海參花成分分析及對小鼠認(rèn)知辨別能力的影響

陸 濤，張軍偉，唐 雪，周 鵬*，夏旭斌，胡 煒

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122；3.山東好當(dāng)家海洋發(fā)展股份有限公司，山東 威海264200）

學(xué)習(xí)和記憶是大腦的重要功能之一。阿爾茲海默病（Alzheimer disease；AD）是目前最常見的神經(jīng)退行性疾病之一。它會讓人們的學(xué)習(xí)和記憶能力退化，理解和表達(dá)能力下降，導(dǎo)致癡呆等認(rèn)知障礙，嚴(yán)重影響人們的工作和生活?！妒澜绨柎暮Ｄ?015報告》指出，到2050年，全球該病患者數(shù)量將從4 680萬增加至1.315億[1]。AD最明顯的病理學(xué)特征為：β-淀粉樣蛋白（β-amyloid；Aβ）[2]沉積在神經(jīng)元細(xì)胞周圍，最終形成的老年斑和神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)微管蛋白（Tau）過度磷酸化，導(dǎo)致神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles；NFTs）[3]。二者最終會導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和突觸功能的喪失。但AD的發(fā)病機(jī)制并沒有完全被解釋清楚，主要有如下幾種學(xué)說：膽堿能系統(tǒng)障礙[4]、氧化應(yīng)激[5]、免疫和炎癥反應(yīng)[6]、線粒體功能紊亂[7]、遺傳與基因突變[8]、腦內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)[9]。基于上述學(xué)說開發(fā)出了各種治療藥物，如膽堿酶抑制劑他克林[10]、多奈哌齊[11]、利斯的明[12]，NMDA受體拮抗劑美金剛[12]，大腦代謝調(diào)節(jié)劑尼麥角林[13]、吡拉西坦[14]，抗炎藥吲哚美辛[15]、萘普生，其他還有一些自由基清除劑和抗氧化劑[16]等保護(hù)神經(jīng)的藥物目前也引起了人們的關(guān)注。這些藥物在一定程度上緩解了AD病情的發(fā)展。

海參是一種珍貴的海洋資源，其體內(nèi)含有蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、海參多糖、皂苷、磷脂。目前關(guān)于海參改善記憶的研究也有報道。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)：源自刺參的肽能通過免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用來改善小鼠在Y迷宮和Morris水迷宮的表現(xiàn)。Lin等[18]也發(fā)現(xiàn)：海參酶解后通過超濾純化得到的多肽產(chǎn)物可抑制小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化和蛋白質(zhì)氧化水平，同時還下調(diào)了腦部乙酰膽堿酯酶（AchE）的表達(dá)。Li等[19]對大鼠灌胃40 mg/kg海參腦苷脂27 d后，大鼠腦部神經(jīng)元的損傷和細(xì)胞凋亡被明顯抑制。海參花屬于海參的內(nèi)臟，主要是海參的卵。目前國內(nèi)外對海參花的研究鮮見報道。海參加工過程中海參花大多作為加工副產(chǎn)物被丟棄，使海參花含有的活性因子和營養(yǎng)成分不被利用。市場上人們也主要食用海參體壁。這些都造成了較大浪費。成分分析測得：海參花蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，為（62.08±0.83）%。其含有的氨基酸種類豐富，有19種。其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的是谷氨酸和天冬氨酸，兩者是腦內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)[20]。海參花還含有不飽和脂肪酸，在抑制炎癥反應(yīng)方面有一定效果。張婕等[21]研究發(fā)現(xiàn)海參花還具有抗氧化作用，小鼠灌胃海參花后，其性腺內(nèi)的超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）明顯升高，脂質(zhì)過氧化水平明顯降低（MDA）。此外海參花還含有多糖、釩等其他珍貴的活性成分。因此海參花具有很大的開發(fā)、應(yīng)用價值。

