牙鲆彈狀病毒研究進(jìn)展

張小飛　孫穎杰　賈赟　等

摘要：牙鲆彈狀病毒（Hirame rhabdovirus，HIRRV）可以引起牙鲆、香魚等肌肉組織器官及內(nèi)臟出血，造血器官壞死，給魚類養(yǎng)殖帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。HIRRV具有囊膜，屬于彈狀病毒科粒外彈狀病毒屬。病毒基因組為單股負(fù)鏈的RNA，長(zhǎng)約11 000 bp，主要包含5個(gè)基因，可編碼核蛋白（nucleoperotein，N）、磷蛋白（phosphoperotein，P）、基質(zhì)蛋白（matrix preotein，M）、糖蛋白（glycoperotein，G）、依賴RNA的RNA酶（RNA polymerase protein，L）和非結(jié)構(gòu)蛋白（non-virion perotein，NV）。本文就目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于HIRRV的流行特點(diǎn)、生物學(xué)特征、分類地位、基因組及其蛋白產(chǎn)物的特征以及檢測(cè)方法等方面進(jìn)行了較為全面的概述，旨在為該病的預(yù)防、控制以及致病機(jī)理方面的研究提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：牙鲆彈狀病毒；基因組；編碼蛋白；檢測(cè)方法

中圖分類號(hào)： S941.41文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0231-03

收稿日期：2014-03-21

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：41276174）。

作者簡(jiǎn)介：張小飛（1990—），女，河南寶豐人，碩士研究生，從事海洋生物疫病研究。Tel：（0411）82583668；E-mail：longlongai3227@163.com。

通信作者：賈赟，高級(jí)獸醫(yī)師，從事動(dòng)物傳染病檢測(cè)、防制研究。E-mail：jxy750921@163.com。牙鲆彈狀病毒（Hirame rhabdovirus，HIRRV）為單股負(fù)鏈RNA病毒，是彈狀病毒科粒外彈狀病毒屬新成員，流行病學(xué)上表現(xiàn)為低溫（≤15 ℃）發(fā)病，主要感染牙鲆、香魚，感染魚其鰭、肌肉組織及內(nèi)部器官出血，造血器官壞死；人工感染對(duì)黑鯛、無備平鲉和虹鱒等海水魚類或降河洄游魚類具有強(qiáng)烈致病性，給全球海水養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。根據(jù)《中韓進(jìn)出口活水生動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫協(xié)議》，進(jìn)出境的鱸魚、真鯛、牙鲆、大菱鲆、鯉魚、鯽魚等養(yǎng)殖和種苗用魚種，均要進(jìn)行HIRRV疫病檢測(cè)，口岸安全意義重大。國(guó)外對(duì)HIRRV的研究相對(duì)較早，而國(guó)內(nèi)目前研究主要集中在病毒分離、基因組測(cè)序和分子診斷方法的建立等方面工作[1-2]，研究?jī)?nèi)容相對(duì)局限。本文就目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于HIRRV的流行特點(diǎn)、生物學(xué)特征、分類地位、基因組及其蛋白產(chǎn)物的特征以及檢測(cè)方法等方面進(jìn)行了較為全面的概述，旨在為該病的預(yù)防、控制以及致病機(jī)理方面的研究提供依據(jù)。

1發(fā)現(xiàn)及流行

1986年，首次在日本兵庫(kù)縣的患病牙鲆和香魚魚苗中分離得到HIRRV日本株（8401-H）[3]，1987年Sano等在香魚（Plecoglossus altivelis）、黑鯛（Milio macrocephalus）、無備平鲉（Sebastes inermis）中也發(fā)現(xiàn)了HIRRV[4]。1997年、2007年又分別在韓國(guó)南部海域的牙鲆和中國(guó)山東榮成的石鰈幼魚中發(fā)病，并經(jīng)分離得到HIRRV韓國(guó)株（CA-9703）和中國(guó)株（SR080113）[1，5]。HIRRV主要感染海水魚，但 1992年Oseko等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HIRRV對(duì)部分淡水魚同樣具有致病性[6]，不過在淡水魚養(yǎng)殖方面目前還沒有發(fā)現(xiàn)該病毒。直到2012年EURL會(huì)議（16th Annual Meeting of the National Reference Laboratories for Fish Diseases）報(bào)告指出HIRRV在中國(guó)淡水魚養(yǎng)殖中已經(jīng)廣泛傳播。2013年Borzym等在歐洲的河鱒魚（淡水魚）中分離得到了HIRRV病毒（j.No.207237），經(jīng)過測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)歐洲株和中國(guó)株P(guān)基因的同源性達(dá)到99%，L和N基因的同源性在99%以上[7]，有學(xué)者認(rèn)為HIRRV歐洲株很可能是通過冷凍食品由中國(guó)進(jìn)入歐洲。

