基于碳量子點過氧化物模擬酶的肌氨酸比色測定

舒 馨，王 迪，袁春玲，覃 秀，王益林

（廣西大學化學化工學院,南寧 530004）

前列腺癌（PCa）是威脅男性健康的常見腫瘤之一，病死率僅次于肺癌［1］.前列腺癌的主要檢測手段是測定血清前列腺特異抗原，這是診斷前列腺癌產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移的重要指標［2］.但近年來發(fā)現(xiàn)這一指標并不完全可靠，也無法準確判別是惡性還是良性腫瘤［3］.肌氨酸（Sarcosine）是甘氨酸的甲基化衍生物，其主要生理功能是促進三磷酸腺苷（ATP）的合成，很少出現(xiàn)在尿液中［4］.Sreekumar等［5］研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者尿液的肌氨酸水平特異性增高，可將其作為前列腺癌診斷的標志物.目前，肌氨酸的檢測方法主要有HPLC/MS［6］、電化學法［7］、熒光法［8］和比色法［9］等.比色法測定肌氨酸的基本原理是肌氨酸在肌氨酸氧化酶（SOX）的作用下，被氧化生成過氧化氫、甲醛和甘氨酸；在過氧化物酶的催化下，生成的過氧化氫進一步氧化3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）使其顯色；通過測定顯色產(chǎn)物在特定波長處的吸光度可間接測定肌氨酸濃度.該方法的選擇性好、靈敏度高，但需同時使用2種天然酶.眾所周知，天然酶的價格昂貴、保存條件苛刻，且其催化活性對環(huán)境敏感.模擬酶因具有成本低、穩(wěn)定性高和易于儲存等優(yōu)點而備受關(guān)注［10］.研究表明，金屬氧化物［11，12］、金屬硫化物［13，14］、貴金屬［15，16］和碳基［17～20］納米材料具有良好的過氧化物模擬酶性能，可替代天然過氧化物酶應(yīng)用于H2O2、葡萄糖和尿酸等的分析測定.與其它納米材料相比，碳基納米材料具有制備簡單、無毒和生物相容性好等優(yōu)點.本課題組［21，22］分別以煙炱和果皮為原料制備了具有過氧化物模擬酶特性的碳量子點（CQDs），并應(yīng)用于葡萄糖和半胱氨酸的測定.本文基于肌氨酸在肌氨酸氧化酶的作用下定量釋放H2O2及CQDs催化H2O2氧化TMB產(chǎn)生顯色反應(yīng)的原理（見Scheme 1），建立了一種以CQDs 為過氧化物模擬酶的肌氨酸比色分析新方法，并將其應(yīng)用于人尿中肌氨酸的測定.

Scheme 1 Mechanism illustration for sarcosine detection

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

H2O2（30%）、尿素（分析純）、HAc（分析純）和NaAc（分析純）（廣東光華科技公司）；肌氨酸氧化酶（≥30 U/mg）、肌氨酸（98%）、尿酸（99%）和3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（上海麥克林生化科技公司）；組氨酸（分析純，國藥集團）；苯丙氨酸（99%）、半胱氨酸（99%）和丙氨酸（99%）（天津光復化學試劑）、蘇氨酸、甘氨酸和抗壞血酸（天津大茂化學試劑廠）；丙酮（分析純，成都科龍化工試劑廠）；超濾管（截留分子量3×104，德國賽多利斯公司）；透析袋（截留分子量8000～14000，北京索萊寶公司）；實驗用水為去離子水.

UV-4802型紫外-可見分光光度計（上海龍尼柯公司）；Nicolet iS5型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR，美國賽默飛世爾公司）；Tecnai G2 F20 S-Twin型透射電子顯微鏡（TEM，美國FEI公司）.

1.2 實驗過程

1.2.1 CQDs的制備 參照文獻［22］方法制備CQDs.將果皮（荔枝皮）洗凈烘干后置于坩堝中，在電爐上碳化，冷卻后磨成碳粉.稱取0.3 g經(jīng)丙酮洗滌并干燥后的碳粉，加入到裝有100 mL 5 mol/L硝酸溶液的圓底燒瓶中，在冷凝和加熱攪拌下，于140 ℃回流12 h.用Na2CO3將冷卻后的黑色回流液pH調(diào)至7.0，然后裝入透析袋中，在去離子水中透析48 h.透析液經(jīng)離心（15000 r/min，20 min）后棄去上層清液，所得固體經(jīng)干燥后準確稱重，然后超聲分散于去離子水中，過0.22 μm 超濾膜以除去大顆粒，得到褐色CQDs溶液，稀釋至1.0 mg/mL，保存?zhèn)溆?

1.2.2 H2O2和肌氨酸的測定 H2O2的測定：向系列2 mL離心管中依次加入200 μL不同濃度的H2O2溶液、200 μL 10.0 mmol/L TMB 溶液和100 μL 1.0 mg/mL CQDs 溶液，混合均勻后，用pH=3.5 的HAc-NaAc 緩沖溶液定容，于40 ℃水浴中反應(yīng)15 min后，測定其吸收光譜，以652 nm處的吸光度值進行定量分析.