常用的記憶損傷模型有：Aβ模型[22]、東莨菪堿模型[23]、D-半乳糖模型[24]、轉(zhuǎn)基因模型[25]、正常衰老模型[26]和血管性癡呆模型[27]。本研究選用東莨菪堿模型，相比其他造模方法更加便捷和經(jīng)濟(jì)。東莨菪堿是一種毒蕈堿膽能受體（M受體）拮抗劑。它能夠阻滯乙酰膽堿與受體結(jié)合，降低腦內(nèi)乙酰膽堿的含量，從而導(dǎo)致膽堿能功能障礙和認(rèn)知障礙，使得小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降。Goverdhan等[28]發(fā)現(xiàn)對小鼠連續(xù)9 d腹腔注射1.4 mg/kg東莨菪堿后會誘發(fā)腦內(nèi)氧化應(yīng)激。Demirci等[29]發(fā)現(xiàn)對大鼠連續(xù)14 d腹腔注射1 mg/kg東莨菪堿后，大鼠腦部和血漿的脂質(zhì)過氧化水平（MDA）以及血漿的腫瘤壞死因子-α（TNF-α），白介素-1β（IL-1β）和白介素-4（IL-4）的水平比空白組均有所升高。此外東莨菪堿還增加了大鼠腦部凋亡基因的表達(dá)，如半胱天冬酶-3（caspase-3），半胱天冬酶-9（caspase-9）和DNA修復(fù)酶（poly ADP-ribose polymerase；PARP）。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

70只3周齡SPF級雄性ICR小鼠：購自海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司；海參花凍干粉：購自山東好當(dāng)家海洋發(fā)展股份有限公司；氫溴酸東莨菪堿：購自阿拉丁試劑（上海）有限公司;吡拉西坦片：購自東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司；氯化鈉注射液：購自安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司；動物飼料：江南大學(xué)動物實驗中心提供。

1.2 儀器與設(shè)備

曠場實驗裝置、新物體識別裝置、Y迷宮裝置、Morris水迷宮裝置、避暗裝置：均由江南大學(xué)動物實驗中心提供；行為學(xué)分析軟件EthoVision XT：荷蘭Noldus公司產(chǎn)品；分析天平：梅特勒托利多國際貿(mào)易上海有限公司產(chǎn)品；Agilent 1260高效液相色譜儀：美國安捷倫公司產(chǎn)品；氣質(zhì)聯(lián)用儀四極桿質(zhì)譜：美國布魯克公司產(chǎn)品；凱氏定氮儀：上海晟聲自動化分析儀器有限公司產(chǎn)品；超低溫冷凍冰箱：美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；臺式離心機(jī)：德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.3實驗方法

1.3.1 成分測定 水分測定按照GB5009.3-2016《食品中水分的測定》第一法直接干燥法；蛋白質(zhì)測定按照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》第一法凱氏定氮法；游離脂肪和總脂肪測定分別按照GB 5009.6-2016《食品中脂肪的測定》第一法索氏抽提法和第二法酸水解法；鹽分測定按照SC/T 3011-2001《水產(chǎn)品中鹽分的測定》直接滴定法；多糖的測定按照苯酚硫酸法[30]；灰分測定按照GB 5009.4-2016《食品中灰分的測定》第一法食品中總灰分的測定；氨基酸測定按照GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》；色氨酸采用GB/T 18246-2000堿水解法前處理，高效液相色譜法測定；脂肪酸測定按照GB 5009.168-2016《食品中脂肪酸的測定》完成樣品前處理后，用氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）測定。

1.3.2 動物分組及模型建立 70只雄性SPF級ICR小鼠經(jīng)過一周自由采食適應(yīng)性飼養(yǎng)后，按體質(zhì)量分為6組[31-32]：空白組、東莨菪堿模型組、吡拉西坦陽性組、海參花低劑量組、海參花中劑量組和海參花高劑量組。其中空白組和模型組每組15只，其他組別每組10只?？瞻捉M和模型組每日灌胃生理鹽水，陽性組按400 mg/kg劑量灌胃吡拉西坦。海參花低、中、高3個組劑量分別為75、150、450 mg/kg。灌胃體積為10 mL/kg。每日灌胃30 min后，除空白組腹腔注射生理鹽水，其他組別均腹腔注射1 mg/kg的東莨菪堿，注射體積為10 mL/kg。30 d后進(jìn)行行為學(xué)實驗。第1天進(jìn)行曠場實驗，緊接著第2天和第3天進(jìn)行新物體識別實驗，休息5 d后進(jìn)行Y迷宮實驗，再休息5 d后進(jìn)行Morris水迷宮實驗，最后休息6 d后進(jìn)行避暗實驗。行為學(xué)實驗在開始前1 h灌胃受試樣品，開始前30 min腹腔注射東莨菪堿。整個實驗周期中一直給小鼠灌胃受試樣品。