2生物學(xué)特征

HIRRV病毒粒子呈彈狀，為彈狀病毒典型的形態(tài)學(xué)特征，病毒粒子長(zhǎng)160～180 nm，寬60～80 nm?；蚪M長(zhǎng)度約為11 000 bp[1，5]，主要與核蛋白（N） 結(jié)合形成核衣殼，呈螺旋對(duì)稱，在核衣殼上還結(jié)合有少量的聚合酶（L） 和磷蛋白（P）；囊膜，緊密地包裹著核衣殼，囊膜由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，其內(nèi)表面為基質(zhì)蛋白（M），囊膜上有糖蛋白（G） 突起。成熟的病毒粒子通過細(xì)胞膜出芽，釋放到胞膜外。

該病毒能夠在EPC（鯉魚上皮瘤細(xì)胞系）、FHM（肥頭鯉細(xì)胞系）、CHSE-214（大鱗大馬哈魚胚胎細(xì)胞系）、CO（草魚卵巢細(xì)胞系）、CIK（草魚腎細(xì)胞系）、BF-2（藍(lán)鰓魚幼魚細(xì)胞系）、R1（虹鱒肝細(xì)胞系）、SSN-1（紋鱧細(xì)胞系）等魚類細(xì)胞上增殖，并出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathogenic effect，CPE），其中FHM、EPC、BF-2、CHSE-214最為敏感，最大滴度達(dá)到107 TCID50/100 μL；該病毒的最適生長(zhǎng)溫度為20 ℃，僅2 d就能病變完全，而且病毒滴度達(dá)到109 TCID50/100 μL[8]。該病毒的感染活性可以被pH值（3.0和9.0）、脂溶劑（三氯甲烷）以及熱（56 ℃，30 min）等破壞。

3分類地位

1991年，Nishizawa等發(fā)現(xiàn)HIRRV由N、P、M、G、L 等5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成，其蛋白質(zhì)電泳圖譜和狂犬病毒屬相似，把HIRRV歸到彈狀病毒科的狂犬病毒屬[9]。直到1997年Kurath等發(fā)現(xiàn)G基因和L基因之間存在NV基因[10]；2000年國(guó)際病毒學(xué)分類委員會(huì)（ICTV）第7次報(bào)告中，正式把HIRRV列為彈狀病毒科的一個(gè)新屬——粒外彈狀病毒屬[11]。粒外彈狀病毒屬病毒在其糖蛋白和聚合酶蛋白之間均存在一個(gè)獨(dú)特的非結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白存在于受感染的細(xì)胞中，但不存在于成熟的病毒粒子中，這也是粒外彈狀病毒區(qū)別于水皰病毒的一個(gè)主要標(biāo)志[12]。

4基因組及其蛋白產(chǎn)物的特征

4.1基因組特征

HRV基因組的測(cè)序工作起始于P和M基因[13]，目前，HIRRV的全基因組序列已經(jīng)測(cè)定，基因組大小約11 000 bp[1，5，14]，基因組含有6個(gè)開放閱讀框（ORFs），分別編碼6種蛋白：核蛋白（nucleoperotein，N）、磷蛋白（phosphopero tein，P）、基質(zhì)蛋白（matrix preotein，M）、糖蛋白（glycoperotein，G）、依賴RNA的RNA酶（RNA polymerase protein，L）和非結(jié)構(gòu)蛋白（non-virion perotein，NV）（表1） [5]。

表1HIRRV韓國(guó)株（CA-9703）基因組中6種基因的特征

基因位置

（bp）上游非翻

譯區(qū)（nt）下游非翻

譯區(qū)（nt）蛋白長(zhǎng)度

（aa）蛋白分子

量（ku）N62～1 4075510539242.5P1 409～2 179443622725.8M2 234～2 815585319321.6G2 882～4 492354250856.6NV4 494～4 87003411112.7L4 872～10 96147751 987225注：蛋白長(zhǎng)度和蛋白分子量是有開放閱讀框直接翻譯的推算的蛋白質(zhì)，沒有經(jīng)過磷酸化或糖基化的轉(zhuǎn)錄后修飾。

基因結(jié)構(gòu)是由3′端非翻譯前導(dǎo)（Leader）區(qū)、基因區(qū)、基因間連接區(qū)及5′端非轉(zhuǎn)錄拖尾（Trailer）區(qū)組成。排列方式為3′Leader-N-P（M1）-M（M2）-G-NV（非結(jié)構(gòu)蛋白）-L-Trailer 5′（圖1）[1，5]。HIRRV的前導(dǎo)區(qū)含有位于54～60的多聚腺苷酸化信號(hào)（UAUCUUUUUUU），而拖尾區(qū)中含有L基因轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化信號(hào)，且基因組3′端和5′端呈反向互補(bǔ)，這是非節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒的共同特征，可能對(duì)平衡病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程其重要作用（圖2）[5，15]。