肌氨酸的測定：向系列裝有150 μL NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液（pH=7.0）的2 mL 離心管中依次加入100 μL 不同濃度的肌氨酸溶液和50 μL 2.20 mg/mL 的肌氨酸氧化酶，混合均勻后，在37 ℃水浴中孵育30 min.后續(xù)測定步驟與H2O2相同.

2 結(jié)果與討論

2.1 CQDs的結(jié)構(gòu)表征

采用透射電子顯微鏡（TEM）表征了CQDs 的形貌和尺寸分布，通過FTIR 光譜分析其官能團.從圖1（A）可以看出，CQDs 呈球形顆粒，分散性好，沒有團聚.HRTEM 顯示CQDs 晶格間距為0.21 nm，對應(yīng)于石墨的（101）面，表明CQDs 具有石墨烯結(jié)構(gòu)［23］.顆粒尺寸分布比較均勻，介于2.1～4.5 nm 之間，平均粒徑為2.4 nm［圖1（B）］.

Fig.1 TEM image(A)and size distribution(B)of the obtained CQDs

CQDs 的紅外光譜（圖2）中存在多個吸收帶和吸收峰，3434 和1379 cm-1處的吸收峰分別歸屬于—OH 的伸縮振動和平面內(nèi)彎曲振動；1621 cm-1處的吸收峰歸屬于C=O 的伸縮振動；1050 cm-1處的吸收峰歸屬于C－O 和C－O－C 的伸縮振動.這些含氧官能團（羥基、羰基和羧基）的存在使CQDs 具有優(yōu)良的水溶性.

Fig.2 FTIR spectrum of the obtained CQDs

2.2 CQDs催化H2O2氧化TMB的可行性

研究表明，CQDs 的類過氧化物酶催化活性是由于其結(jié)構(gòu)中存在羰基石墨碳［24］.HRTEM 和FTIR分析表明，制得的CQDs 具有該結(jié)構(gòu).為研究CQDs 催化H2O2氧化TMB 的可行性，分別測定了TMB+CQDs，TMB+H2O2和TMB+H2O2+CQDs 3 個溶液體系在相同條件下的吸收光譜.由圖3 可見，TMB 和CQDs 的混合液呈無色，吸收光譜在652 nm 處無特征峰（譜線a），說明CQDs 不能使TMB 發(fā)生顯色反應(yīng)；TMB和H2O2混合后，溶液顯淡藍色，吸收光譜在652 nm處有1個較弱的吸收峰（譜線b），說明H2O2能使TMB 發(fā)生微弱氧化；而TMB，H2O2和CQDs 混合后，溶液呈深藍色，吸收光譜在652 nm 處有1個強吸收峰（譜線c），說明CQDs 的存在可加快H2O2對TMB的氧化.上述實驗表明，所得CQDs具有過氧化物模擬酶催化特性.

Fig.3 Absorption spectra of different reaction systems

Fig.4 Absorption spectra of the reaction systems in the absence(a) and presence(b)of scavengers(thiourea)

CQDs 中sp2碳原子及表面羧基基團在H2O2的還原反應(yīng)中具有重要作用.當CQDs 加入到TMB 和H2O2的反應(yīng)體系中時，TMB吸附于CQDs表面，由于CQDs良好的電子轉(zhuǎn)移能力，TMB氨基上的孤對電子可通過CQDs 轉(zhuǎn)移給H2O2，即CQDs 的催化機理為可以加速電子供體TMB 與電子受體H2O2之間的電子轉(zhuǎn)移，促使H2O2分解產(chǎn)生羥基自由基（·OH）［25］.采用硫脲（TU）作為羥基自由基（·OH）清除劑，進一步研究了CQDs 催化H2O2氧化TMB 顯色的機理［26］.由圖4 可見，沒有硫脲存在時，在CQDs 的催化下，TMB 被H2O2氧化而呈深藍色，光譜在652 nm處有一強吸收峰（譜線a）；硫脲能捕獲·OH，導致被氧化的TMB減少，溶液呈淺藍色，652 nm處的吸收減弱（譜線b）.以上結(jié)果說明，CQDs催化H2O2氧化TMB是通過生成強氧化性·OH中間體的方式實現(xiàn)的.

