肉桂醛縮氨基脲對黃嘌呤氧化酶的抑制作用研究

余雄英，廖永翠，潘 惠，左愛仁

（江西中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院/生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌330006）

黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）是體內(nèi)尿酸生成的關(guān)鍵酶，它能催化次黃嘌呤和黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸，尿酸過多可導(dǎo)致痛風(fēng)。全球痛風(fēng)發(fā)病率與日俱增，并呈年輕化趨勢，成為第二大威脅人類生命和健康的代謝性疾病[1]，因此研發(fā)防治痛風(fēng)、高尿酸血癥的藥物成為目前醫(yī)藥界的一個研究熱點。XOD抑制劑可減少體內(nèi)尿酸生成，預(yù)防痛風(fēng)病。肉桂醛又稱桂皮醛，是斯里蘭卡肉桂油、桂皮油、藿香油、風(fēng)信子油和玫瑰油等精油的重要活性成分。肉桂醛具有殺菌消毒、抗?jié)儭⒖共《?、抗癌[2]等功能。有研究報道了肉桂揮發(fā)油和肉桂醛的體內(nèi)降尿酸和血清XOD抑制實驗[3-4]，結(jié)果顯示肉桂揮發(fā)油和肉桂醛具有較好的體內(nèi)降尿酸活性，肉桂醛體外實驗有XOD抑制活性，但活性比陽性藥別嘌醇稍弱。另外，Maria等[5]研究表明縮氨基脲類席夫堿類物質(zhì)有較強(qiáng)的XOD抑制作用?；谌夤鹑┡c席夫堿均能抑制XOD，本研究采取基團(tuán)拼合原理，合成肉桂醛縮氨基脲（cinnamic aldehyde semicarbazone）及縮氨基硫脲類席夫堿，并測定其對黃嘌呤氧化酶的抑制作用，探討其構(gòu)效關(guān)系，旨在篩選出高效低毒的黃嘌呤氧化酶的抑制劑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

氧嗪酸鉀鹽、尿酸、黃嘌呤、別嘌呤醇、黃嘌呤氧化酶：均購自美國Sigma-Aldrich公司；肉桂醛、4-甲基氨基硫脲、4-苯基氨基硫脲、氨基脲、氨基硫脲、Na2HPO4·12 H2O、NaH2PO4·2 H2O、氫氧化鈉、EDTA、DMSO：均購自上海國藥廠，分析純；尿酸測定試劑盒：購自南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號20180530；XOD測定試劑盒：購自南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號20180720。

1.2 實驗儀器

UV-2450紫外分光光度計：購自日本島津公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、精密電子天平BT25S：購自美國熱電尼高力公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE52CS-1：購自上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水式多用真空泵SHB-III：購自鄭州長城科工貿(mào)有限公司；紅外光譜儀FTIR Nicolet 5700、高分辨率四級桿-飛行時間質(zhì)譜儀Agilent 6538、核磁共振儀AV-600：均購自德國Bruker公司。

1.3 實驗動物

健康雄性昆明種小鼠40只，體質(zhì)量18～22 g：由江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物科技中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（贛）2018-003。實驗前飼養(yǎng)一周，以適應(yīng)環(huán)境。飼養(yǎng)條件：室溫（25±2）℃，相對濕度60%～70%。

1.4 實驗方法

1.4.1 肉桂醛衍生物的合成 將10 mmol氨基脲或氨基硫脲類物質(zhì)加入100 mL三頸燒瓶中，準(zhǔn)確加入15 mL無水乙醇，加熱磁力攪拌器中恒溫70℃回流10 min溶解，然后逐滴滴加10 mmol的肉桂醛，溶液逐漸變?yōu)辄S綠色，加4滴冰乙酸，回流4 h后發(fā)現(xiàn)有固體析出，冷卻至室溫后過濾，重結(jié)晶，即可得到產(chǎn)物。其中化合物a是肉桂醛縮氨基脲，cinnamic aldehyde semicarbazone，CAS；化合物b是肉桂醛縮氨基硫脲，cinnamaldehyde thiosemi-carbazide，CT；化合物c是肉桂醛縮甲基氨基硫脲，cinnamaldehyde shrinkage methyl thiosemicarbazide，CSMT；化合物d是肉桂醛縮4-苯基氨基硫脲，cinnamaldehyde shrinkage methyl thiosemicarbazide，CSMT（圖1）。