基因間的連接區(qū)內(nèi)含有高度保守的上游基因和多聚腺苷酸化信號(hào)、下游基因轉(zhuǎn)錄起始信號(hào)以及轉(zhuǎn)錄和起始信號(hào)間的間隔序列[16]。HIRRV基因間連接區(qū)的保守序列為AGATAG（A）7TGGCAC（N）4GTG[17-18]，其中AGATAG（A）7為轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化信號(hào)；基因間的間隔序列一般只含有1個(gè)核苷酸（U或G）[19]，這些調(diào)節(jié)信號(hào)和基因間區(qū)域在HIRRV和其他粒外彈狀病毒屬成員之間都是一致的，但區(qū)別于彈狀病毒科的其他屬。

4.2編碼蛋白的特征

N蛋白是病毒粒子中含量最豐富的蛋白，它和病毒RNA緊密結(jié)合，形成核糖核蛋白體N-RNA結(jié)構(gòu)，并構(gòu)成轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的模板，在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起著重要的作用。

P蛋白是和聚合酶相關(guān)的磷酸化蛋白，它與N蛋白和L蛋白相互作用，在轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中起著關(guān)鍵的作用[20-21]。該蛋白根據(jù)序列推算的pI為8.68[18]，而根據(jù)等點(diǎn)聚焦推算出來的pI為7.3～7.4[22]，這可能是因?yàn)轸~類細(xì)胞所產(chǎn)生的蛋白磷酸化程度有關(guān)。P蛋白以分子伴侶的形式與N蛋白結(jié)合，阻止N蛋白自身聚集，從而保證N蛋白以可溶性的分子存在[23-25]，同時(shí)也能阻止N蛋白與非特異性的RNA結(jié)合[26]。

M蛋白在病毒出芽過程中，核衣殼與G蛋白相互作用，起始病毒的裝配。然后與M蛋白結(jié)合形成核衣殼-M蛋白結(jié)合物，完成病毒裝配，出芽形成子病毒，進(jìn)而感染其他細(xì)胞[27]。

G蛋白是病毒的主要抗原，能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和刺激細(xì)胞免疫，因此通常選擇G基因作為抗原基因來構(gòu)建DNA疫苗。Yasuike等比較HIRRV G蛋白疫苗和N蛋白疫苗的免疫效果，發(fā)現(xiàn)G蛋白疫苗比N蛋白疫苗更能引起一系列的免疫反應(yīng)[28]，但是G蛋白和N蛋白疫苗的具體免疫機(jī)制還不太清楚，有待進(jìn)一步的研究。

NV蛋白是粒外彈狀病毒屬所特有的非結(jié)構(gòu)蛋白，僅存在于感染細(xì)胞中，不存在于成熟的病毒粒子中。Johnson等利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建NV基因突變的重組SHRV病毒，發(fā)現(xiàn)重組的SHRV與野生型病毒具有相同的感染力及行態(tài)，從而證實(shí)了NV基因?qū)HRV的復(fù)制沒有重要影響[29]。Biacchesi等將IHNV病毒NV基因替換成GFP（綠色熒光蛋白）或CAT（氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶）基因，病毒的復(fù)制不受影響[30]。有學(xué)者認(rèn)為NV基因并不是病毒在細(xì)胞的生長(zhǎng)過程中所必須的，同時(shí)對(duì)病毒在體內(nèi)的致病性也不起重要作用[31]。例如，Chiou等在2000年首次發(fā)現(xiàn)NV基因在細(xì)胞培養(yǎng)過程中與細(xì)胞病變（使細(xì)胞變圓）相關(guān)[32]。最近也有研究表明IHNV的NV基因?qū)HNV在細(xì)胞中的最佳復(fù)制起著關(guān)鍵的生物作用，同時(shí)與IHNV的致病性有關(guān)[33]，但有關(guān)NV蛋白的具體作用尚有待進(jìn)一步深入的研究。

L蛋白病毒最大的結(jié)構(gòu)蛋白，也是病毒RNA依賴的RNA聚合酶，具有多種酶活性，包括核苷酸聚合活性、甲基化轉(zhuǎn)移酶和鳥苷轉(zhuǎn)移酶活性、以及多聚腺苷酸轉(zhuǎn)移酶活性等。

5牙鲆彈狀病毒檢測(cè)方法

目前，病毒的檢測(cè)方法主要有三大類，分別是細(xì)胞學(xué)診斷技術(shù)、免疫學(xué)診斷技術(shù)、分子生物學(xué)診斷技術(shù)，其中細(xì)胞學(xué)診斷技術(shù)主要包括細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒、組織病理切片及電鏡觀察，其操作復(fù)雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)且靈敏度低。免疫學(xué)診斷技術(shù)主要包括免疫熒光檢測(cè)、免疫斑點(diǎn)印跡雜交，其方法具有特異性高、靈敏度強(qiáng)等特點(diǎn)，但是過程也相當(dāng)復(fù)雜，不適宜對(duì)大量樣品的檢測(cè)。分子生物學(xué)方診斷技術(shù)主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)定量RT-PCR、環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP），利用該技術(shù)鑒定病原具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，目前應(yīng)用較為廣泛，如孫穎杰等根據(jù)G蛋白的序列建立了檢測(cè)HIRRV的RT-PCR、實(shí)時(shí)定量-PCR、LAMP方法[34]。

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