1.3.3 行為學(xué)實驗方法

1）曠場實驗[33]（open filed test）主要用于評價小鼠的自發(fā)活動行為和探索行為。曠場裝置由一個40 cm×40 cm×50 cm的實驗箱組成，上方有紅外攝像頭追蹤小鼠的路徑。底部的測試區(qū)被分為16塊10 cm×10 cm正方形，中間4塊被定義為中心區(qū)。每只小鼠從曠場中心點放下，自由活動10 min。每次實驗結(jié)束后用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇擦拭實驗箱以消除氣味的影響。記錄小鼠的速度、路程、中心區(qū)域的活動時間等指標(biāo)。

2）新物體識別實驗[34]（object recognition test）是利用嚙齒類動物天生喜歡探索新事物的特點建立的一種學(xué)習(xí)記憶評價方法。它主要分為：適應(yīng)期、熟悉期和測試期。每個時期間隔24 h。在適應(yīng)期將小鼠放入實驗箱內(nèi)，自由探索環(huán)境8 min。在熟悉期，箱內(nèi)有兩個完全相同的的圓柱積木（底部直徑4 cm；高度10 cm），積木擺放的位置距兩邊的墻角分別為5 cm。小鼠在箱內(nèi)自由探索8 min。24 h后將其中一個圓柱體積木替換為圓錐體積木（底部直徑4 cm；高度10 cm），再次讓小鼠自由活動8 min。小鼠在放入箱內(nèi)時背對著積木，從積木對面墻面的中心點放下。每次實驗結(jié)束后用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇擦拭實驗箱以消除氣味的影響。實驗期間由紅外攝像頭追蹤記錄小鼠對新、舊物體探索的時間。評價指標(biāo)用辨別指數(shù)（DI）來計算，DI=（新物體探索時間-舊物體探索時間）/總探索時間。

3）Y迷宮[35]主要用于評價嚙齒類動物的工作記憶。實驗裝置由3個夾角各呈120°的水平臂組成。實驗期間任意定義3個臂分別為A、B、C。實驗開始后將小鼠從任意一個臂內(nèi)放下，紅外攝像頭記錄小鼠進(jìn)入每個臂的順序和次數(shù)。定義連續(xù)進(jìn)入不同的臂為一次交替（如ABC、BAC、CBA，而不是BAB）。評價Y迷宮的指標(biāo)為：自發(fā)交替=交替數(shù)/（進(jìn)入臂的總次數(shù)-2）。每次測試時間為5 min，每次實驗結(jié)束后用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇擦拭實驗箱以消除氣味的影響。

4）Morris水迷宮[36]是評估嚙齒類動物空間記憶最經(jīng)典的方法之一。實驗裝置由一個直徑120 cm，高60 cm的水池組成。水池按照東、南、西、北被分為4個象限。實驗期間，水池放入40 cm深的水，并用黑色墨汁染黑。水溫維持在(21±1)℃。實驗分為：臺可見期、定位航行期和空間探索期3個時期。

第1天為平臺可見期，平臺高出水面1 cm，同時放置一面旗幟以增加可視度。水池的四周貼上不同的標(biāo)識物，供小鼠參考方向。實驗開始后，將小鼠面朝池壁從平臺順時針一邊的象限放入，上方紅外攝像頭追蹤小鼠的運動軌跡。測試時間為60 s，小鼠在測試時間內(nèi)找到平臺的時間，即為逃避潛伏期。若超過測試時間，逃避潛伏期則記為60 s。每只小鼠進(jìn)行4次訓(xùn)練，每次訓(xùn)練更換平臺所在的象限位置。

第2天起進(jìn)行定位航行實驗，平臺固定在水下1 cm處，且在一個象限內(nèi)不移動。實驗開始后，將小鼠面朝池壁從其中一個象限放入，上方紅外攝像頭追蹤小鼠的運動軌跡。測試時間為60 s，小鼠在測試時間內(nèi)找到平臺的時間，即為逃避潛伏期。若超過測試時間，逃避潛伏期則記為60 s。未找到平臺的小鼠需要引導(dǎo)它找到平臺并在上面待滿15 s。每只小鼠訓(xùn)練4次，每次從不同的象限放入，連續(xù)訓(xùn)練5 d。