圖1 肉桂醛衍生物的合成Fig.1 Synthesis of cinnamylaldehyde derivatives

1.4.2 合成化合物的結(jié)構(gòu)表征 通過UV、IR、1HNMR、ESI-MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

UV光譜：將肉桂醛衍生物分別溶于無水乙醇，配成濃度為1×10-5mol/L的溶液，測定紫外-可見吸收光譜，測定波長為200～600 nm。

IR光譜：將肉桂醛衍生物1 mg和100 mg KBr充分研磨后壓片，在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)，掃描32次，分辨率為4 cm-1，測定肉桂醛衍生物的紅外吸收光譜。

1H-NMR：樣品10 mg加入0.5 mL氘代溶劑溶解。25℃條件下，配備5 mm PABBO探針，在Bruker DRX 400 MHz波譜儀上進(jìn)行測定，使用MestReNova軟件處理數(shù)據(jù)。參數(shù)選擇后采樣、傅立葉變換、調(diào)相位、校正零點、積分、定最大最小值、打印圖譜等步驟進(jìn)行氫譜的測量。

ESI-MS質(zhì)譜條件：ESI電噴霧離子源，負(fù)離子檢測，離子源溫度120℃。霧化器壓力206 850 Pa，干燥氣氮氣流量7L/min，溫度350℃。毛細(xì)管電壓2.5kV，錐孔電壓20 V，錐孔氣流量50 L/h，檢測電壓1 600 V。用Mass Lynx軟件處理數(shù)據(jù)。

1.4.3 化合物對XOD酶抑制機(jī)理

1）酶活性測定 在黃嘌呤氧化酶的作用下，黃嘌呤被氧化生成尿酸。實驗方法參照Cos等[6]的方法并略有修改。各化合物分別用DMSO溶解，制備樣品液。黃嘌呤氧化酶水溶液（0.2 U/mL）用超純水配制，濃度為0.15 mmol/L的黃嘌呤底物溶液用PBS緩沖溶液配制（pH 7.5）。總反應(yīng)體系3 mL，先加入PBS緩沖溶液0.85 mL，0.15 mmol/L的黃嘌呤底物溶液2 mL，再加入0.05 mL不同濃度的樣品溶液，混勻1分鐘。然后加入0.1 mL黃嘌呤氧化酶水溶液，立即搖勻，25℃水浴，于290 nm處測定酶促反應(yīng)曲線，每隔10 s測一次吸光值，持續(xù)200 s。黃嘌呤氧化酶的活性相當(dāng)于曲線線性期部分的斜率。以樣品濃度作橫坐標(biāo)，相對酶活作縱坐標(biāo)，作圖得到黃嘌呤氧化酶活性抑制曲線。重復(fù)測定3次，抑制率為：

抑制率（%）=（（S0-S1）/S0）×100%

式中：S0是無樣品組別的斜率，S1是添加樣品組別的斜率。

2）肉桂醛縮氨基脲對XOD的抑制類型 以黃嘌呤為底物，研究肉桂醛縮氨基脲抑制黃嘌呤氧化酶活性的機(jī)理，即可逆抑制或者不可逆抑制。在測活體系中，固定底物黃嘌呤濃度，依次加入肉桂醛縮氨基脲濃度0、50、75、100μmol/L，改變XOD酶的質(zhì)量濃度，測定不同濃度的抑制劑肉桂醛縮氨基脲對XOD催化氧化黃嘌呤能力的影響。以酶促反應(yīng)的速度對酶質(zhì)量濃度作圖，若得到一系列通過原點的直線，則為可逆抑制；若得到一組平行線，則為不可逆抑制。

3）肉桂醛縮氨基脲對XOD的抑制常數(shù) 參照上述酶反應(yīng)體系，以黃嘌呤為底物，研究肉桂醛縮氨基脲對黃嘌呤氧化酶活性的抑制常數(shù)。改變加入黃嘌呤的濃度，固定酶的濃度，測定不同濃度肉桂醛縮氨基脲（0、30、40、60μmol/L）抑制黃嘌呤氧化酶活性的效果。抑制類型由Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法來判斷?？v坐標(biāo)是直線的斜率或Y軸的截距，橫坐標(biāo)是各化合物濃度，作圖，可計算相應(yīng)的抑制常數(shù)（KI或KIS）[7-8]。

