基于功能核酸的紙基微流控芯片測定重金屬離子的研究進展

鄭玉竹,曹 慧,徐 斐,葛玉卿,王 震,陳莉敏,武薇薇,朱俊杰,袁 敏?

(1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海食品快速檢測工程技術(shù)研究中心,上海 200093;2.中國科學(xué)院 上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所,上海 200050;3.上海皓信生物科技有限公司,上海 201109)

重金屬對環(huán)境的污染日益嚴(yán)重,引起了嚴(yán)重的生態(tài)和全球公共衛(wèi)生問題[1]。就毒性而言,最具危險性的重金屬是鉛、鎘和汞等。鎘在環(huán)境中的含量一般較低,不會影響人體健康,但會在生物體內(nèi)富集,通過食物鏈對人體造成慢性中毒[2]。鉛是水污染的主要來源之一,特別是在日常飲用水中,鉛離子含量過高會導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病,例如腎、肝和腦等器官疾病[3-4]。汞是一種廣泛存在的環(huán)境毒物和污染物,會引起人體組織的嚴(yán)重改變,對健康產(chǎn)生不利影響[1]。另外,銀離子具有殺菌消毒特性,但若其造成水污染或食品污染,通過食物鏈進入人體后會導(dǎo)致腹瀉、神經(jīng)或器官損傷等疾病[5]。因此,對水環(huán)境中重金屬進行即時檢測是非常有必要的,尤其是在經(jīng)濟較落后地區(qū),水污染可能會更加嚴(yán)重,但很少引起人們的注意。

檢測重金屬離子廣泛使用的方法有原子吸收光譜法(AAS)[6]、原子發(fā)射光譜法(AES)[7]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[8-9]和陽極溶出伏安法(ASV)[10]等。這些檢測方法由于儀器體積大、價格昂貴、樣品制備過程復(fù)雜,不可直接用于即時檢測。上述常規(guī)檢測方法還需要專業(yè)人員進行操作,這對于偏遠、經(jīng)濟較落后地區(qū)來說很難解決。

功能核酸是指具有特定結(jié)構(gòu)和功能的天然或人工核酸序列,其主要篩選方法是通過指數(shù)富集式配體系統(tǒng)進化技術(shù)在體外進行篩選。目前,功能核酸的相關(guān)研究不斷深入,其被制作成生物傳感器,已廣泛應(yīng)用于較多領(lǐng)域。李宸葳等[11]制備了鉛離子功能核酸比色生物傳感器,利用功能核酸特殊的催化性質(zhì)實現(xiàn)了蛋白質(zhì)、金屬離子及小分子等的檢測,進而達到治療的目的。

隨著微型化和集成化的發(fā)展,紙基微流控技術(shù)自2007年問世以來迅速發(fā)展[12],可用于健康診斷、環(huán)境監(jiān)測和食品質(zhì)量分析等諸多領(lǐng)域[12-13],特別是在環(huán)境分析領(lǐng)域顯示出巨大的優(yōu)勢[14]。紙(纖維素纖維)作為微流控平臺的基質(zhì),被稱為紙基微流控芯片(μPADs)。μPADs通常以不同材料的紙為基材,運用噴蠟、噴墨印刷和平板印刷等技術(shù)制作而成。它的主要優(yōu)點基于紙張的纖維結(jié)構(gòu),即允許液體在不使用外部或內(nèi)部泵送系統(tǒng)的情況下自發(fā)流動[15];同時紙張的纖維結(jié)構(gòu)還提供了內(nèi)置的過濾能力,適用于處理復(fù)雜的樣本,如血液。而微流控通道布局可以通過使用商業(yè)蠟打印機很容易地“打印”到紙上,從而形成疏水屏障[16]。此外,紙張基材價格低廉、儲存容易、質(zhì)量輕、運輸方便。這種低成本的μPADs更適用于偏遠、經(jīng)濟較落后地區(qū)以及臨床檢驗。

