亞致死劑量溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)MED煙粉虱取食行為及傳播TYLCV的影響

劉佰明，王 芳，劉 茹，楊澤眾，白義川，谷希樹(shù)

(天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，天津 300384)

煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)是一類(lèi)全球廣泛分布的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，至少由36個(gè)形態(tài)上難以區(qū)分但具有生殖隔離的隱種組成(Liuetal., 2012)。為方便，本文將B煙粉虱稱(chēng)作MEAM1隱種，Q煙粉虱稱(chēng)作MED隱種。近些年來(lái)，隨著MEAM1和MED煙粉虱相繼入侵我國(guó)(Luoetal., 2002；Chuetal., 2006)，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。煙粉虱為害的寄主多達(dá)600余種(Oliveiraetal., 2001)，不僅通過(guò)直接取食為害，更是傳播200多種植物雙生病毒(Hogenhoutetal., 2008)。雙生病毒是植物病毒中一類(lèi)最大、最具破壞性的類(lèi)群，在熱帶、亞熱帶及溫帶廣大地區(qū)引發(fā)作物病害，且這類(lèi)病毒只能有煙粉虱傳播(Moffat, 1999)。其中，番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)是一種入侵性的雙生病毒，起源于中東，于2006年在上海首次被發(fā)現(xiàn)(Wuetal., 2006)，隨后迅速席卷我國(guó)主要的番茄產(chǎn)區(qū)(Panetal., 2012)，帶來(lái)巨大的損失。煙粉虱通過(guò)取食行為傳播雙生病毒，伴隨口針在韌皮部分泌唾液和吸食兩個(gè)關(guān)鍵的取食行為(Jiangetal., 2000)。病毒粒子隨煙粉虱吸食韌皮部汁液進(jìn)入食道，穿過(guò)中腸進(jìn)入血淋巴，再進(jìn)入唾液腺，然后隨著煙粉虱唾液分泌被注入到寄主植物韌皮部篩管中，具有持久、循環(huán)性，一旦獲毒終生可傳(Czosnek and Ghanim, 2011)。顯然，阻斷傳毒媒介煙粉虱，是控制植物病毒病的重要手段。

應(yīng)用化學(xué)殺蟲(chóng)劑是過(guò)去10年防治煙粉虱最為重要的手段之一，其中阿維菌素、呋蟲(chóng)胺、氟啶蟲(chóng)胺腈、螺蟲(chóng)乙酯及溴氰蟲(chóng)酰胺等藥劑均對(duì)煙粉虱起到很好的防治效果(褚棟等，2018)。通過(guò)防治煙粉虱控制TYLCV不乏成功的范例，Mason等(2000)研究表明，新煙堿類(lèi)藥劑噻蟲(chóng)嗪無(wú)論是葉面噴施還是灌根均對(duì)TYLCV有很好的防治效果。氟吡呋喃酮是拜耳公司新研發(fā)的新煙堿型殺蟲(chóng)劑，無(wú)論是在國(guó)外(Roditakisetal., 2017)還是在國(guó)內(nèi)(Liuetal., 2021)，都被證明對(duì)煙粉虱及其傳播的TYLCV有很好的控制效果。但是長(zhǎng)期使用單一類(lèi)型的殺蟲(chóng)劑，煙粉虱極易產(chǎn)生抗藥性，輪換使用不同種類(lèi)殺蟲(chóng)劑是抗性治理的主要手段。溴氰蟲(chóng)酰胺是杜邦公司開(kāi)發(fā)的魚(yú)尼丁受體抑制劑類(lèi)殺蟲(chóng)劑，在植物體內(nèi)具有雙向內(nèi)吸傳導(dǎo)特性，室內(nèi)生測(cè)表明對(duì)煙粉虱具有很強(qiáng)的內(nèi)吸殺卵和觸殺殺卵作用，對(duì)若蟲(chóng)具有極高的毒力(王海娜等，2014)，在田間也表現(xiàn)出很好的防治效果(何翠娟等，2013；張秀霞等，2018)。田間煙粉虱及TYLCV協(xié)同防治試驗(yàn)證明，溴氰蟲(chóng)酰胺在田間應(yīng)用劑量下對(duì)煙粉虱及其傳播的病毒病具有極佳的控制效果(Caballeroetal., 2015)。

