冷凍法處理帶毒灰飛虱研究初報(bào)

吳淑華+杜琳琳+蘭瑩+等

摘要：為了加快灰飛虱傳病毒病接種鑒定的速度，研究了冷凍處理帶毒灰飛虱的最佳時(shí)間以及對(duì)灰飛虱傳毒及羽化能力的影響。結(jié)果表明，-20 ℃冷凍處理帶毒灰飛虱20 min不影響灰飛虱傳播水稻條紋病毒，冷凍處理對(duì)灰飛虱傳毒能力和羽化的影響不明顯。

關(guān)鍵詞：冷凍法；水稻條紋病毒；灰飛虱；傳毒；羽化

中圖分類號(hào)： S435.112+.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0117-02

收稿日期：2014-03-25

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（12）1003]；國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（編號(hào)：201003031）；江蘇省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：BE2012303）。

作者簡(jiǎn)介：吳淑華（1962—），女，副研究員，研究方向?yàn)樗静《静　-mail：kingplasmid@gmail.com。

通信作者：周益軍，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锊《静?。E-mail：yjzhou@jaas.ac.cn。水稻條紋葉枯病是由是由灰飛虱（Laodelphax striatellus Fallén）傳播水稻條紋病毒（rice stripe virus，RSV） 引起的一種重要的水稻病害[1]，最早于1897年在日本關(guān)東地區(qū)發(fā)生[1]。在我國(guó)，該病于1963年在江蘇南部地區(qū)始發(fā)[2]，目前已擴(kuò)及到全國(guó)18個(gè)省（市、自治區(qū)），其中以江蘇、浙江、山東、河南、云南等地粳稻田發(fā)病更為普遍，20世紀(jì)90年代在全國(guó)粳稻種植區(qū)流行，造成水稻嚴(yán)重減產(chǎn)[3]。在江蘇省，該病1998年在部分稻區(qū)流行，2001年在大部分稻區(qū)暴發(fā)流行且不斷蔓延，2002年重病田病株率50%[4]，2004年發(fā)病面積占江蘇水稻種植面積的79%，部分田塊絕收，2005年發(fā)病面積持續(xù)擴(kuò)大，并開始向浙江、安徽、河南、山東、上海等周邊?。ㄊ校┞樱鹆撕艽笊鐣?huì)反響[5]。在江蘇建湖等地，還發(fā)現(xiàn)水稻條紋病毒危害小麥的現(xiàn)象[6]。2005年以后，江蘇省通過推廣防控技術(shù)和種植抗病品種，使水稻條紋葉枯病的危害逐漸降低。然而，鑒于病毒病害突發(fā)性和爆發(fā)性的特點(diǎn)，以及單一性抗性基因存在的隱患，新抗性資源的繼續(xù)發(fā)掘和抗性品種的選育刻不容緩。

抗病新資源的發(fā)掘和新抗性品種的選育，首先需要穩(wěn)定、科學(xué)的接種鑒定方法，周彤等建立的水稻條紋葉枯病苗期接種鑒定方法[7]穩(wěn)定可靠，是水稻條紋葉枯病抗性鑒定的首選方法，但是接種鑒定過程中發(fā)現(xiàn)，由于傳毒介體灰飛虱的移動(dòng)性較強(qiáng)，定量接種灰飛虱成為一件操作復(fù)雜而繁瑣的工作。本試驗(yàn)對(duì)冷凍法處理帶毒灰飛虱進(jìn)行了研究，為水稻條紋葉枯病等灰飛虱傳病毒病的接種鑒定提供了一種處理攜帶病毒灰飛虱的新方法（國(guó)家發(fā)明專利[8]），大大加快了灰飛虱傳病毒病接種鑒定的速度，為加快抗病品種的鑒出速度和選育進(jìn)程提供了技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1水稻材料和傳毒介體

水稻材料：感病品種武育粳3號(hào)（武進(jìn)稻麥良種場(chǎng)提供）。

傳毒介體灰飛虱的篩選與飼養(yǎng)：2005年從江蘇省海安縣水稻條紋葉枯病重病區(qū)稻田采集灰飛虱若蟲，在育有武育粳3號(hào)幼苗的玻璃杯中飼養(yǎng)，交配后單頭雌蟲單獨(dú)產(chǎn)卵，雌蟲產(chǎn)卵后采用周益軍等的方法[9]檢測(cè)其攜帶RSV情況，帶毒雌蟲后代在育有武育粳3號(hào)幼苗燒杯中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)2～3代后同上法再篩選1次，所得純系經(jīng)2～3代擴(kuò)繁后用于接種試驗(yàn)。試驗(yàn)過程中定期進(jìn)行篩選，使供試蟲的帶毒率維持在80%以上。