盡管μPADs已推出10余年,但其作為傳感器用于食品安全領(lǐng)域仍處于初級階段。鑒于此,本工作綜述了近年來應(yīng)用不同類型的μPADs檢測鉛離子(Pb2＋)、鎘離子(Cd2＋)、汞離子(Hg2＋)和銀離子(Ag＋)等重金屬的檢測原理、檢出限和應(yīng)用情況;并對微流控芯片在紙基上應(yīng)用的發(fā)展方向進行展望,希望能對食品或環(huán)境檢測等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供幫助。

1 μPADs檢測重金屬離子

1.1 鉛離子

近年基于功能核酸的重金屬離子傳感器的研究取得了很大進展。使用μPADs檢測鉛離子的功能核酸根據(jù)作用機理主要分為兩類:脫氧核糖核酸(DNA)酶和適體。

1.1.1 DNA酶方法

DNA 酶(也稱催化脫氧核糖核酸)是指通過體外篩選方法獲得的具有高效催化活性和結(jié)構(gòu)鑒定能力的酶。DNA 酶由酶和底物鏈組成,基于DNA 酶的生物傳感器具有多次翻轉(zhuǎn)的特性,可以用于設(shè)計輸出信號放大、熒光背景低的新型探針。但其底物易降解,成本比較高,而且由于DNA 酶的脆弱性,使用時所有溶液都需用焦碳酸二乙酯處理來創(chuàng)建無核糖核酸(RNA)酶的環(huán)境。

FU 等[17]基于DNA 酶及其良好的特異性,將DNA 酶放大傳感技術(shù)與裂解誘導(dǎo)的G-四鏈體形成技術(shù)相結(jié)合,設(shè)計了無標(biāo)記的DNA 酶熒光生物傳感器,用于Pb2＋的放大“開啟”熒光檢測。無標(biāo)記信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制是基于鋅(Ⅱ)原卟啉IX(ZnPPIX)熒光團與G-四鏈體結(jié)合前后的熒光輸出不同,由靶誘導(dǎo)裂解產(chǎn)生和釋放。此外,所有的DNA 酶都可以被釋放以催化新一輪的反應(yīng),利用這一優(yōu)勢,少量的Pb2＋就可以顯著增強熒光強度,因此檢出限大大降低,低至3 nmol·L-1。同時,無標(biāo)記的DNA 酶熒光生物傳感器對干擾離子的選擇性也很強。ZHU等[18]利用GR-5 DNA 酶對Pb2＋固有的特定性和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)來檢測Pb2＋,該方法檢測Pb2＋時在1～500 nmol·L-1內(nèi)有良好的線性關(guān)系,檢出限為0.7 nmol·L-1。YUN 等[19]基于DNA 酶分支結(jié)構(gòu),應(yīng)用氧化石墨烯(GO)新型納米材料設(shè)計出3 種DNA 酶傳感器,同時檢測Cu2＋、Pb2＋和Mg2＋的熒光檢測方法。此方法是通過各條適體標(biāo)記不同的熒光素來檢測不同的金屬離子,將酶鏈(E-DNA)和底物鏈(S-DNA)組成的3個熒光標(biāo)記的DNA 序列退火,形成DNA 酶支鏈結(jié)構(gòu)。該傳感器對Pb2＋進行檢測,檢出限低至0.3 nmol·L-1,同時在1～500 nmol·L-1內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

但上述文獻對Pb2＋的研究均是在溶液中進行的,相對于紙基上的應(yīng)用而言,不夠方便快捷。在未來的研究中可以考慮將其已經(jīng)成熟的原理應(yīng)用到紙基上,借助紙基自身的優(yōu)勢滿足更高需求。

1.1.2 適體方法

適體是一種通過指數(shù)富集過程以及經(jīng)濟高效的配體系統(tǒng)進化合成的單鏈寡核苷酸,可折疊成特定的二級和三級結(jié)構(gòu)。與特定目標(biāo)結(jié)合,它們對不同的靶標(biāo)具有高特異性親和力。這些靶標(biāo)包括相對分子質(zhì)量較小的無機(如金屬離子)/有機分子和相對分子質(zhì)量較大的生物分子(如蛋白質(zhì))。與抗體相比,適體因具有較低的相對分子質(zhì)量、出色的可持續(xù)性,以及易于修飾、無免疫原性等特征,可轉(zhuǎn)化為優(yōu)越的生物傳感元件[20-25]。CHEN 等[26]采用改進的基于靶向誘導(dǎo)釋放鏈的親和層析法,以生物素標(biāo)記的互補寡核苷酸為基礎(chǔ),在鏈霉親和素包被的瓊脂糖珠上結(jié)合單鏈DNA,成功分離了Pb2＋的適體?；赑b2＋誘導(dǎo)配合物釋放熒光標(biāo)記的適體及其相應(yīng)的猝滅標(biāo)記的短互補序列,進一步設(shè)計了Pb2＋生物傳感器,該生物傳感器的動態(tài)線性范圍為100～1 000 nmol·L-1。

