu)的二糖.因?yàn)橹苽浣M分B的起始原料為HexA-（6S）-heparin，并且二糖組分分析結(jié)果表明，組成起始原料的二糖主要為ΔHexA-（6S），因此，可以判斷組分B為HexAaMan（6S）R.另一個(gè)較小的峰（m/z339.0929）的RT=5.9760 min，表明HexA-aMan（6S）R在離子源內(nèi)發(fā)生了亞硫酸基團(tuán)丟失.同樣，組分C的RPIP-LC/MS-IT-TOF譜圖中主峰為m/z419.0506［圖2（C）］，EIC圖中RT=5.8735 min［圖2（C′）］，表明存在HexA-aMan（6S）R的同分異構(gòu)體，結(jié)合組分C 的原始材料及其二糖組分分析可以判斷，組分C 為HexA（2S）-aManR.組分D 的MS 譜圖［圖2（D）］中主峰在m/z339.0927，其EIC圖的RT=5.5069 min［見圖2（D′）］，與分子離子HexA-aManR相對(duì)應(yīng).

總之，通過HNO2裂解方法，采用SE-HPLC和RPIP-LC/MS-IT-TOF制備表征了4種具有不同亞硫酸基團(tuán)的飽和肝素二糖，HexA（2S）-aMan（6S）R，HexA-aMan（6S）R，HexA（2S）-aManR和HexA-aManR，這為研究飽和結(jié)構(gòu)的UV吸收情況提供了純的原材料.

2.3 非還原端飽和結(jié)構(gòu)肝素二糖的UV 232 nm吸收情況

肝素二糖的UV 吸收檢測通過LC/MS 系統(tǒng)光電二極管陣列檢測器在UV 190～800 nm 波段掃描進(jìn)行.4種非還原端飽和結(jié)構(gòu)肝素二糖3次進(jìn)樣的UV譜圖相似（見圖3），表明重現(xiàn)性良好.這4 種二糖具有相似的UV掃描圖，均在197 nm處有最大吸收峰，隨后吸收值逐漸下降至基線（約260 nm處），并且一直延伸到800 nm.由于這4種二糖的檢測濃度不一樣，所以它們的UV 檢測靈敏度也不一樣.另外，由于糖類在UV 206 nm 處具有很強(qiáng)的吸收，故采用UV 232 nm/UV 206 nm 的比值來準(zhǔn)確表征UV 232 nm吸收情況.表2列出了Hep二糖UV 232 nm/UV 206 nm的比值.

Fig.3 UV absorption spectra of HexA(2S)-aMan(6S)R(a),HexA-aMan(6S)R(b),HexA(2S)-aManR(c)and HexA-aManR(d)

作為對(duì)照，采用相同方法分析比較了非還原端不飽和結(jié)構(gòu)的Hep/HS 標(biāo)樣二糖的UV 232 nm 吸收情況.根據(jù)GlcN 位點(diǎn)上基團(tuán)的不同，把不飽和結(jié)構(gòu)的Hep/HS 標(biāo)樣二糖分為3 類，即，GlcNAc和GlcNS（見表2）.除了ΔHexA-GlcNAc，含GlcNAc和GlcNS這2類二糖的UV 232 nm/UV 206 nm比值相似（約為40%～55%），表明這些二糖在UV 232 nm 具有相似的靈敏度.而含的UV 232 nm/UV 206 nm 比值比含GlcNAc 和GlcNS 二糖的1/2 還少，表明含的UV 232 nm 靈敏度比含GlcNAc 和GlcNS的二糖低.