1.2冷凍時(shí)間梯度

取6個(gè)干燥玻璃杯并編號(hào)，每杯放100頭3～5齡帶毒灰飛虱，紗布封口后，放于-20 ℃冰箱冷凍處理，并開始計(jì)時(shí)，每10 min取出1杯，取出后迅速將灰飛虱倒于白紙上，觀察并記錄灰飛虱活躍狀態(tài)、蘇醒時(shí)間及死蟲數(shù)，調(diào)查完后將冷凍過的灰飛虱在育有武育粳3號(hào)幼苗的1 000 mL燒杯中單獨(dú)飼養(yǎng)，第2天統(tǒng)計(jì)死亡蟲數(shù)。

1.3冷凍灰飛虱對(duì)其傳毒能力的影響

武育粳3號(hào)浸種、催芽，至0.5葉時(shí)播于250 mL玻璃杯中，每杯播12株，共6杯。從帶毒灰飛虱群體取130頭，-20 ℃ 冰箱中冷凍20 min，然后取120頭接種武育粳3號(hào)1.5葉齡幼苗，重復(fù)3次；另外取120頭不經(jīng)冷凍處理的帶毒灰飛虱接種武育粳3號(hào)1.5葉齡幼苗，重復(fù)3次。玻璃杯紗布封口，于22 ℃、光周期14 h光照/10 h黑暗條件下飼養(yǎng)，48 h 后移走全部灰飛虱，移栽大田，移栽7 d后開始調(diào)查，每隔1 d調(diào)查1次，共調(diào)查15次，以最后一次調(diào)查結(jié)果計(jì)算發(fā)病率。

1.4冷凍灰飛虱對(duì)其羽化的影響

灰飛虱4齡若蟲置于-20 ℃冰箱冷凍處理20 min，轉(zhuǎn)移至育有武育粳3號(hào)幼苗的250 ml玻璃杯中飼養(yǎng)，每杯30蟲，共5杯。若蟲羽化后，統(tǒng)計(jì)羽化成蟲數(shù)，計(jì)算羽化率。飼養(yǎng)若蟲的水稻苗繼續(xù)管理，直至冷凍灰飛虱所產(chǎn)的卵孵化。

2結(jié)果與分析

2.1灰飛虱冷凍時(shí)間

對(duì)灰飛虱-20 ℃冷凍處理10 min，不昏迷、仍可跳動(dòng)，仍不利于紙上計(jì)數(shù)，但隨著冷凍時(shí)間延長(zhǎng)，灰飛虱的生命力受到影響。冷凍40 min以上，死亡率達(dá)約17%，死亡率和復(fù)蘇時(shí)間都隨冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)而增大（表1）。綜合復(fù)蘇時(shí)間與死亡率，帶毒灰飛虱冷凍處理以-20 ℃、20 min較合適。

表1不同冷凍時(shí)間處理后灰飛虱的狀態(tài)

冷凍時(shí)間

（min）復(fù)蘇時(shí)間

（s）灰飛虱死亡率

（%）100020701.4830944.764011717.655015017.396015917.65

2.2冷凍灰飛虱對(duì)其傳毒能力的影響

經(jīng)-20 ℃冷凍處理20 min的帶毒灰飛虱接種武育粳3號(hào)后的發(fā)病率略低于不經(jīng)冷凍帶毒灰飛虱處理灰飛虱所接種水稻的發(fā)病率，可是顯著性分析發(fā)現(xiàn)兩者間無顯著性差異（表2），可見冷凍處理對(duì)帶毒灰飛虱傳播水稻條紋病毒的能力無影響。

表2冷凍對(duì)灰飛虱傳毒能力的影響

處理平均發(fā)病率

（%）5%顯著水平1%極顯著水平不冷凍50.56aA冷凍45.04aA

2.3冷凍灰飛虱對(duì)其羽化的影響

經(jīng)-20 ℃冷凍處理20 min后灰飛虱的平均羽化率達(dá)88.81%，與非冷凍處理的灰飛虱羽化率100%進(jìn)行假設(shè)測(cè)驗(yàn)知，差異性不顯著，說明冷凍對(duì)灰飛虱的羽化影響不大 （表3）。繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)-20 ℃冷凍處理的灰飛虱所產(chǎn)后代羽化后，成蟲仍可產(chǎn)卵并孵化，初步表明-20 ℃冷凍處理 20 min 對(duì)灰飛虱交配產(chǎn)卵機(jī)能影響不大，其生活史不會(huì)因 -20 ℃ 冷凍20 min而受影響。

