酶促水解斯替夫苷制甜茶苷及其反應(yīng)路徑解析

周卓愉，夏詠梅*

（1.江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122）

甜茶苷（Rubusoside，13-O-β-glucosyl-19-Oβ-D-glucosyl-steviol，Ru）是一種稀少的天然甜味劑，少量存在于我國特有珍稀植物甜茶中[1-2]，產(chǎn)量較低且受氣候、產(chǎn)地等因素影響。目前尚無化學(xué)全合成甜茶苷的報道。由于斯替夫苷（Stevioside，13-O-β-sophorosyl-19-O-β-D-glucosyl-steviol，St）與甜茶苷的結(jié)構(gòu)相似性（甜茶苷僅在C13位比斯替夫苷少一個β-1，2連接的葡萄糖基），已有許多關(guān)于酶法催化水解斯替夫苷制備甜茶苷的報道（表1）。然而，目前的研究尚有一些未決問題，例如甜茶苷的產(chǎn)率較低、副產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及反應(yīng)路徑不明等。

斯替夫苷具有3個以β-糖苷鍵鏈接的葡萄糖殘基，酶催化反應(yīng)下葡糖基單元的連續(xù)水解及重排可能產(chǎn)生：甜茶苷、甜菊雙糖苷、甜菊醇單葡萄糖酯、甜菊單糖苷或甜菊醇[9]（圖1）。目前對于甜菊糖苷的鑒定，通常僅采用HPLC以及LC-MS確定相對分子質(zhì)量以及保留時間。然而，互為同分異構(gòu)體的甜菊糖苷在HPLC中具有近似甚至相同的保留時間，僅上述表征手段無法明確副產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。

酶對不同糖苷鍵的特異性水解決定了副產(chǎn)物中葡萄糖基的連接方式。例如相對分子質(zhì)量為480的單葡萄糖基甜菊醇，其可能的結(jié)構(gòu)為甜菊單糖苷（葡萄糖基接于C-13位）或甜菊醇單葡萄糖酯（葡萄糖基接于C-19位），其可能是斯替夫苷直接水解產(chǎn)生的一級水解產(chǎn)物亦可能是甜茶苷進一步水解產(chǎn)生的二級產(chǎn)物。明確產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及反應(yīng)方式有助于進一步了解酶的催化反應(yīng)機理。

本研究首次確定了β-葡萄糖苷酶水解斯替夫苷產(chǎn)生的副產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及其生成方式，明確解析出β-葡萄糖苷酶催化水解斯替夫苷的反應(yīng)路徑。

表1 已報道的斯替夫苷水解制甜茶苷研究Table 1 Reported studies on hydrolysis of stevioside to rubusoside

圖1 斯替夫苷可能的水解產(chǎn)物Fig.1 Possible hydrolysis products of stevioside

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

來自Aspergillusniger的β-葡萄糖苷酶（ATCC?16404，39 000 U/g）：由江南大學(xué)吳敬教授提供；斯替夫苷（97%，HPLC）：由諸城市浩天藥業(yè)有限公司提供；乙腈（HPLC）：購自O(shè)ceanpak（瑞典）；甲醇、乙酸、乙酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鐵、氯化銅、硝酸銀、氯化鎂、氯化鋇、氯化鉀：均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司（上海）。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀（Waters Acquity UPLC和Waters Maldi Synapt Q-TOF MS）：美國Waters公司產(chǎn)品；高效液相色譜儀2695（二極管陣列檢測器996，Masslynx色譜工作站）：美國Waters公司產(chǎn)品；KQ 22000型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；EL 204電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；葡萄糖生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所產(chǎn)品；核磁共振儀（Bruker Avance III 600）：德國布魯克公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 β-葡萄糖苷酶催化水解斯替夫苷 在50 mL錐形瓶中加入20 mL斯替夫苷溶液（質(zhì)量濃度為100 g/L），在60℃下保溫30 min。加入1%底物質(zhì)量的β-葡萄糖苷酶，60℃水浴中振蕩（150 r/min）反應(yīng)24 h。定時取樣，用等體積甲醇終止反應(yīng)。用葡萄糖生物傳感分析儀測定不同時間反應(yīng)液中葡萄糖質(zhì)量濃度，斯替夫苷轉(zhuǎn)化率、甜茶苷產(chǎn)率計算如下：