而近幾年,有一類富含鳥嘌呤(G)的DNA 序列引起了研究者的關(guān)注。運用此寡核苷酸設(shè)計的生物傳感器通常是基于Pb2＋從富含G 的寡核苷酸序列中形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)的事實。根據(jù)陽離子配位會引起G-四鏈體結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化,HE 等[27]以銥(Ⅲ)配合物作為G-四鏈體的特異性熒光探針,富含G 的DNA(PS2.M)作為Pb2＋的識別單元。在沒有Pb2＋存在的情況下,PS2.M 以單鏈構(gòu)象存在,銥(Ⅲ)探針與單鏈DNA 之間因弱結(jié)合而產(chǎn)生微弱的發(fā)光信號;在Pb2＋存在時,與Pb2＋發(fā)生結(jié)合,單鏈DNA 序列(PS2.M)被誘導(dǎo)成G-四鏈體構(gòu)象,這增強了銥(Ⅲ)探針的發(fā)光強度,其詳細(xì)的原理圖如圖1所示。上述新開發(fā)的無標(biāo)記適體生物傳感器,不需要昂貴的熒光標(biāo)記寡核苷酸,且方法簡單、快速,檢出限低,靈敏度高。

圖1 利用銥(Ⅲ)探針檢測Pb2＋的原理圖Fig.1 Schematic diagram of detection of Pb2＋with iridium(Ⅲ)probe

SUN 等[28]利用文獻[27]的研究原理即無標(biāo)記寡核苷酸的發(fā)光開啟測定法檢測Pb2＋,并作出一些改進。他們采用非常規(guī)原理設(shè)計了懸浮液滴模式μPADs,并經(jīng)加熱孵育和后續(xù)混合兩步過程檢測Pb2＋。此研究有兩大突出亮點:一是選用了印刷雜志常用的美術(shù)紙;二是沒有使用毛細(xì)力驅(qū)動傳統(tǒng)紙質(zhì)芯片上液體的流動,而是以潤濕和重力作為驅(qū)動力,如圖2所示。制備的微流控芯片將水樣保持在離散的容器中,除非該芯片沿預(yù)定通道的方向傾斜,否則水滴不會移動。以此方式,施加到芯片上的液體樣品將作為單獨的液滴處理,并可根據(jù)需要進行儲存、運輸和混合。這樣,芯片的使用者僅需要添加水來執(zhí)行測定,使檢測更加簡單方便。檢測結(jié)果顯示,當(dāng)Pb2＋的濃度為10～100 nmol·L-1時,與發(fā)射強度呈良好的線性關(guān)系,應(yīng)用此方法檢測水樣中的Pb2＋,快速、方便,靈敏度高且成本低。

圖2 芯片上Pb2＋離子檢測的原理圖Fig.2 Schematic diagram of detection of Pb2＋on chip

隨著技術(shù)的進步,KHOSHBIN 等[29]利用F?rster共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)工藝和GO 片材的超熒光猝滅特性設(shè)計了基于紙基的適體傳感器。FRET 過程是指通過分子間的偶極-偶極相互作用,將供體激發(fā)態(tài)能量傳遞到近端基態(tài)受體的過程。試驗將熒光蛋白、有機染料以及無機納米結(jié)構(gòu)的不同材料用作能量供體和受體熒光團,設(shè)計出基于FRET 的適體傳感器。KHOSHBIN 等設(shè)計的紙基適體傳感器的感測機制如圖3所示。