在田間，殺蟲(chóng)劑施用后隨著時(shí)間的推移逐步降解，對(duì)害蟲(chóng)的毒殺作用逐步減弱。溴氰蟲(chóng)酰胺在亞致死濃度下顯著延長(zhǎng)MED煙粉虱的發(fā)育時(shí)間、降低若蟲(chóng)、偽蛹和成蟲(chóng)期的存活率(Wangetal., 2017)。推測(cè)在亞致死濃度下，溴氰蟲(chóng)酰胺仍然對(duì)煙粉虱傳毒相關(guān)的取食行為產(chǎn)生不利影響，進(jìn)而影響傳毒效率。為驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，本研究首先測(cè)定了溴氰蟲(chóng)酰胺的亞致死劑量LC15，在此劑量下，利用昆蟲(chóng)刺探電位(EPG)和熒光定量技術(shù)研究了MED煙粉虱取食行為及傳毒效率。研究結(jié)果將對(duì)充分理解溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)煙粉虱傳播TYLCV的抑制作用，合理使用殺蟲(chóng)劑控制煙粉虱及其傳播的病毒病具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試植物

選用中雜9號(hào)番茄作為供試植物，利用草炭土和蛭石(體積比2 ∶1)作為植物培養(yǎng)基質(zhì)。在番茄苗培養(yǎng)至3～4片真葉期注射農(nóng)桿菌介導(dǎo)的TYLCV(上海分離物)侵染性克隆(引自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所)，再培養(yǎng)4周表現(xiàn)出明顯發(fā)病癥狀后，作為發(fā)病番茄苗使用。

1.2 供試?yán)ハx(chóng)

所用MED煙粉虱于2015年引自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，飼養(yǎng)在天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所養(yǎng)蟲(chóng)室內(nèi)，用80目尼龍紗網(wǎng)籠(45 cm× 45 cm×60 cm)隔離飼養(yǎng)在棉花苗上，環(huán)境溫度26±2℃，相對(duì)濕度60%±10%，光周期14 L ∶10 D。將大約300頭煙粉虱成蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到發(fā)病番茄苗(6～7葉期)上，用上述紗網(wǎng)籠隔離飼養(yǎng)2代，獲得攜帶TYLCV煙粉虱成蟲(chóng)。將另外 300頭煙粉虱成蟲(chóng)轉(zhuǎn)移到健康番茄苗(6～7葉期)上，同樣條件飼養(yǎng)兩代建立未攜毒煙粉虱種群。

1.3 溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)煙粉虱成蟲(chóng)亞致死濃度測(cè)定

采用活體植物-微蟲(chóng)籠法，首先將10%溴氰蟲(chóng)酰胺可分散游懸浮劑(上海杜邦農(nóng)化有限公司)用蒸餾水稀釋5個(gè)處理濃度，每個(gè)濃度配制藥液200 mL，分別用500 mL小噴壺噴灑在未攜毒番茄苗(6～7片葉)表面，噴灑至頁(yè)面滴水為止。噴灑同樣體積蒸餾水作為空白對(duì)照。番茄苗噴藥后放置在室內(nèi)自然陰干，24 h后分別接入攜毒和未攜毒MED煙粉虱。每個(gè)濃度藥液處理攜毒和未攜毒煙粉虱分別設(shè)置5個(gè)重復(fù)，每重復(fù)用直徑2 cm的微型夾葉籠接攜毒或未攜毒煙粉虱雌蟲(chóng)30頭，夾在5株番茄植株中間葉片背面。接蟲(chóng)48 h后檢查記錄煙粉虱的存活數(shù)和死亡數(shù)，用polo軟件計(jì)算致死中量LC50和亞致死劑量LC15。

1.4 溴氰蟲(chóng)酰胺亞致死劑量處理對(duì)煙粉虱成蟲(chóng)取食行為的影響

試驗(yàn)設(shè)兩個(gè)處理，分別是攜毒MED煙粉虱取食溴氰蟲(chóng)酰胺亞致死濃度(LC15)處理的番茄苗和蒸餾水處理的番茄苗，均采用6～7片葉大小的番茄苗。煙粉虱采用初羽化2～4 d的攜毒雌成蟲(chóng)。EPG記錄方法參考Liu等(2013)，波形識(shí)別方法參考Liu等(2012)。每一對(duì)昆蟲(chóng)-植物組合只記錄一次。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS軟件。

