不同來(lái)源乳酸菌核苷降解能力研究

王垚，李文靜，魯茂林，張臣臣，馬文龍，顧瑞霞

（揚(yáng)州大學(xué)江蘇乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225127）

0 引 言

體內(nèi)核苷代謝紊亂導(dǎo)致尿酸產(chǎn)生過(guò)多或尿酸排泄減少時(shí)，容易引發(fā)高尿酸血癥（Hyperuricemia，HUA），嚴(yán)重影響人們健康和生活質(zhì)量[1-3]。通過(guò)嚴(yán)格的飲食控制，減少富含核苷類(lèi)食物的攝入，是治療高尿酸血癥的一種方法；也可以通過(guò)別嘌呤醇或非布索坦等西藥，抑制尿酸合成途徑中關(guān)鍵酶黃嘌呤氧化酶的活性，達(dá)到降尿酸的目的。但是由于嚴(yán)格的飲食控制，降低患者生活質(zhì)量，難以長(zhǎng)期堅(jiān)持，不能達(dá)到預(yù)期的效果[4-5]；別嘌呤醇等西藥雖然療效好，但存在較大的副作用，在臨床治療上的應(yīng)用受到一定限制；因此，探索安全、有效的降尿酸方案十分必要[6]。

乳酸菌作為腸道固有有益菌群，在食品、保健品和藥品等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，乳酸菌能夠水解、吸收食物中的核苷類(lèi)物質(zhì)，調(diào)節(jié)腸道菌群，從而減少尿酸的合成，在治療高尿酸血癥上具有藥物治療無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)[7-9]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)益生乳酸菌在輔助治療HUA方面的研究越來(lái)越多，如日本明治乳業(yè)株式會(huì)社的研究表明，格氏乳桿菌PA-3能夠胞外降解核苷，吸收核苷進(jìn)入胞內(nèi)，降低腸道對(duì)核苷類(lèi)物質(zhì)的吸收，達(dá)到降低血尿酸的效果[10-12]。但縱觀目前國(guó)內(nèi)關(guān)于降尿酸乳酸菌的研究發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)研究與日本等國(guó)差距較大，獲得高效降解能力菌株也十分有限，產(chǎn)業(yè)化更是空白，因此加大對(duì)具備降尿酸功能乳酸菌的研究，具有較大應(yīng)用價(jià)值。發(fā)酵食品和人體腸道是常見(jiàn)乳酸菌的兩種主要來(lái)源，發(fā)酵食品源乳酸菌種類(lèi)豐富，人源乳酸菌安全性相對(duì)較高，是當(dāng)今乳酸菌主要的研究方向和重點(diǎn)。由于嬰兒與老人攝入的食物結(jié)構(gòu)存在較大差異，其體內(nèi)的人源乳酸菌的種屬和功能特性也有區(qū)別。因此本研究從核苷降解率和核苷降解速率兩個(gè)方面，考察了健康嬰兒腸道、健康長(zhǎng)壽老人腸道和傳統(tǒng)發(fā)酵食品三種不同來(lái)源的共172株乳酸菌的核苷降解能力，并對(duì)其核苷降解能力之間的差異進(jìn)行分析，以期為后續(xù)篩選出核苷降解能力強(qiáng)、具備緩解高尿酸血癥的益生乳酸菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

本研究所用到的172株乳酸菌均由江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制實(shí)驗(yàn)室分離保藏，包含健康嬰兒腸道來(lái)源的乳酸菌73株，健康長(zhǎng)壽老人腸道來(lái)源的乳酸菌25株，泡菜、辣白菜、腌蘿卜和乳扇等傳統(tǒng)發(fā)酵食品來(lái)源的乳酸菌74株。

1.1.2 主要試劑

鳥(niǎo)苷、肌苷、鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶均購(gòu)自Sigma-Aldrich中國(guó)貿(mào)易有限公司。實(shí)驗(yàn)中用到的其他有機(jī)試劑、無(wú)機(jī)試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.3 主要儀器

PL2002（1/100）分析天平，Mettler Toledo；JF-SX-500全自動(dòng)滅菌鍋，TIMY；Millipore Direct 8超純水儀，Millipore；ZHJH-C1209B超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備；SPX-150BS-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械；5804R高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf；1260 Infinity高效液相色譜儀，Agilent。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