1.4.4 肉桂醛縮氨基脲對小鼠血尿酸質(zhì)量濃度、血清XOD活性和肝臟XOD活性的影響 參照文獻(xiàn)方法[9-10]，用氧嗪酸鉀和尿酸腹腔注射小鼠，連續(xù)2天，造成小鼠高尿酸血癥模型。雄性昆明種小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分成正常對照組、高尿酸模型組、別嘌呤醇組、肉桂醛縮氨基脲組、肉桂醛組共5組，每組10只。正常對照組和高尿酸模型組，每天按20 mL/kg劑量灌胃生理鹽水，持續(xù)6天。別嘌呤醇組每天按10 mg/kg劑量灌胃1次，持續(xù)6天。肉桂醛組、肉桂醛縮氨基脲組小鼠每天按0.1 g/kg劑量灌胃6天。從給藥第5天開始，除正常對照組外，其他各組每天灌胃前1 h均要腹腔注射0.3 g/kg氧嗪酸鉀和0.25 g/kg尿酸，每天1次，連續(xù)2天進(jìn)行造模。在第6天灌胃1 h后，小鼠進(jìn)行斷頭采血，血樣分別置于1.5 mL離心管中，在4℃冰箱中凝固2 h，在4℃下3 000 r/min離心5 min。每份血清進(jìn)行血尿酸和血清XOD活性測定。采血后，取出肝臟，勻漿處理，離心取上清，測XOD活性。

用尿酸測定試劑盒測定血尿酸質(zhì)量濃度，用試劑盒法測定小鼠血清XOD和肝臟XOD活性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，組間比較用t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)表征

化合物a（肉桂醛縮氨基脲，cinnamic aldehyde semicarbazone，CAS）：無色針晶（CH3OH）；UV（MeOH）λmax308，306 nm；IR（KBr）νmax3 282，1 644，1 604 cm-1；1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）:δ10.174（s，1H，NH）7.653（s，1H，CH=N），7.49（d，2H，Ph—H），7.345（t，2H，Ph—H），7.265（t，1H，Ph—H），6.852（d，2H，CH=CH），6.26（s，2H，NH2）；ESI-MS，m/z Mr=189.23，[M+H]+（C10H11N3O）。其IR、1H-NMR、ESI-MS數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報道一致。

化合物b（肉桂醛縮氨基硫脲，cinnamaldehyde thiosemicarbazide，CT）：淺黃色菊花晶（CH3OH）；UV（MeOH）λmax352，348 nm；IR（KBr）νmax3 262，1 592 cm-1；1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ11.350（s，1H，NH），8.123（s，1H，CH=N），7.859（d，1H，Ph—H），7.539（d，2H，NH2），7.541（d，1H，Ph—CH=），7.341（t，3H，Ph—H），6.998（d，1H，Ph—H），6.838（q，1H，=CH—）；ESI-MS，m/z Mr=205.3，[M+H]+（C10H11N3S）。其IR、1H-NMR、ESI-MS數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道一致。

化合物c（肉桂醛縮甲基氨基硫脲，cinnamaldehyde shrinkage methyl thiosemicarbazide，CSMT）：黃色粉末（CH3OH）；UV（MeOH）λmax305，358 nm；IR（KBr）νmax3 362，1 552 cm-1；1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ11.401（s，1H，NH），8.24（s，1H，CH=N），7.87（d，1H，CH=），7.521（d，2H，Ph—H），7.36（t，2H，Ph—H），7.294（t，1H，Ph—H），6.988（d，1H，CH=），6.833（m，1H，NH），2.942（d，3H，CH3）；ESI-MS，m/z Mr=219.32，[M+H]+（C11H13N3S）。

化合物d（肉桂醛縮4-苯基氨基硫脲，cinnamaldehyde shrinkage phenyl thiosemicarbazide，CSPT）：無色針晶（CH3OH）；UV（MeOH）λmax305，350 nm；IR（KBr）νmax3 313，1 594 cm-1；1HNMR（400 MHz，DMSO-d6）：δ11.79（s，1H，NH），9.89（s，1H，NH—Ph），7.98（s，1H，CH=N），6.96（dd，1H，=CH—），7.05（d，1H，Ph-CH=），7.15（d，1H，Ph—H），7.35（m，5H，Ph—H），7.58（dd，4H，Ph—H）；ESI-MS，m/z Mr=281.39，[M+H]+（C16H15N3S）。其IR、1H-NMR、ESI-MS數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道一致。