2.3 測定條件的優(yōu)化

考察了pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間及TMB濃度對信號響應(yīng)的影響.以ΔA/A作為衡量標準［ΔA＝A′-A，式中：A為TMB+H2O2體系的吸光度值；A′為加入CQDs 后即CQDs+TMB+H2O2體系的吸光度值）.由圖5（A）可見，當溶液pH在3.0～3.5范圍內(nèi)時，信號響應(yīng)最強，說明CQDs在該酸度范圍內(nèi)的催化活性最強.因此，選擇在pH=3.5的HAc-NaAc 緩沖溶液中進行氧化顯色.當反應(yīng)溫度較低時，TMB的氧化顯色較慢.由圖5（B）可見，信號響應(yīng)隨溫度的升高而增強，但在35 ℃附近出現(xiàn)了平臺區(qū)，繼續(xù)升溫對信號響應(yīng)的影響逐漸變小，最終選擇40 ℃作為最佳反應(yīng)溫度.隨著反應(yīng)時間的延長，ΔA/A起初不斷增大，反應(yīng)15 min 時出現(xiàn)峰值，隨后發(fā)生下降［圖5（C）］，因此選擇最佳反應(yīng)時間為15 min.TMB濃度的影響如圖5（D）所示，當TMB的濃度大于1.0 mmol/L時，ΔA/A的增大趨勢逐漸變緩，因此實驗選擇TMB的濃度為1.0mmol/L.

Fig.5 Dependence of peroxidase-like activity of CQDs on pH(A),reaction temperature(B),reaction time(C)and TMB concentration(D)

2.4 方法的分析性能

Fig.6 UV-Vis absorption spectra(A,C)and calibration curves(B,D)of various concentrations of H2O2(A,B) and sarcosine(C,D)

CQDs可催化H2O2分解·OH，·OH將無色的TMB氧化為藍色的ox-TMB，生成ox-TMB的量與H2O2濃度有關(guān).在優(yōu)化的實驗條件下，研究了H2O2濃度對吸收光譜的影響.實驗結(jié)果表明（圖6），隨著H2O2濃度的增加，特征吸收峰波長不變，但652 nm處吸收峰的強度逐漸增大［圖6（A）］；在5.0～100 μmol/L濃度范圍內(nèi)，ox-TMB的吸光度與H2O2濃度呈良好的線性關(guān)系［圖6（B）］，線性方程為A=0.004c-0.004（c為H2O2的濃度，μmol/L），相關(guān)系數(shù)R2=0.9959，方法檢出限（3σ/k）為3.0 μmol/L.基于肌氨酸氧化酶催化肌氨酸氧化并定量產(chǎn)生H2O2的原理，進一步建立了測定肌氨酸濃度的分析方法.由圖6（C）可見，ox-TMB的吸光度隨肌氨酸濃度的增加而增大；當肌氨酸濃度在0.5～350 μmol/L濃度范圍內(nèi)，吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系［圖6（D）］，線性方程為A=0.001c+0.023（c為肌氨酸的濃度，μmol/L），相關(guān)系數(shù)R2=0.9934，方法檢出限（3σ/k）為0.3 μmol/L.

表1列出了采用其它方法或材料測定肌氨酸的分析性能，可見本文方法的線性范圍或檢出限優(yōu)于部分文獻.

Table 1 Comparison of detection methods for sarcosine

圖7 示出了在肌氨酸濃度為350 μmol/L，鉀、鈣、鎂、鋅、抗壞血酸、組氨酸、苯丙氨酸、尿素、尿酸、蘇氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸及葡萄糖等潛在干擾物濃度分別為500 μmol/L 的體系中，TMB經(jīng)顯色反應(yīng)后的吸光度值的對比情況.由于肌氨酸氧化酶具有催化專一性，其它物質(zhì)不能被其催化 氧化產(chǎn)生H2O2，TMB 的顯色反應(yīng)難以發(fā)生，吸光度值遠低于肌氨酸體系，表明本文方法的選擇性良好.

Fig.7 Selectivity of sarcosine detection

2.5 尿樣分析

收集2名健康志愿者（本實驗室成員）和1名患病者清晨的尿液，分別取5.0 mL 經(jīng)離心處理（10000 r/min，15 min）后保留上層清液.各取200 μL處理后的尿液樣品，按1.2.2節(jié)方法，加入肌氨酸氧化酶后在37 ℃水浴中孵育30 min；然后，在pH=3.5 的HAc-NaAc 緩沖溶液中顯色并測定.測定結(jié)果列于表2，可見健康者尿樣中的肌氨酸含量分別為0.21 和0.75 μmol/L；前列腺癌患病者尿液中的肌氨酸含量為8.25 μmol/L.后者高于前者數(shù)倍，這與文獻［30］報道的規(guī)律相符，說明前列腺癌患者尿液中肌氨酸濃度特異性高.測定結(jié)果的加標回收率為94%～99%，RSD＜5%，表明方法的準確性好、精密度高，可用于實際樣品的測定.

Table 2 Analysis results of sarcosine in urine samples(n=3)

3 結(jié) 論

以果皮為原料制備了具有過氧化物模擬酶特性的CQDs，基于CQDs 可催化H2O2氧化TMB 產(chǎn)生顯色反應(yīng)及肌氨酸氧化酶催化肌氨酸氧化產(chǎn)生H2O2的原理，建立了一種以CQDs為過氧化物模擬酶的肌氨酸測定方法.該方法具有操作簡單、選擇性好、靈敏度高等特點，可應(yīng)用于實際尿樣中肌氨酸的測定.