1.5 攜毒煙粉虱傳播TYLCV效率試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)兩個(gè)處理，分別用溴氰蟲(chóng)酰胺亞致死濃度(LC15)和蒸餾水噴施番茄苗(6～7片葉)。24 h后，取初羽化24 h內(nèi)的攜毒煙粉虱雌成蟲(chóng)，用直徑3 cm的夾葉籠加在番茄苗葉背面，每個(gè)處理16個(gè)重復(fù)，每重復(fù)用一株番茄苗接5頭攜毒煙粉虱。接蟲(chóng)后在溫度26±2℃，相對(duì)濕度60%±10%，光周期14 L ∶10 D條件下培養(yǎng)48 h后，去除煙粉虱成蟲(chóng)，繼續(xù)培養(yǎng)10 d后，取頂稍?xún)善嫒~共100 mg組織，采用天根DP320植物基因組試劑盒進(jìn)行DNA提取。參考Ning等(2015)方法進(jìn)行qPCR相對(duì)定量檢測(cè)TYLCV。

2 結(jié)果與分析

2 .1 溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)MED煙粉虱的亞致死濃度

溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)未攜毒和攜毒MED煙粉虱的亞致死濃度(LC15)分別為1.52 mg/kg和1.75 mg/kg，差異不顯著。未攜毒和攜毒煙粉虱的致死中濃(LC50)分別為4.01 mg/kg和11.91 mg/kg，未攜毒煙粉虱致死中濃度顯著低于攜毒煙粉虱(表1)。

表1 溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)未攜毒和攜毒MED煙粉虱的亞致死和致死中濃度比較

2.2 溴氰蟲(chóng)酰胺亞致死劑量處理對(duì)煙粉虱成蟲(chóng)取食行為的影響

攜帶TYLCV的MED煙粉虱在溴氰蟲(chóng)酰胺亞致死濃度(LC15)處理和空白對(duì)照處理的番茄苗上取食，在非韌皮部取食階段計(jì)算了6個(gè)EPG參數(shù)，其中第一次刺探起始時(shí)間在溴氰蟲(chóng)酰胺處理下顯著推遲，是對(duì)照番茄苗上的3.7倍(圖1-A)，其余5個(gè)參數(shù)在處理和對(duì)照間均無(wú)顯著差異(圖1-B～F)。

圖1 溴氰蟲(chóng)酰胺亞致死濃度(LC15)處理對(duì)攜帶TYLCV煙粉虱非韌皮部取食行為的影響Fig.1 Effects of cyantraniliprole treatment at the sublethal concentration (LC15)on non-phloem feeding behavior of Bemisia tabaci vectored TYLCV注：“*”表示處理和對(duì)照組間差異顯著(Mann-Whitney U test, P<0.05)。下圖同。Note：“*” indicated significant difference between treatment and control group (Mann-Whitney U test, P<0.05).The same below.

在韌皮部取食階段，計(jì)算了8個(gè)EPG參數(shù)，攜帶TYLCV的MED煙粉虱在溴氰蟲(chóng)酰胺亞致死濃度(LC15)處理的番茄苗上唾液分泌平均時(shí)間(圖2-C)、韌皮部吸食總時(shí)間(圖2-D)和韌皮部吸食平均時(shí)間(圖2-F)顯著縮短，潛在取食指數(shù)(圖2-G)顯著降低，分別是對(duì)照組的0.10、0.14和0.10倍。其余4個(gè)參數(shù)在處理和對(duì)照組間差異不顯著。

圖2 溴氰蟲(chóng)酰胺亞致死濃度(LC15)處理對(duì)攜帶TYLCV煙粉虱韌皮部取食行為的影響Fig.2 Effects of cyantraniliprole treatment at the sublethal concentration (LC15)on phloem feeding behavior of Bemisia tabaci vectored TYLCV