鳥(niǎo)苷-肌苷-黃嘌呤-次黃嘌呤（Guanosine-Inosine-Xanthine-Hypoxanthine，GS-IS-X-HX）標(biāo)準(zhǔn)品溶液：準(zhǔn)確稱取0.025 g鳥(niǎo)苷、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤，用20 mmol/L的KH2PO4溶液（pH 7.0）定容至50 mL，配制成GS-IS-X-HX母液，梯度稀釋得濃度分別為0.5、0.2、0.05、0.02、0.005、0.002 g/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

鳥(niǎo)嘌呤（Guanine）標(biāo)準(zhǔn)品溶液：由于常溫下0.025 g鳥(niǎo)嘌呤在50 mL的KH2PO4溶液（pH 7.0）中無(wú)法完全溶解，故配制鳥(niǎo)嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品溶液時(shí)，稱取0.0125 g鳥(niǎo)嘌呤，用20 mmol/L的KH2PO4溶液（pH 7.0）定容至50 mL，配制成鳥(niǎo)嘌呤母液，梯度稀釋得濃度分別為0.25、0.1、0.025、0.01、0.0025、0.001 g/L的鳥(niǎo)嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

鳥(niǎo)苷-肌苷（Guanosine-Inosine，GS-IS）緩沖液：準(zhǔn)確稱取鳥(niǎo)苷0.02 g、肌苷0.02 g，用20 mmol/L KH2PO4溶液（pH 7.0）定容至100 mL并調(diào)節(jié)pH至7.0，最終緩沖液中鳥(niǎo)苷濃度為0.2 g/L（0.706 mmol/L），肌苷濃度為0.2 g/L（0.746 mmol/L）。

反應(yīng)終止劑：0.1 mol/L高氯酸溶液，取571μL HClO4（70%），用超純水定容至100 mL。

1.2.2 菌株活化

將待試菌株在平板上劃線分離單菌落，挑單菌落接種至5 mL液體MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24 h，作為活化一代菌株；再將一代菌株以4%接種量轉(zhuǎn)接至5 mL液體MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，作為活化二代菌株，取活化二代菌株用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 核苷和嘌呤測(cè)定方法優(yōu)化

鳥(niǎo)苷、肌苷、鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤的含量采用高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatograph，HPLC）法檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化[10]；通過(guò)外標(biāo)法確定標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所用液相色譜儀為Agilent 1260，流動(dòng)相為等梯度20 mmol/L磷酸二氫鉀溶液（pH 3.0），流動(dòng)相優(yōu)化的過(guò)程中分別添加了1%、3%、5%和10%的甲醇，流速為1 mL/min，柱溫25°C，次黃嘌呤、黃嘌呤、肌苷、鳥(niǎo)苷的檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，腺嘌呤為263 nm，鳥(niǎo)嘌呤為273 nm，色譜柱優(yōu)化過(guò)程中選擇了ZORBAX SB-C18、Dubhe-C18和Chrom Core Polar C18。

1.2.4 核苷降解率的測(cè)定

采用磷酸鹽緩沖液體系評(píng)價(jià)不同乳酸菌對(duì)鳥(niǎo)苷和肌苷的降解率[13]。取適量活化二代菌培養(yǎng)液，室溫4 500 r/min離心3 min，棄上清，收集菌體，菌體用無(wú)菌生理鹽水（0.9%NaCl溶液）洗滌2次，向清洗后的菌體中加入1 mL GS-IS緩沖液，混合均勻，控制緩沖液中菌濃OD600為1.5，37℃靜置孵育4 h。孵育后，取1 mL菌液，于4℃，4 500 r/min離心3 min，取上清810μL，加入90μL反應(yīng)終止劑0.1 mol/L高氯酸溶液，混合均勻后4 500 r/min離心3 min，取上清液使用0.22μL水相濾膜過(guò)濾后用于HPLC檢測(cè)，分析反應(yīng)液中鳥(niǎo)苷和肌苷的減少量，以及鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤和次黃嘌呤的生成量。

1.2.5 核苷降解速率的測(cè)定

采用磷酸鹽緩沖液體系考察不同乳酸菌對(duì)核苷的降解速率[14]。選擇可以完全或者幾乎完全降解鳥(niǎo)苷和肌苷的乳酸菌株56株，在MRS培養(yǎng)基中活化后，取活化二代菌培養(yǎng)液，離心收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，重懸于含0.2 g/L鳥(niǎo)苷的磷酸鹽緩沖液中，每隔30 min取樣檢測(cè)分析鳥(niǎo)苷的剩余量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