圖2 肉桂醛及其衍生物對黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of cinnamylaldehyde and its derivatives on the activity of xanthine oxidase

2.2 化合物對XOD抑制活性

肉桂醛及其席夫堿衍生物對XOD的抑制率見圖2。其中各折線依次代表抑制劑別嘌呤醇、肉桂醛縮氨基脲、肉桂醛、肉桂醛縮苯基氨基硫脲、肉桂醛縮甲基氨基硫脲、肉桂醛縮氨基硫脲。由圖2可知，同一種抑制劑，濃度越大，酶活性越低。別嘌呤醇、肉桂醛縮氨基脲、肉桂醛、肉桂醛縮苯基氨基硫脲、肉桂醛縮甲基氨基硫脲、肉桂醛縮氨基硫脲抑制XOD的IC50值分別是（7.05±0.14）、（55.48±0.54）、（90.93±0.72）、（122.48±0.65）、（201.29±0.88）、（241.57±1.32）μmol/L（n=3）。各化合物活性順序是別嘌呤醇＞肉桂醛縮氨基脲＞肉桂醛＞肉桂醛縮苯基氨基硫脲＞肉桂醛縮甲基氨基硫脲＞肉桂醛縮氨基硫脲。

肉桂醛縮氨基脲對XOD抑制活性比肉桂醛強(qiáng)，且活性接近陽性藥別嘌醇。肉桂醛縮氨基脲抑制XOD活性比肉桂醛縮氨基硫脲類化合物強(qiáng)，可能與氨基脲上的羰基能與XOD酶上的氨基酸殘基形成氫鍵，而硫脲不能形成氫鍵有關(guān)[5]。抑制XOD活性，苯基取代硫脲＞甲基取代硫脲＞硫脲。這可能與疏水性有關(guān)，苯基的疏水性最大，其次是甲基，然后是無取代基。即疏水性基團(tuán)越大，抑制活性越好。由于肉桂醛縮氨基脲抑制XOD活性最強(qiáng)，以下測定抑制機(jī)理和抑制類型就只研究肉桂醛縮氨基脲。

2.3 肉桂醛縮氨基脲對XOD抑制類型

在測活體系中，固定底物黃嘌呤濃度，改變XOD酶的質(zhì)量濃度，測定不同濃度的抑制劑肉桂醛縮氨基脲（0、50、75、100μmol/L）對XOD酶活性的影響。由圖3可知，以酶促反應(yīng)的速度對酶質(zhì)量濃度作圖，為一組通過原點的直線，由此判斷肉桂醛縮氨基脲對XOD抑制機(jī)理為可逆抑制。

圖3 肉桂醛縮氨基脲對黃嘌呤氧化酶的可逆性抑制Fig.3 Reversible inhibitory mechanism of cinnamic aldehyde semicarbazone on xanthine oxidase

2.4 肉桂醛縮氨基脲對XOD抑制常數(shù)

以黃嘌呤為底物，研究了肉桂醛縮氨基脲對黃嘌呤氧化酶活性的抑制常數(shù)。改變加入黃嘌呤的濃度，加入0.1 mL酶活為0.2 U/mL的黃嘌呤氧化酶，加入肉桂醛縮氨基脲使體系內(nèi)終濃度分別為0、30、40、60μmol/L，測定不同濃度肉桂醛縮氨基脲對酶活性的影響。抑制類型由Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法來判斷?？v坐標(biāo)是反應(yīng)速率的倒數(shù)，橫坐標(biāo)是底物濃度的倒數(shù)，作圖，試驗結(jié)果見圖4（a），顯示一組直線相交于第二象限，推測出肉桂醛縮氨基脲不僅能夠與酶底物復(fù)合物結(jié)合，還能與游離酶結(jié)合，說明肉桂醛縮氨基脲抑制黃嘌呤氧化酶活性的類型為混合型抑制作用。縱坐標(biāo)是直線斜率，橫坐標(biāo)是肉桂醛縮氨基脲濃度，作圖，可以計算出肉桂醛縮氨基脲的抑制常數(shù)KI，即抑制劑與酶的親和能力（見圖4（b））?？v坐標(biāo)是Y軸截距，橫坐標(biāo)是肉桂醛縮氨基脲濃度，作圖，可以計算出肉桂醛縮氨基脲的抑制常數(shù)KIS，即抑制劑對酶底物復(fù)合物的親和能力（見圖4（c））。試驗結(jié)果顯示，肉桂醛縮氨基脲抑制黃嘌呤氧化酶活性的類型為混合型可逆抑制，抑制常數(shù)KI為27.25μmol/L，KIS為50.30μmol/L。