2.3 溴氰蟲(chóng)酰胺亞致死劑量處理對(duì)煙粉虱傳毒效率的影響

與空白對(duì)照相比，溴氰蟲(chóng)酰胺亞致死濃度(LC15)處理極顯著的降低了攜帶TYLCV的MED煙粉虱的傳毒效率(P<0.001)，攜毒煙粉虱取食48 h的番茄苗培養(yǎng)10 d后，TYLCV相對(duì)量仍接近于0(圖3)。

圖3 溴氰蟲(chóng)酰胺亞致死濃度(LC15)處理對(duì)攜帶TYLCV煙粉虱傳毒效率的影響Fig. 3 Effects of cyantraniliprole treatment at the sublethal concentration (LC15)on virus transmission efficiency of Bemisia tabaci vectored TYLCV

3 結(jié)論與討論

本研究表明，攜帶TYLCV和不攜毒煙粉虱對(duì)溴氰蟲(chóng)酰胺亞致死濃度(LC15)處理敏感性相當(dāng)，但攜毒煙粉虱對(duì)溴氰蟲(chóng)酰胺致死中濃度(LC50)敏感性顯著低于未攜毒煙粉虱(表1)。這與前期研究攜帶TYLCV煙粉虱對(duì)氟吡呋喃酮亞致死濃度(LC15)處理和致死中濃度(LC50)處理的敏感性均顯著低于未攜毒煙粉虱結(jié)果基本一致(Liuetal., 2020)。溴氰蟲(chóng)酰胺屬于鄰氨基苯甲酰胺類(lèi)殺蟲(chóng)劑，作用于魚(yú)尼丁受體(楊桂秋等，2012)，與氟吡呋喃酮作用機(jī)理不同，后者屬于新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑，作用于乙酰膽堿受體(李晨雨等，2018)。本研究為T(mén)YLCV侵染煙粉虱后降低了對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性提供了又一個(gè)例證。煙粉虱攜帶TYLCV后提高對(duì)殺蟲(chóng)劑耐藥性機(jī)制還不清楚，推測(cè)攜帶植物病毒后促進(jìn)煙粉虱體內(nèi)解毒酶的表達(dá)，需要后續(xù)更深入的研究來(lái)證實(shí)。