Table 2 UV 232 nm/UV 206 nm values of the unsaturated heparin disaccharides and the saturated heparin disaccharides

4 種飽和二糖的UV 232 nm/UV 206 nm 比值如表2 所示.HexA（2S）-aMan（6S）R的相應(yīng)比值為16.27%，UV 232 nm 的靈敏度約為含GlcNAc 和GlcNS 不飽和二糖的30%～40%.而HexA-aMan（6S）R，HexA（2S）-aManR和HexA-aManR的比值較低，分別約為5.10%，4.50%和4.12%，UV 232 nm的靈敏度約為不飽和二糖的7%～12%.含2個(gè)亞硫酸基團(tuán)的飽和二糖的UV 232 nm靈敏度是含1個(gè)亞硫酸基團(tuán)和無亞硫酸基團(tuán)飽和二糖的3～5倍，表明亞硫酸基團(tuán)的存在可能會(huì)增強(qiáng)UV 232 nm的吸收.

總之，盡管與非還原端不飽和結(jié)構(gòu)的Hep寡糖相比，飽和結(jié)構(gòu)Hep二糖和寡糖對(duì)UV 232 nm的靈敏度較低，但以10倍信噪比（S/N）為參數(shù)仍可被檢測到.結(jié)果表明，HexA-aManR，HexA（2S）-aManR和HexA-aMan（6S）R的檢出限接近，為9 μg，其余寡糖均小于5 μg.這有利于區(qū)分飽和及不飽和產(chǎn)物，減少可能的污染物或有機(jī)洗脫液的影響.

2.4 非還原端飽和結(jié)構(gòu)肝素二糖的UV 232 nm吸收在肝素寡糖測序上的應(yīng)用

前文［30］采用HNO2裂解，SE-HPLC 和RPIP-LC/MS-IT-TOF 分析對(duì)部分脫N-硫酸化肝素衍生的N-未取代肝素dp6s 進(jìn)行了結(jié)構(gòu)測定.理論上講，HNO2裂解產(chǎn)物在非還原端具有飽和結(jié)構(gòu)，因此結(jié)合UV 232 nm吸收值檢測飽和及不飽和結(jié)構(gòu)的肝素寡糖有可能簡化測序方法.

Fig.4 Sequencing of dp6-2b with structure of ΔHexA(2S)-(6S)-HexA(2S)-GlcNS(6S)-HexA(2S)-(6S)

總之，通過簡單的UV 232 nm檢測方法結(jié)合HNO2（pH=4.0）裂解和RPIP-LC/MS-IT-TOF分析，可對(duì)部分脫N-硫酸化肝素衍生的N-未取代肝素dp6進(jìn)行結(jié)構(gòu)序列測序.

3 結(jié) 論

制備了4 種分別含2 個(gè)，1 個(gè)和無亞硫酸基團(tuán)的非還原端飽和結(jié)構(gòu)的Hep 二糖；RPIP-LC/MS-ITTOF分析結(jié)果表明，飽和結(jié)構(gòu)Hep在UV 232 nm處有明顯吸收，強(qiáng)度約為含GlcNAc和GlcNS不飽和結(jié)構(gòu)Hep標(biāo)準(zhǔn)二糖的7%～40%.飽和結(jié)構(gòu)二糖的UV吸收強(qiáng)度可能受到亞硫酸基團(tuán)數(shù)目的影響，這為建立更有效的檢測非還原端飽和結(jié)構(gòu)的肝素寡糖方法提供了可能性.另外，含非還原端不飽和結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)Hep二糖在UV 232 nm處的靈敏度較低，UV 232 nm/UV 206 nm只有含GlcNAc和GlcNS標(biāo)準(zhǔn)Hep二糖的45%～75%，這可能有助于檢測含的寡糖.最后，使用簡單的UV 檢測方法，結(jié)合HNO2（pH=4.0）裂解和RPIP-LC/MS-IT-TOF 分析，簡化了N-未取代dp6 的結(jié)構(gòu)序列測定.實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，本檢測方法的重現(xiàn)性良好、靈敏度高、選擇性好；可以通過替換為HNO2（pH=1.5），將其運(yùn)用于混合組分HS/Hep寡糖中N-硫酸化的結(jié)構(gòu)序列測定.