無(wú)特殊說(shuō)明，相關(guān)實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次生物學(xué)平行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用分析軟件SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析結(jié)果用Origin繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 核苷與嘌呤檢測(cè)方法優(yōu)化

開(kāi)展乳酸菌核苷降解能力研究，首先必須建立核苷及其代謝產(chǎn)物嘌呤的檢測(cè)方法，常用HPLC測(cè)定方法。結(jié)合研究室實(shí)際條件和文獻(xiàn)報(bào)道[15-16]，本文在安捷倫1260液相色譜儀的基礎(chǔ)上，比較了3種色譜柱對(duì)于鳥(niǎo)苷、肌苷及其降解產(chǎn)物的檢測(cè)效果，檢測(cè)條件及結(jié)果如表1所示，色譜峰如圖1所示。

從表1和圖1A可以看出，反相色譜柱ZORBAX SB-C18不能有效分離鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤和腺嘌呤，反相色譜柱Dubhe-C18不能有效分離腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤，如圖1B，反相色譜柱ChromCore Polar C18可以較好的分離腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤，其出峰時(shí)間分別為6.9、7.9、9.4、12.1 min，如圖1C，而且反相色譜柱ChromCore Polar C18對(duì)肌苷和鳥(niǎo)苷的分離度也較好，出峰時(shí)間分別為24.4 min和28.7 min，但肌苷和鳥(niǎo)苷出峰時(shí)間較長(zhǎng)，影響樣品檢測(cè)效率；為進(jìn)一步縮短檢測(cè)時(shí)間，優(yōu)化了流動(dòng)相中甲醇含量，以增加反相色譜柱的洗脫能力，如圖1D所示，流動(dòng)相中添加1%甲醇，可將肌苷和鳥(niǎo)苷的出峰時(shí)間提前至17.9 min和21.6 min，繼續(xù)增加甲醇含量至3%、5%和10%（數(shù)據(jù)未列出），僅能略微提前肌苷與鳥(niǎo)苷的出峰時(shí)間，且增加檢測(cè)成本，因此確定流動(dòng)相甲醇添加量為1%。

圖1 核苷與嘌呤檢測(cè)方法優(yōu)化

表1 不同色譜柱檢測(cè)條件及分離效果

經(jīng)優(yōu)化后，選擇反相色譜柱ChromCore Polar C18，以KH2PO4(0.02 mol/L)∶甲醇=99∶1為流動(dòng)相，經(jīng)等度洗脫，可有效分離腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和鳥(niǎo)苷、肌苷，25 min即可完成一個(gè)樣品的定性檢測(cè)和定量分析。

2.2 不同來(lái)源乳酸菌核苷降解率分析

對(duì)從嬰兒腸道、長(zhǎng)壽老人腸道和發(fā)酵食品中分離獲得的172株乳酸菌的鳥(niǎo)苷和肌苷降解率進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，73株嬰兒腸道源乳酸菌中，94.5%的菌株鳥(niǎo)苷和肌苷降解率低于50%，僅4株菌的鳥(niǎo)苷和肌苷降解率為100%，占比5.5%，如圖2A；25株長(zhǎng)壽老人腸道源乳酸菌中，17株乳酸菌鳥(niǎo)苷和肌苷降解率為100%，占比為68.0%，顯著高于嬰兒腸道源乳酸菌中5.5%的比例，如圖2B；在74株傳統(tǒng)發(fā)酵食品來(lái)源的乳酸菌中，35株乳酸菌鳥(niǎo)苷和肌苷降解率為100%，占比為47.3%，高于嬰兒腸道源乳酸菌中5.5%的比例，但同樣顯著低于長(zhǎng)壽老人腸道源乳酸菌中68%的比例，如圖2C。結(jié)果表明，長(zhǎng)壽老人腸道源乳酸菌可以完全降解鳥(niǎo)苷和肌苷的概率大于傳統(tǒng)發(fā)酵食品源和嬰兒腸道源乳酸菌中的概率，更適于篩選核苷降解率高的乳酸菌。