在前人發(fā)現(xiàn)田間應(yīng)用濃度溴氰蟲(chóng)酰胺顯著抑制MED煙粉虱韌皮部取食的基礎(chǔ)上(Civolanietal., 2014)，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)亞致死濃度(LC15)溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)煙粉虱韌皮部取食行為仍具有顯著抑制作用(圖2)，這與前期研究亞致死濃度(LC15)氟吡呋喃酮顯著抑制MED煙粉虱取食行為結(jié)果一致(Liuetal., 2021)。殺蟲(chóng)劑改變昆蟲(chóng)行為，與殺蟲(chóng)劑作用靶標(biāo)位點(diǎn)密切相關(guān)。大多數(shù)殺蟲(chóng)劑作用于昆蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)，在殺蟲(chóng)劑在亞致死濃度作用下，廣泛影響昆蟲(chóng)行為。新煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑是應(yīng)用最廣泛的一類(lèi)殺蟲(chóng)劑之一，屬乙酰膽堿激動(dòng)劑，可有選擇的作用于昆蟲(chóng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的乙酰膽堿受體(nAChR)(Bassetal., 2015)。不同種類(lèi)煙堿類(lèi)殺蟲(chóng)劑改變各種昆蟲(chóng)行為的現(xiàn)象已被廣泛報(bào)道，例如吡蟲(chóng)啉暴露還對(duì)蜜蜂蜂巢中工蜂行為產(chǎn)生顯著不利影響(Cralletal., 2018)。亞致死濃度(LC10、LC30)噻蟲(chóng)嗪處理白菜可顯著縮短桃蚜Myzuspersicae韌皮部吸食時(shí)間(Choetal., 2011)，亞致死劑量噻蟲(chóng)嗪不但顯著縮短大豆蚜蟲(chóng)韌皮部吸食時(shí)間，顯著延長(zhǎng)其非刺探時(shí)間(Stammetal., 2013)。氟吡呋喃酮，一種新型的新煙堿類(lèi)藥劑，與噻蟲(chóng)嗪等無(wú)交互抗性，但是作用于昆蟲(chóng)乙酰膽堿受體的特點(diǎn)使之亞致死濃度(LC15)處理顯著降低攜帶TYLCV的MED煙粉虱韌皮部取食行為(Liuetal., 2021)。溴氰蟲(chóng)酰胺與煙堿類(lèi)藥劑作用方式不同，其作用靶標(biāo)是昆蟲(chóng)的魚(yú)尼丁受體，暴露于該藥劑的昆蟲(chóng)釋放橫紋肌和平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子，導(dǎo)致肌肉運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)受損，蟲(chóng)體麻痹死亡(楊桂秋等，2012)。肌肉運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)可能和昆蟲(chóng)取食行為密切相關(guān)，已有研究表明在溴氰蟲(chóng)酰胺田間劑量處理下，MED煙粉虱不能到達(dá)韌皮部取食(Civolanietal., 2014)。在亞致死劑量作用下，溴氰蟲(chóng)酰胺顯著影響昆蟲(chóng)體內(nèi)多種酶變化，例如亞致死濃度處理鱗翅目幼蟲(chóng)甜菜夜蛾SpodopteraexiguaHübner和小地老虎AgrotisypsilonRottemberg，其羧酸酯酶(CarE)先被誘導(dǎo)升高、后被抑制降低，多功能氧化酶(MFOs)活性則受到抑制(余慧靈等，2015；何發(fā)林等，2019)。半翅目昆蟲(chóng)灰飛虱在溴氰蟲(chóng)酰胺亞致死劑量(LD10和LD30)處理下，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)被極顯著誘導(dǎo)升高(張凱倫等，2020)。據(jù)此推測(cè)在溴氰蟲(chóng)酰胺亞致死劑量處理下，雖然不會(huì)導(dǎo)致昆蟲(chóng)立刻死亡，但是肌肉運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)損傷、酶類(lèi)失調(diào)、影響能量代謝減弱等均是昆蟲(chóng)多種行為受損的原因。本研究溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)MED煙粉虱的亞致死效應(yīng)，與前人研究溴氰蟲(chóng)酰胺亞致死濃度(LC30)處理煙草，可顯著減弱桃蚜韌皮部取食行為的作用效果一致(Zengetal., 2016)，為溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)昆蟲(chóng)行為的亞致死效應(yīng)又增添一個(gè)例證，但其生理生化及分子機(jī)理研究尚需進(jìn)一步深入。

前人研究表明，溴氰蟲(chóng)酰胺在田間劑量作用下可效控制TYLCV(Caballeroetal., 2015)；本研究表明溴氰蟲(chóng)酰胺亞致死濃度(LC15)處理仍極大降低了煙粉虱的傳毒效率(圖3)，這與氟吡呋喃酮對(duì)MED煙粉虱傳播TYLCV效率影響結(jié)果一致(Liuetal., 2021)。顯然，溴氰蟲(chóng)酰胺同氟吡呋喃酮一樣，在殘效期間也對(duì)TYLCV具有較好的控制潛力，為殺蟲(chóng)劑交替使用、適當(dāng)延長(zhǎng)用藥間隔等減量增效技術(shù)研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。本研究還存在一些不足之處，檢測(cè)煙粉虱侵染植物后傳毒效率的時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該更多一些，并且需要進(jìn)一步進(jìn)行田間試驗(yàn)以驗(yàn)證溴氰蟲(chóng)酰胺對(duì)本地TYLCV的控制效果。溴氰蟲(chóng)酰胺作為木質(zhì)部系統(tǒng)活性成分殺蟲(chóng)劑，如何影響取食韌皮部昆蟲(chóng)刺吸式口器昆蟲(chóng)行為，是今后一個(gè)有趣的研究方向。此外，還需對(duì)更多種類(lèi)型的殺蟲(chóng)劑抑制煙粉虱傳毒行為及傳毒效果進(jìn)行研究，并且研究殺蟲(chóng)劑與提高植物免疫措施相結(jié)合的實(shí)用方法，以期形成以植物免疫激活為內(nèi)御，以殺蟲(chóng)劑阻斷傳毒媒介為外阻的“內(nèi)御外阻”綜合防控方案，為有效解決煙粉虱及其傳播的雙生病毒病這一對(duì)外來(lái)入侵病蟲(chóng)組合防治難題提供幫助。