由圖3可見,基于Pb2＋特異性適體從無規(guī)線圈到G-四鏈體結(jié)構(gòu)的構(gòu)象轉(zhuǎn)換,即在紙基平臺上注射Pb2＋會誘導(dǎo)GO 表面釋放特定的適體,從而恢復(fù)熒光發(fā)射。試驗所開發(fā)的紙基適體傳感器可在10 min內(nèi)超靈敏地檢測Pb2＋,檢出限低至0.5 pmol·L-1。另外,研發(fā)的紙基適體傳感器的應(yīng)用范圍也比較廣泛,不僅可應(yīng)用于環(huán)境水體中Pb2＋的檢測,還成功應(yīng)用于牛奶和人血清中Pb2＋的測定。

圖3 紙基適體傳感器與FRET 工藝相結(jié)合檢測Pb2＋的原理圖Fig.3 Schematic diagram of paper-based aptasensor combined with FRET process for Pb2＋detection

1.2 鎘離子

目前,采用比色法檢測金屬離子的研究呈爆炸性增長[30-33]。結(jié)合比色法的μPADs具有成本低、檢測快、易于攜帶及結(jié)果易于分辨等特點,可以滿足大批量、短時間檢測的需求[31]。例如,LóPEZ等[32]開發(fā)了新的紙條,基于顏色變化,實現(xiàn)金納米顆粒對Cd2＋的檢測。在國內(nèi)相關(guān)研究中,WANG等[33]選擇金納米團簇和乙二胺修飾的發(fā)光GO 作為構(gòu)建多色熒光探針的材料,設(shè)計出對Cd2＋特異性響應(yīng)的多色熒光紙質(zhì)傳感器,根據(jù)熒光顏色的改變,實現(xiàn)Cd2＋的可視化檢測,并進一步利用智能手機識別熒光顏色的紅、綠、藍(RGB,三原色)值,發(fā)現(xiàn)Cd2＋的濃度與紅色值與藍色值的比值(R/B 值)呈線性關(guān)系,檢出限為0.1μmol·L-1。

WANG 等[34]通過改良的指數(shù)富集的系統(tǒng)進化方法在體外篩選出了符合檢測Cd2＋條件的適體?；贑d2＋誘導(dǎo)的熒光標(biāo)記的適體從具有猝滅劑的短互補序列的復(fù)合物中釋放這一原理(圖4)設(shè)計了一款生物傳感器,以此來檢測實際環(huán)境中的Cd2＋,檢出限可低至40 nmol·L-1。

圖4 用于檢測Cd2＋的生物傳感器的原理Fig.4 Principle of biosensor for detection of Cd2＋

ZHOU 等[35]首次在三維旋轉(zhuǎn)μPADs平臺上,以ZnSe量子點為熒光響應(yīng)材料,并結(jié)合離子印跡技術(shù)設(shè)計了基于離子印跡聚合物的微流控量子點紙基芯片,其組裝及檢測過程見圖5,該裝置實現(xiàn)了對Cd2＋和Pb2＋的特異性、多重性檢測。該研發(fā)團隊選用毒性小、環(huán)境友好的ZnSe量子點,并通過將ZnSe量子點＠離子印跡聚合物的液相轉(zhuǎn)移到固體玻璃纖維紙上,提高了器件的便攜性。Cd2＋的線性響應(yīng)范圍為1～70μg·L-1,測定下限為0.245μg·L-1(4.98 nmol·L-1);Pb2＋的線性響應(yīng)范圍為1～60μg· L-1,測定下限為0.335μg · L-1(0.81 nmol·L-1)。與文獻[33-34]相比,其對Cd2＋的檢出限更低,并且對Cd2＋和Pb2＋均有良好的特異性;合成的離子印跡聚合物具有特定的識別位點,避免了其他離子的干擾。

圖5 基于離子印跡聚合物的微流控量子點紙基芯片的組裝和檢測過程Fig.5 Assembling and detection process of QDs paper-based microfluidic chip based on ion imprinted polymer