同時(shí)，研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)3種不同來(lái)源的172株乳酸菌的鳥(niǎo)苷和肌苷降解率呈現(xiàn)強(qiáng)正相關(guān)性（r=0.989,P＜0.01），如圖2D，即鳥(niǎo)苷降解率高的菌株，其肌苷降解率也高，進(jìn)而基于Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）對(duì)不同種屬乳桿菌的核苷代謝途徑進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)乳桿菌中催化鳥(niǎo)苷、肌苷、腺苷降解的為同一個(gè)酶，嘌呤核苷磷酸化酶（purine-nucleoside phosphorylase，PNP），這從代謝水平上解釋了同一菌株鳥(niǎo)苷降解率和肌苷降解率之間的強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系。雖然本文沒(méi)有測(cè)定菌株對(duì)腺苷的降解率，但基于以上分析，可以推測(cè)腺苷降解率和鳥(niǎo)苷、肌苷降解率同樣成正相關(guān)關(guān)系，鳥(niǎo)苷、肌苷降解率高的菌株，其腺苷降解率也高。由于同一菌株的鳥(niǎo)苷和肌苷降解率呈現(xiàn)強(qiáng)正相關(guān)性，所以在考察不同來(lái)源菌株的核苷降解速率時(shí)，僅選擇以鳥(niǎo)苷降解速率為代表。

圖2 不同來(lái)源乳酸菌鳥(niǎo)苷和肌苷降解率分析

2.3 不同來(lái)源乳酸菌鳥(niǎo)苷降解速率分析

選擇上述鳥(niǎo)苷和肌苷降解率為100%的56株乳酸菌，活化后重懸于含0.2 g/L鳥(niǎo)苷的磷酸鹽緩沖液中，每隔30 min取樣檢測(cè)反應(yīng)體系中剩余的鳥(niǎo)苷含量，計(jì)算鳥(niǎo)苷降解速率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同來(lái)源乳酸菌鳥(niǎo)苷降解速率分析

從圖3可以看出，嬰兒腸道來(lái)源的4株乳酸菌中，僅1株菌在30 min內(nèi)可以完全降解鳥(niǎo)苷，降解速率大于1.40 mmol/(L·h)，其余3株菌的鳥(niǎo)苷降解速率低于1.1 mmol/(L·h)；長(zhǎng)壽老人腸道來(lái)源的17株乳酸菌中，鳥(niǎo)苷降解速率大于1.40 mmol/(L·h)的菌株共7株，占比41.2%；發(fā)酵食品來(lái)源的35株乳酸菌中，鳥(niǎo)苷降解速率大于1.40 mmol/(L·h)的菌株共7株，占比20.0%；這表明，在可以完全降解鳥(niǎo)苷、肌苷的乳酸菌中，長(zhǎng)壽老人腸道源乳酸菌鳥(niǎo)苷降解速率大于1.40 mmol/(L·h)的概率顯著高于嬰兒腸道源乳酸菌和傳統(tǒng)發(fā)酵食品源乳酸菌中相應(yīng)概率，更適于篩選核苷降解速率快的乳酸菌。

3 結(jié) 論

本文以核苷降解率和核苷降解速率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察了嬰兒腸道、長(zhǎng)壽老人腸道和傳統(tǒng)發(fā)酵食品3種不同來(lái)源乳酸菌的核苷降解能力，并比較了不同來(lái)源菌株核苷降解能力之間的差異。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，（1）長(zhǎng)壽老人腸道源乳酸菌中68.0%的菌株可以完全降解鳥(niǎo)苷和肌苷，所占比例最高，顯著高于發(fā)酵食品源（47.3%）和嬰兒腸道源乳酸菌中相應(yīng)比例（5.5%）；（2）長(zhǎng)壽老人腸道源可以完全降解鳥(niǎo)苷和肌苷的乳酸菌中，41.2%的菌株鳥(niǎo)苷降解速率大于1.40 mmol/(L·h)，所占比例同樣顯著高于發(fā)酵食品源（20.0%）和嬰兒腸道源乳酸菌中相應(yīng)比例（25.0%）；（3）3種不同來(lái)源的172株乳酸菌的鳥(niǎo)苷和肌苷降解率呈現(xiàn)強(qiáng)正相關(guān)性。這些研究結(jié)果表明，長(zhǎng)壽老人腸道源乳酸菌具有較高的核苷降解能力，嬰兒腸道源乳酸菌核苷降解能力普遍較弱，長(zhǎng)壽老人腸道源乳酸菌更適宜篩選核苷降解能力強(qiáng)、具備降尿酸潛力的益生乳酸菌，這為篩選可緩解高尿酸血癥的益生乳酸菌提供一定指導(dǎo)。