式中：C0是反應(yīng)液中St的初始質(zhì)量濃度（g/L），Ct是t時刻反應(yīng)液中St的質(zhì)量濃度（g/L），CRu是反應(yīng)液中Ru的質(zhì)量濃度（g/L）；M WRu=642，M WSt=804，分別為Ru和St的摩爾質(zhì)量。以斯替夫苷標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出反應(yīng)液中St與Ru的質(zhì)量濃度。

1.3.2 水解產(chǎn)物的分離與結(jié)構(gòu)表征 1.3.1中所得反應(yīng)液各組分的相對分子質(zhì)量通過液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀（Waters Acquity UPLC和Waters Maldi Synapt Q-TOF MS）進行鑒定。檢測條件 為：BEH HILIC色 譜 柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫45℃；流動相組成：流動相A（80%乙腈+0.1%氨水，體積分?jǐn)?shù)），流動相B（30%乙腈+0.1%氨水，體積分?jǐn)?shù)）；梯度洗脫：0～10 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)為80%；10～20 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)從80%線性減至60%；20～26 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)為60%；26～27 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)從60%線性增至100%；27 min，流動相A體積分?jǐn)?shù)為100%，流速為0.3 mL/min；進樣量1μL，進樣質(zhì)量濃度1 mg/mL。質(zhì)譜條件：碰撞電壓6 V，錐孔電壓20 V，離子化方式為電噴霧電離（ESI），離子源溫度100℃，負(fù)離子檢測模式，相對分子質(zhì)量范圍為200～2 000。

通過制備TLC純化水解產(chǎn)物，得相對分子質(zhì)量為480與1 128的化合物（用Waters Maldi Synapt Q-TOF MS鑒定）。洗脫劑為正丁醇∶乙酸乙酯＝4∶1（體積比）的水飽和溶液。純化所得水解產(chǎn)物溶解于氘代甲醇，用Bruker Avance III 600核磁共振儀，分別在600和151 MHz下記錄1H-NMR和13C-NMR譜。用液氦冷凍探針于25℃下測試。所有化學(xué)位移以氘代甲醇的1H（3.3）和13C（47.6）為基準(zhǔn)。

1.3.3 斯替夫苷水解條件優(yōu)化 采用單因素法考察溫度、pH、金屬離子、底物濃度、加酶量、反應(yīng)時間及加酶方式對β-葡萄糖苷酶水解斯替夫苷的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析

如圖2所示，在β-葡萄糖苷酶的催化下，斯替夫苷水解成相對分子質(zhì)量分別為642與480的化合物，即二者分別比斯替夫苷少1個或2個葡萄糖基。用NMR分析純化后的產(chǎn)物，二者的核磁1H和13C譜見圖3、圖4，水解主產(chǎn)物的質(zhì)子化學(xué)位移匯總于表2。主水解產(chǎn)物（相對分子質(zhì)量為642）的HMBC圖譜（支撐材料圖S1）有明顯的葡萄糖H1與甜菊醇骨架13位、19位上C的耦合信號峰，可以確定兩個葡萄糖基分別連接在C13與C19位上，排除甜菊雙糖苷的可能，確定主水解產(chǎn)物是甜茶苷。副水解產(chǎn)物（相對分子質(zhì)量為480）的化學(xué)位移通過對照文獻報道值[10]，確定其結(jié)構(gòu)為甜菊醇單葡萄糖酯。