ZHU 等[36]使用由Cd2＋特異性適體(CAP)組成的單標(biāo)記多功能探針(CAP 作為Cd2＋的識別元件和信號報告器),建立了Cd2＋的熒光分析方法。這種策略只涉及適體探針,基于4個鳥嘌呤(G4)的猝滅劑避免了用熒光團/猝滅劑單元雙重標(biāo)記CAP。與其他核酸適體生物傳感器相比,該方法更為簡便、經(jīng)濟,檢出限為2.15 nmol·L-1,遠低于文獻[34]報道的檢出限。

上述技術(shù)具有操作簡便、成本低、分析快速等優(yōu)點,適用于食品中Cd2＋的現(xiàn)場篩查與檢測。而傳感器法因具有方便、自動化程度高、可現(xiàn)場檢測等優(yōu)點,有望能得到更好的發(fā)展[37]。

1.3 汞離子

基于檢測溶液顏色變化的比色法檢測Hg2＋的研究也有很多。如MEELAPSOM 等[38]采用烷基烯酮二聚體噴墨印刷制造μPADs,并摻雜未修飾的銀納米顆粒,由數(shù)字照相機和自制燈箱組成的設(shè)備來檢測顏色強度。隨著Hg2＋含量的增大,在μPADs上觀察到的測試區(qū)域的顏色強度逐漸增加。該設(shè)備的線性范圍為0.05～7 mg·L-1,檢出限為0.001 mg·L-1。通常納米材料的應(yīng)用將線性范圍限制在一個數(shù)量級,但該方法可以在更寬的范圍(3個數(shù)量級)內(nèi)檢測Hg2＋。

目前,已經(jīng)提出了多種基于熒光檢測法的μPADs 方法來檢測痕量重金屬離子[39-44]。ZHANG 等[39]開發(fā)了μPADs,用熒光Cy5 標(biāo)記的單鏈DNA 修飾GO 同時測定食品中不同類型的化學(xué)污染物,其原理如圖6所示。結(jié)果表明,傳感器在目標(biāo)物存在下產(chǎn)生熒光,而在GO 表面則表現(xiàn)出Cy5的熒光猝滅。Hg2＋、Ag＋的檢出限分別為121,47 nmol·L-1。BIAN 等[40]使用金納米團簇試紙對Hg2＋和Pb2＋進行可回收檢測,當(dāng)Hg2＋存在時,觀察到試紙熒光猝滅明顯,而當(dāng)存在Pb2＋時,觀察到熒光增強顯著。其中,Hg2＋和Pb2＋的檢出限分別為5,50 mmol·L-1。QI等[41]基于Cd Te量子點的熒光猝滅,利用離子印跡技術(shù)制備了用于Cu2＋和Hg2＋多重檢測的三維μPADs。結(jié)果表明,該裝置對Cu2＋的線性響應(yīng)范圍為0.11～58.0 mg·L-1,檢出限為0.035 mg·L-1;對Hg2＋的線性響應(yīng)范圍為0.26～34.0 mg·L-1,檢出限為0.056 mg·L-1。

圖6 利用單鏈DNA 功能化GO 傳感器進行多重化學(xué)污染物檢測的紙基微流控裝置原理圖Fig.6 Schematic diagram of the paper-based microfluidic device for detection of multiple chemical pollutants using single-stranded DNA functionalized GO sensor

陳綺嫻等[45]將熒光碳納米材料與紙芯片技術(shù)結(jié)合對Hg2＋進行高特異性檢測。首先通過水熱法制備了對Hg2＋具有高選擇性的碳納米材料,該納米材料對Hg2＋的檢測靈敏度可低至0.6μg·L-1,在0.04 mg·L-1以內(nèi)和0.6～10 mg·L-1內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性響應(yīng)。然后,選擇Whatman 4號濾紙作為打印基底,利用常規(guī)噴墨打印機將所制備的新型碳納米材料固載于紙芯片材料上,構(gòu)建了可用于Hg2＋快速檢測的紙芯片檢測條帶。鄧大慶等[46]提出一種實時熒光定量PCR 技術(shù)與T-Hg2＋-T 特異性相結(jié)合來檢測Hg2＋的方法,利用實時熒光定量PCR對模板DNA 的特異性擴增產(chǎn)生的熒光信號作為檢測信號。該傳感體系中Hg2＋的線性范圍為0.05～100 nmol·L-1,檢出限低至30 pmol·L-1。