第7天起進(jìn)行空間探索實驗，將平臺從水池撤掉。將小鼠從原先平臺所在象限的對角處面朝池壁放入。測試時間為60 s，記錄小鼠的速度、潛伏期、路程、穿臺次數(shù)等指標(biāo)。

5）避暗實驗[37]又稱被動回避實驗（passive avoidance），是利用小鼠趨暗避明的特點設(shè)計的實驗方法。該實驗常用于檢測條件性恐懼記憶，適合檢測小鼠記憶再現(xiàn)過程。裝置由一個暗室和一個明室組成，兩室中間有一扇小門可通過。底部鋪滿銅柵，暗室的銅柵可通電，電壓為36 V，電流為0.2～0.3 mA。小鼠進(jìn)入暗室一次則記為犯錯一次。實驗分為學(xué)習(xí)訓(xùn)練期和記憶保持測試期。訓(xùn)練前，先將小鼠放入避暗箱內(nèi)自由活動3 min以適應(yīng)環(huán)境。

學(xué)習(xí)階段：將小鼠背朝暗室放入明室，此時暗室通電，并開始計時。小鼠從明室進(jìn)入暗室的時間為潛伏期。整個訓(xùn)練期為5 min，記錄每只小鼠的第一次潛伏期和整個實驗中的犯錯次數(shù)。

24 h后同一時間段進(jìn)行記憶保持測試。斷開暗室的電流，測試時間為3 min，其他條件與訓(xùn)練期的相同。每次實驗結(jié)束后，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇擦拭實驗箱以消除氣味的影響。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果均表示為（X±SD）。采用IBM SPSS Statistics 23.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布和方差齊次后，采用單因素方差分析（ANOVA）。組間有差異時采用Tukey檢驗進(jìn)行組間比較。當(dāng)數(shù)據(jù)不滿足方差齊次時，通過數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換來滿足齊次。若轉(zhuǎn)換后仍然不滿足方差齊次，則采用Tamhane’s T2檢驗。組間差異顯著水平為P＜0.05，極顯著水平為P＜0.01。

2 結(jié)果分析

2.1 海參花基本成分組成

由表1可知海參花是一種蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高、脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)低的食物。其蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)（62.08±0.83）%。

表1 海參花基本成分組成Table 1 Components of sea cucumber ovum

2.2 海參花氨基酸組成

由表2可知，海參花氨基酸種類豐富，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的是谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）。Glu和Asp是腦部的興奮性氨基酸，在神經(jīng)元信息傳遞中起著重要的作用。此外，有研究表明海參多肽具有抗氧化、降血壓、降血糖、抗疲勞、改善記憶等多種功能，而這些功能機(jī)制又與多肽的氨基酸組成、氨基酸序列和空間構(gòu)象有關(guān)[38-39]。

Rupsingh等[40]研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦部的Glu含量比正常老年人腦部的含量低，這表明海馬體內(nèi)Glu減少可能是AD的一種特征。Hosseini等[41]研究發(fā)現(xiàn)Arg可以延長大鼠在避暗實驗中的潛伏期并改善機(jī)體的氧化應(yīng)激水平。景洪江等[42]用添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%Gln的飼料喂養(yǎng)大鼠2周后。大鼠的主動回避反應(yīng)率顯著增加，被動逃避時間縮短，腦中Glu、Asp、Gln、Arg含量增加。

表2 海參花氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of sea cucumber ovum

2.3 海參花脂肪酸組成

由表3可知，海參花脂肪酸中飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為30%，不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為70%。脂肪酸占比最多的是棕櫚油酸（palmitoleic acid）。Souza等[43]研究發(fā)現(xiàn)棕櫚油酸可改善小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子的基因表達(dá)。目前已知ω-3脂肪酸可以促進(jìn)大腦發(fā)育，提高人的記憶力。海參花中含有的ω-3脂肪酸主要為二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid；EPA）。Kawashima等[44]研究發(fā)現(xiàn)EPA能顯著增加神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)EPA含量以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)DHA的含量。同時EPA可以通過調(diào)節(jié)突觸可塑性和激活PI3-K/Akt途徑來預(yù)防神經(jīng)退行性變。