2.2 水解反應(yīng)條件優(yōu)化

前期實驗表明，β-葡萄糖苷酶具有高效特異性水解斯替夫苷制備甜茶苷的能力（數(shù)據(jù)未發(fā)表）；為便于工業(yè)化，進一步研究了該反應(yīng)的最適條件，如圖5所示。該酶的催化活性對溫度較為敏感，在60℃，pH為5時具有最強催化活性（圖5（a）、（b））；考慮到在純水相中反應(yīng)速度與pH為5時相近，且不會引入用于調(diào)節(jié)pH所需的化合物，后續(xù)試驗均用純水相作為反應(yīng)介質(zhì)。Fe3+、Ag+、Cu2+對反應(yīng)有明顯抑制效果（圖5（c））；可能是這些金屬離子與酶形成配位鍵，從而影響了酶的活性，因此在生產(chǎn)中應(yīng)盡量避免這類金屬離子的混入。底物濃度不會影響水解反應(yīng)的速率，表明在此濃度范圍內(nèi)，水解反應(yīng)不存在底物抑制作用（圖5（d））。底物質(zhì)量濃度為200mg/mL時，加酶量為300 U/g底物，反應(yīng)24 h后St轉(zhuǎn)化率為98.2%，Ru的產(chǎn)率為90.8%；當(dāng)加酶量為800 U/g底物，反應(yīng)12 h后St的轉(zhuǎn)化率達98.8%，Ru的產(chǎn)率為9 0.4%。增大加酶量不會明顯改變S t的轉(zhuǎn)化率及R u的產(chǎn)率。水解反應(yīng)是一個平衡反應(yīng)，為了盡可能減少副產(chǎn)物的生成，可在S t轉(zhuǎn)化率達4 0%左右時移去甜茶苷（圖5（e）、（f））。受S t溶解度限制，難以在反應(yīng)溫度下配制高濃度的S t溶液用于工業(yè)生產(chǎn)，而產(chǎn)物R u作為一種增溶劑，不僅自身溶解度高，并且能有效提高S t在水中的溶解度，如圖5（g）所示，采用流加S t的方式，最高可實現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 5%的S t制備R u，有利于工業(yè)上R u大規(guī)模生產(chǎn)。

圖3 主水解產(chǎn)物的1H-NMR譜和13C-NMR譜Fig.3 1H-NMR and 13C-NMR profiles of the main hydrolysis product

圖4 副水解產(chǎn)物的1H-NMR譜和13C-NMR譜Fig.4 1H-NMR profile and 13C-NMR profile of the minor hydrolysis product

表2 水解主產(chǎn)物的化學(xué)位移Table 2 Chemical shifts of the main hydrolysis product

圖5 黑曲霉β-葡萄糖苷酶催化水解斯替夫苷反應(yīng)條件優(yōu)化Fig.5 Single factor test on production of Ru from St with theβ-glucosidase from Aspergillus niger

2.3 水解途徑確定

通過實時檢測反應(yīng)液中的游離葡萄糖含量，以及對甜茶苷的單獨酶促水解實驗，來進一步確定反應(yīng)過程，特別是副產(chǎn)物甜菊醇單葡萄糖酯的生成方式。由圖6（a）、（b）可知，β-葡萄糖苷酶不能催化甜茶苷的水解；由此可推斷：原水解反應(yīng)體系中的甜菊醇單葡萄糖酯是由St直接水解得到。圖6（c）中St水解時溶液中游離葡萄糖含量與理論值的差值歸因于副產(chǎn)物甜菊醇單葡萄糖酯的生成。

圖6 St水解途徑的確定Fig.6 Determination of St hydrolysis pathway

3 結(jié)語

關(guān)于水解斯替夫苷制備甜茶苷已有一系列報道，然而尚無對水解反應(yīng)的具體副產(chǎn)物及反應(yīng)過程的解析。本研究采用來自Aspergillus niger的β-葡萄糖苷酶高效特異性水解斯替夫苷。通過過程分析，確定主要的水解產(chǎn)物為甜茶苷，副產(chǎn)物為甜菊醇單葡萄糖酯。在加酶量為800 U/g底物時，僅12 h，斯替夫苷的轉(zhuǎn)化率就可達98.8%，產(chǎn)率為90.1%。該水解反應(yīng)無底物抑制作用，連續(xù)加酶有利于工業(yè)上甜茶苷的高通量生產(chǎn)。同時，明確了β-葡萄糖苷酶水解斯替夫苷的水解過程，有利于對該酶催化反應(yīng)機理的進一步認(rèn)識。