1.4 銀離子

吳雪琪等[47]基于核酸適配體錯配結(jié)合Ag＋的原理,利用DNA 探針和GO 設(shè)計開發(fā)了C-Ag＋-C和GO 結(jié)合的新型熒光傳感器,可用于特異性檢測Ag＋。此傳感器檢測Ag＋的線性范圍為150～400 nmol·L-1,檢出限為23 nmol·L-1。與使用GO 檢測重金屬離子的方法相比,該法的檢測線性范圍更寬。ZHU 等[48]建立了一種通過熒光猝滅法檢測Ag＋的新方法。此方法通過Ag＋特異性誘導(dǎo)多功能適配體探針發(fā)生分子折疊,形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu),使G4 堿基靠近熒光基團6-羧基熒光素(FAM),發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,從而導(dǎo)致熒光猝滅。方法的檢出限可低至0.64 nmol·L-1。

XIAO 等[49]開發(fā)了一種用于檢測Ag＋的增強型3D 紙基生物傳感裝置,該裝置需使用具有高靈敏度和便攜性的個人血糖儀。在該裝置中,3D 折紙μPADs集成了一塊載藥納米多孔膜[即載有3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)的親水性聚碳酸酯納米多孔膜(NM)],膜結(jié)合分析物后觸發(fā)銀納米粒子的自生長,原位阻斷膜孔,并利用手持個人血糖儀有效地放大信號。具體μPADs結(jié)構(gòu)如圖7 所示。該裝置可檢測自來水、飲用水、池塘水、土壤水等實際水樣中Ag＋的含量,其檢出限為58.1 pmol·L-1。

圖7 3D折紙NM-μPADs和用2個夾子固定的3D NM-μPADs圖像Fig.7 Images of 3D origami NM-μPADs and 3D NM-μPADs fixed with two clips

KHOSHBIN 等[50]不僅通過μPADs檢測了Pb2＋,還開發(fā)了一種基于納米材料GO 的適體傳感器,用于同時檢測Ag＋和Hg2＋。傳感陣列的原理是將目標(biāo)金屬離子Hg2＋和Ag＋注入傳感平臺,引發(fā)適體發(fā)生構(gòu)象變化,從而使適體從GO 表面釋放出來,如圖8所示。適體攜帶金屬離子釋放出來,金屬離子濃度發(fā)生變化,進而引起熒光強度的變化。該適體傳感器使Hg2＋和Ag＋的檢出限低至1.33,1.01 pmol·L-1。與已報道的適體方法相比,此適體傳感器在痕量分析中具有卓越的性能。

圖8 紙基適體傳感器同時檢測Ag＋和Hg2＋的原理圖Fig.8 Schematic diagram of paper-based aptamer sensor for the simultaneous detection of Ag＋and Hg2＋

2 總結(jié)及展望

紙基微流體分析裝置代表了新一代的診斷裝置,它將相對發(fā)達的多重能力的微流體與靈活、簡單的橫向流動試驗條技術(shù)相結(jié)合,可為終端消費者提供一種用戶友好、成本效益高、便攜式的診斷工具。目前該技術(shù)存在材料昂貴、工藝復(fù)雜、難以大規(guī)模制造等問題。優(yōu)良的μPADs的制作方法還需進一步研究,需要具備低成本的操作流程、廉價的制造技術(shù)和簡單易用的平臺解決方案等條件。

盡管已經(jīng)進行了較多概念的演示以及方案的研究,但μPADs目前仍處于初級階段,這也意味著紙基微流控分析裝置在全球健康等領(lǐng)域具有巨大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景。μPADs可通過印刷和表面化學(xué)在紙上進行整合,未來的紙基芯片將能夠執(zhí)行多種功能,如分離、純化、濃縮、合成等。納米材料已成功用于構(gòu)建各種新型生物傳感器[51-53],而具有良好特性的納米技術(shù)將對提高下一代紙基微流控器件的靈敏度和選擇性有著巨大的影響。同時,免疫學(xué)、遺傳學(xué)和電子學(xué)也可以與紙質(zhì)微流體結(jié)合,促進紙基芯片的多樣性發(fā)展。