3討論與結(jié)論

水稻條紋葉枯病重病區(qū)田間鑒定方法具有方便、快捷等優(yōu)點(diǎn)，但是抗性鑒定結(jié)果易受環(huán)境條件的影響，使得年度和區(qū)域間灰飛虱發(fā)生量和帶毒率的具有不均一性，從而在一定程度上影響結(jié)果的重演性[10]。苗期接種鑒定方法是在可控條件下開展的一種抗性鑒定，利用其評(píng)價(jià)水稻品種對(duì)水稻條紋葉枯病的抗性水平，除了可以很好地克服環(huán)境條件的影響，拓寬鑒定時(shí)間，還滿足了對(duì)大量材料進(jìn)行快速鑒定的需求[7]。鑒定過程中發(fā)現(xiàn)，傳毒介體灰飛虱的移動(dòng)性較強(qiáng)，使得定量接

表3冷凍對(duì)灰飛虱羽化的影響

編號(hào)總蟲數(shù)

（頭）羽化數(shù)

（頭）羽化率

（%）1423788.10 2322887.50 3232191.30 4322887.50 5292689.66 平均〖4〗88.81

種灰飛虱成為一件操作復(fù)雜而繁瑣的工作，曾對(duì)研究進(jìn)度帶來了一定影響，進(jìn)而對(duì)冷凍法處理帶毒灰飛虱進(jìn)行了研究，不僅大大加快了水稻條紋葉枯病接種鑒定的速度，還為灰飛虱傳病毒病的接種鑒定提供了一種處理攜帶病毒灰飛虱的新方法，進(jìn)而加快了抗病品種的鑒出速度和選育進(jìn)程。

攜帶RSV的灰飛虱-20 ℃冷凍處理20 min后，不僅方便計(jì)數(shù)，而且對(duì)其傳毒能力和羽化影響不大，不會(huì)影響其對(duì)水稻條紋病毒的傳播，繼續(xù)飼養(yǎng)發(fā)現(xiàn)對(duì)其產(chǎn)卵機(jī)能影響也不大，其生活史不會(huì)因-20 ℃冷凍20 min而受到影響，但其交配與產(chǎn)卵能力的大小是否受影響還須要進(jìn)一步試驗(yàn)。這與劉向東等報(bào)道灰飛虱能抵抗一定低溫并忍受一定高溫，在江蘇南部灰飛虱越冬期不休眠，僅在-3 ℃且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)才發(fā)生麻痹凍倒現(xiàn)象，凍倒若蟲大部分能復(fù)蘇的結(jié)論[11]基本一致。

參考文獻(xiàn)：

[1]Toriyama S. Rice stripe virus（set 17）[M]. CMI /ABB： Description of Plant Viruses，1983.

[2]朱鳳美，肖慶璞，王法明，等. 江南稻區(qū)新發(fā)生的幾種稻病[J]. 植物保護(hù)，1964，2（3）：100-102，145-146.

[3]周益軍，李碩，程兆榜，等. 中國(guó)水稻條紋葉枯病研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（5）：1007-1015.

[4]程兆榜，楊榮明，周益軍，等. 江蘇稻區(qū)水稻條紋葉枯病發(fā)生新規(guī)律[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002（1）：39-41.

[5]周益軍.水稻條紋葉枯病[M]. 南京：江蘇科學(xué)技術(shù)出版社，2010.

[6]Xiong R Y，Cheng Z B，Wu J X，et al. First report of an outbreak of rice stripe virus on wheat in China[J]. Plant Pathology，2008，57（2）： 397.

[7]周彤，范永堅(jiān)，程兆榜，等. 水稻抗條紋葉枯病鑒定方法的研究[J]. 植物保護(hù)，2008，34（6）：77-80.

[8]周彤，周益軍，陳潔，等. 冷凍法處理帶毒灰飛虱：中國(guó)，CN101292640[P]. 2008-10-29.

[9]周益軍，劉海建，王貴珍，等. 灰飛虱攜帶的水稻條紋病毒免疫檢測(cè)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004（1）：50-51.

[10]周彤，王英，吳麗娟，等. 水稻品種抗黑條矮縮病人工接種鑒定方法[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2011，38（4）：301-305.

[11]劉向東，翟保平，胡自強(qiáng). 高溫及水稻類型對(duì)灰飛虱種群的影響[J]. 昆蟲知識(shí)，2007，44（3）：348-352.來娜娜，朱文豪，劉政，等. 新疆棉花黃萎病拮抗放線菌的分離與篩選[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（1）：119-121.