表3海參花脂肪酸組成Table 3 Fatty acid composition of sea cucumber ovum

2.4 曠場實驗結(jié)果

由表4可知小鼠在注射東莨菪堿30 min后，活動量增加了。其他組別與空白組相比，路程顯著增加（P＜0.01），速度顯著提高（P＜0.01）。SAHBA等[32]的研究也發(fā)現(xiàn)，東莨菪堿會增大小鼠的活動量，使小鼠情緒上變得焦慮。東莨菪堿對大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用，但對呼吸系統(tǒng)有興奮作用。模型組在中心區(qū)域停留的時間比空白組顯著降低（P＜0.01），中心區(qū)域停留時間的占比顯著減少（P＜0.01）。而海參花對此結(jié)果有一定改善作用。其中海參花低劑量組與模型組相比，中心區(qū)域停留時間顯著提高（P＜0.05），中心區(qū)域停留時間的占比顯著增加（P＜0.05）。而陽性組在曠場實驗中效果并不明顯，只是有一定改善趨勢。如圖1所示，與空白組相比，模型組的活動軌跡主要集中在曠場周圍，自發(fā)探索活動大大減少。海參花組的活動軌跡與模型組相比更傾向于中心區(qū)域。綜上所述，海參花能夠增加小鼠的探索行為，可能在抗焦慮方面也有一定改善作用。

表4 海參花對小鼠自發(fā)活動和探索行為的影響Table 4 Effect of sea cucumber ovum on spontaneous activity and exploration behavior in mice

圖1 海參花對小鼠軌跡線路的影響Fig.1 Effect of sea cucumber ovum on mouse trajectory

2.5 新物體識別實驗結(jié)果

由表5可知：與空白組相比，模型組的辨別指數(shù)顯著降低（P＜0.01），這表明東莨菪堿明顯降低了小鼠的學(xué)習(xí)和認(rèn)知記憶能力。而海參花低劑量組顯著提高了辨別指數(shù)（P＜0.05），海參花中劑量組和高劑量組也有提高的趨勢，但無顯著性差異。陽性組也顯著提高了小鼠的辨別指數(shù)（P＜0.05），略低于海參花低劑量組。綜上所述，海參花能改善東莨菪堿造成的小鼠學(xué)習(xí)能力和認(rèn)知記憶的損傷。

2.6 Y迷宮實驗結(jié)果

由表6可知：與空白組相比，模型組自發(fā)交替顯著降低（P＜0.01）。這表明東莨菪堿會損傷小鼠的工作記憶和參考記憶。海參花低劑量組（P＜0.01）和中劑量組（P＜0.05）顯著提高了小鼠的自發(fā)交替。陽性組表現(xiàn)最好，也顯著提高了小鼠的辨別指數(shù)（P＜0.01）。綜上所述，海參花能夠改善東莨菪堿對小鼠工作記憶和參考記憶的損傷。

表5 海參花對小鼠辨別指數(shù)的影響Table 5 Effect of sea cucumber ovum on mouse discrimination index

表6 海參花對小鼠自發(fā)交替的影響Table 6 Effect of sea cucumber ovum on spontaneous alternation in mice

2.7 Morris水迷宮實驗結(jié)果

2.7.1平臺可見期實驗結(jié)果 可見期實驗是為了排除小鼠在游泳能力、視覺能力上的差異，這些因素與水迷宮的指標(biāo)有很大關(guān)系。由表7可知：各組小鼠在逃避潛伏期、路程、速度上均無顯著性差異。說明各組小鼠的視力和游泳能力沒有差別。

2.7.2 定位航行實驗結(jié)果 由表8可知：隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，小鼠找到平臺的速度越來越快，逃避潛伏期越來越短。到第五天訓(xùn)練時，與空白組相比，模型組的逃避潛伏期較大，但沒有出現(xiàn)顯著性差異。海參花組有降低逃避潛伏期的趨勢，但無顯著性差異。