2.5 肉桂醛縮氨基脲對小鼠血尿酸質(zhì)量濃度、血清XOD和肝臟XOD活性的影響

由圖5可知，模型組與正常對照組相比，造模后小鼠的血尿酸質(zhì)量濃度顯著升高（P＜0.05，n=10），表明造模成功。與模型組小鼠相比，肉桂醛縮氨基脲組小鼠的血尿酸質(zhì)量濃度降低，差異顯著（P＜0.05，n=10）?；钚皂樞蚴牵簞e嘌呤醇＞肉桂醛縮氨基脲＞肉桂醛。

由圖6可知，模型組與正常對照組相比，造模后小鼠血清XOD活性顯著升高（P＜0.05，n=10），表明造模成功。與模型組小鼠相比，肉桂醛縮氨基脲組小鼠血清XOD活性降低，差異顯著（P＜0.05，n=10）?；钚皂樞蚴牵簞e嘌呤醇＞肉桂醛縮氨基脲＞肉桂醛。

由圖7可知，模型組與正常對照組相比，造模后小鼠肝臟的XOD活性顯著升高（P＜0.05，n=10），表明造模成功。與模型組小鼠相比，肉桂醛縮氨基脲組小鼠的肝臟的XOD活性降低，差異顯著（P＜0.05，n=10）?；钚皂樞蚴牵簞e嘌呤醇＞肉桂醛縮氨基脲＞肉桂醛。

圖4 肉桂醛縮氨基脲對黃嘌呤氧化酶抑制常數(shù)的測定Fig.4 Determination of the inhibition constant of cinnamic aldehyde semicarbazone on xanthine oxidase

圖5 肉桂醛縮氨基脲對小鼠血清尿酸質(zhì)量濃度的影響Fig.5 Effect of cinnamic aldehyde semicarbazone on the concentration of serum uric acid in mice

圖6 肉桂醛縮氨基脲對小鼠血清黃嘌呤氧化酶活性的影響Fig.6 Effect of cinnamic aldehyde semicarbazone on the activity of serum xanthine oxidase in mice

圖7 肉桂醛縮氨基脲對小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性的影響Fig.7 Effect of cinnamic aldehyde semicarbazone on the activity of liver xanthine oxidase in mice

3 結(jié) 語

作者研究了肉桂醛縮氨基脲對黃嘌呤氧化酶的抑制作用。合成、表征了肉桂醛縮氨基脲，以黃嘌呤為底物，測定了肉桂醛縮氨基脲對黃嘌呤氧化酶活性的IC50、抑制類型和抑制常數(shù)。研究了肉桂醛縮氨基脲對小鼠血尿酸質(zhì)量濃度、血清XOD活性和肝臟XOD活性的影響。肉桂醛縮氨基脲對黃嘌呤氧化酶活性抑制效果顯著，IC50為55.48μmol/L，是混合型可逆抑制，抑制常數(shù)KI為27.25μmol/L，KIS為50.30 μmol/L。與模型組相比，肉桂醛縮氨基脲能顯著降低小鼠血尿酸質(zhì)量濃度、血清XOD活性和肝臟XOD活性，差異顯著（P＜0.05，n=10）?；钚皂樞颍簞e嘌呤醇＞肉桂醛縮氨基脲＞肉桂醛?？傊?，肉桂醛縮氨基脲對黃嘌呤氧化酶活性抑制效果顯著，能顯著降低小鼠血尿酸質(zhì)量濃度、血清XOD活性和肝臟XOD活性，是降低尿酸、防治痛風(fēng)的候選藥物。