2.7.3 空間探索實驗結(jié)果 由表9可知：在速度沒有顯著差異的條件下，模型組的逃避潛伏期比空白組顯著增加（P＜0.01），海參花低劑量組（P＜0.01）和高劑量組（P＜0.05）與模型組相比，顯著降低了逃避潛伏期。模型組在平臺區(qū)域累計時間（P＜0.01）和穿越次數(shù)（P＜0.01）也比空白組顯著減少。海參花低劑量和高劑量顯著增加了小鼠在平臺區(qū)域的累計時間（P＜0.05）。平臺區(qū)域穿越次數(shù)：海參花低劑量組較模型組顯著增加（P＜0.05），海參花中劑量組和高劑量組均有增加的趨勢，但無顯著性差異。平臺穿越次數(shù)：模型組比空白組少，海參花組相比模型組有改善趨勢，但無顯著性差異。陽性組在整個實驗中，與模型組相比差別不大，僅有一點改善趨勢。結(jié)合圖2能夠更加直觀地看出上述結(jié)果。綜上所述，海參花能改善東莨菪堿導(dǎo)致的小鼠空間記憶損傷。

表7 平臺可見期實驗結(jié)果Table 7 Platform visible period experiment results

表8 海參花對小鼠定位航行逃避潛伏期的影響Table 8 Effect of sea cucumber ovum on training escape latency of mice

表9 海參花對小鼠在空間探索實驗中的影響Table 9 Effect of sea cucumber ovum on mice in space exploration experiments

圖2 海參花對小鼠空間探索軌跡的影響Fig.2 Effect of sea cucumber ovum on trajectory of space exploration in mice

2.8 避暗實驗結(jié)果

除了上述的行為學(xué)實驗外，還研究了海參花對小鼠被動回避實驗的影響。由表10可知：訓(xùn)練期間，與空白組相比，模型組小鼠進(jìn)入通電暗室的潛伏期顯著降低（P＜0.01），犯錯受電擊的次數(shù)顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，海參花3個劑量組在這兩個指標(biāo)上均有顯著改善，其中海參花中劑量組和高劑量組能顯著增加小鼠進(jìn)入通電暗室的潛伏期（P＜0.01），同時顯著降低小鼠的錯誤次數(shù)（P＜0.01）。陽性組與模型組相比，潛伏期顯著增加（P＜0.01），錯誤次數(shù)顯著降低（P＜0.01）。

在測試期，考慮到電擊對小鼠的刺激和傷害較大，關(guān)閉了暗室的電擊。結(jié)果表明：模型組比空白組的潛伏期顯著減少（P＜0.01），錯誤次數(shù)顯著增加（P＜0.01）。而與模型組相比，海參花低劑量組的潛伏期顯著增加（P＜0.05），錯誤次數(shù)顯著減少（P＜0.05）；海參花高劑量組的潛伏期顯著增加（P＜0.05）；海參花中劑量組錯誤次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。陽性組的潛伏期增加，錯誤次數(shù)減少，但無顯著性差異。綜上所述，海參花能提高東莨菪堿誘導(dǎo)的記憶損傷小鼠的被動回避反應(yīng)能力和恐懼記憶再現(xiàn)能力。

表10 海參花對小鼠在避暗實驗中潛伏期和錯誤次數(shù)的影響Table 10 Effect of sea cucumber ovum on latency and number of errors of mice in step-through task

3 結(jié)語

作者對海參花的主要成分進(jìn)行了分析測定，結(jié)果表明：海參花是一種蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高、脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)低的食物。海參花含有不飽和脂肪酸和多糖，且氨基酸種類豐富，可作為蛋白質(zhì)來源。本研究利用東莨菪堿建立小鼠記憶障礙模型來評估海參花改善小鼠學(xué)習(xí)和記憶的功效。結(jié)果表明：海參花在曠場實驗中能增加模型組在中心區(qū)域的探索行為；在新物體識別實驗中能改善模型組的學(xué)習(xí)能力和認(rèn)知記憶；在Y迷宮中能改善模型組的工作記憶和參考記憶；在Morris水迷宮中能改善模型組的空間記憶；在避暗實驗中能改善小鼠的被動回避反應(yīng)能力和恐懼記憶再現(xiàn)能力。海參花對小鼠學(xué)習(xí)和記憶的改善效果并未隨海參花劑量的增大而增強(qiáng)，綜合效果最好的是海參花低劑量組，原因有待在后續(xù)的實驗中進(jìn)一步探討。綜上所述，本研究證明海參花在改善學(xué)習(xí)和記憶方面具有一定功效，為海參花進(jìn)一步開發(fā)利用提供了一些理論依據(jù)。同時能夠給海參養(yǎng)殖業(yè)帶來良好的經(jīng)濟(jì)效益。