天然藍(lán)色花色苷-亞鐵螯合物的制備及穩(wěn)定性研究

潘 飛，趙 磊*，周 娜，郝 帥，王成濤，聶元茜

（1.北京工商大學(xué) 食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康北京高精尖創(chuàng)新中心，北京100048；2.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京100048）

當(dāng)前，食品著色劑廣泛應(yīng)用于食品、保健品、化妝品等領(lǐng)域，由于其能夠賦予產(chǎn)品獨(dú)特的色彩而廣受消費(fèi)者喜愛(ài)。食品著色劑根據(jù)來(lái)源可分為人工合成著色劑和天然著色劑[1]。人工合成著色劑如胭脂紅、檸檬黃、亮藍(lán)等常作為染料應(yīng)用于食品工業(yè)，然而一些合成著色劑會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生有害影響[2-3]。研究表明，偶氮類染料與兒童的注意缺陷多動(dòng)障礙（ADHD）有密切關(guān)系[4]，歐洲委員會(huì)要求這些著色劑應(yīng)用于食品和飲料中時(shí)必須加標(biāo)簽，我國(guó)也明確禁止在供3歲以下兒童食用的食物中使用這些著色劑[5-6]。隨著人們健康意識(shí)提高，比起添加人工合成著色劑的食品，消費(fèi)者更傾向于選擇添加天然著色劑的食品，采用天然著色劑替代人工合成著色劑也是食品行業(yè)的一個(gè)重要發(fā)展方向。天然著色劑中，紅色素和黃色素資源豐富，如紅米紅、甜菜紅、辣椒紅、紅曲紅、姜黃、梔子黃和胡蘿卜素等[7]。相比之下，天然食用藍(lán)色素資源稀缺，僅有梔子藍(lán)色素、藻藍(lán)蛋白和靛藍(lán)3種[3]，因此積極開(kāi)展天然藍(lán)色素的研究開(kāi)發(fā)工作，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

花色苷是一種天然著色劑，安全、無(wú)毒、來(lái)源豐富，并有多項(xiàng)保健功能，如清除體內(nèi)自由基、抗炎、調(diào)節(jié)血脂等[8-10]，常作為天然著色劑和功能因子在食品中添加?；ㄉ摘?dú)特的結(jié)構(gòu)賦予其顏色特性，pH＜2時(shí)，主要以紅色的2-苯基苯并吡喃陽(yáng)離子形式存在；pH 3～6時(shí)，以無(wú)色的甲醇假堿或查爾酮形式存在；pH＞8時(shí)，以藍(lán)色的離子化醌式堿形式存在[11]。然而，花色苷在弱堿或堿性條件下穩(wěn)定性差[12]，容易發(fā)生降解褪色且難以長(zhǎng)期保持藍(lán)色，因此，花色苷在酸性食品基質(zhì)中的使用受到限制。研究發(fā)現(xiàn)，由花色苷、共色素及金屬離子按一定比例組成的金屬螯合物能在酸性條件下呈藍(lán)色，并可通過(guò)調(diào)控pH值實(shí)現(xiàn)多種顏色變化[13]，這項(xiàng)研究為藍(lán)色素的開(kāi)發(fā)帶來(lái)新的思路。Sigurdson等[14]研究了花色苷-Al3+螯合物作為天然藍(lán)色素的可能性，結(jié)果表明，金屬鹽比例、pH值、花色苷濃度等是決定最終顏色和顏色深淺的關(guān)鍵，在酸性（pH=3.0）溶液中制備的花色苷-Al3+螯合物顏色可呈深紫色或藍(lán)色。Buchweitz等[15]采用Fe3+鹽制備花色苷-Fe3+螯合物，并將其作為天然藍(lán)色素應(yīng)用在多糖凝膠中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)花色苷-Fe3+螯合物在酸性溶液中呈藍(lán)色，多糖凝膠能提高花色苷-Fe3+螯合物的穩(wěn)定性。然而，金屬離子的引入可能會(huì)帶來(lái)健康風(fēng)險(xiǎn)，如Al3+在人體中積累可使人慢性中毒，損害大腦神經(jīng)元[16]，而Fe3+的存在會(huì)導(dǎo)致高鐵血紅蛋白血癥，使人紅細(xì)胞失去攜帶氧的能力[17]，相比之下，F(xiàn)e2+作為構(gòu)成血紅蛋白、細(xì)胞色素的主要成分，有助于人體健康和生長(zhǎng)發(fā)育[18]。但是，以Fe2+制備花色苷金屬螯合物作為天然藍(lán)色素的相關(guān)研究較少，尤其是其作為天然藍(lán)色素的穩(wěn)定性。

本研究選用Fe2+制備藍(lán)色的花色苷-Fe2+螯合物。采用紫外分光光度計(jì)及色差儀評(píng)價(jià)酸性條件（pH=3.0）下Fe2+濃度對(duì)花色苷-Fe2+螯合物顏色的影響；將其應(yīng)用于酸性模擬飲料體系，分別探究在儲(chǔ)藏及熱處理?xiàng)l件下花色苷-Fe2+螯合物的顏色穩(wěn)定性；建立降解動(dòng)力學(xué)，進(jìn)一步評(píng)估花色苷-Fe2+螯合物作為天然藍(lán)色素的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫茄子：購(gòu)自北京物美超市。

七水合硫酸亞鐵：購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；XAD-7吸附樹(shù)脂：購(gòu)自北京康林科技有限責(zé)任公司；黃原膠：購(gòu)自河北百味生物科技有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

臺(tái)式離心機(jī)H1850：購(gòu)自北京天林恒泰科技有限公司；色差儀CM-3601A：購(gòu)自柯尼卡美能達(dá)辦公系統(tǒng)（中國(guó)）有限公司；紫外分光光度計(jì)UV-2450：購(gòu)自日本島津公司；恒溫水浴鍋HHSY21-Ni4：購(gòu)自北京市精科華瑞儀器有限公司；真空冷凍干燥機(jī)LABCONCO：購(gòu)自美國(guó)Labconco公司；粉碎機(jī)JYLC051：購(gòu)自九陽(yáng)股份有限公司；超聲波清洗儀：購(gòu)自北京中晟銘科技有限公司；控制型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RV10：購(gòu)自廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；可視孔氮吹儀NK200-1B：購(gòu)自杭州米歐儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花色苷的分離純化 按Zhao等[8]的方法并略有修改：紫茄子剝皮、粉碎，取粉碎后的紫茄子皮30.0 g，按料液質(zhì)量體積比為1 g∶10 mL加入酸性乙醇（HCl與乙醇的體積比為15:85，pH 2.0），避光超聲提?。?0 min）兩次，將兩次的上層提取液混合，旋蒸去除乙醇，將去除乙醇后的花色苷水溶液過(guò)濾去除不溶性雜質(zhì)，用乙酸乙酯萃取。裝填XAD-7樹(shù)脂柱，上樣，待吸附完全后，用6倍柱體積的酸性純水（用HCl調(diào)pH至3.0）洗去蛋白質(zhì)、糖類等雜質(zhì)，酸性純水流量為1 mL/min；用1倍柱體積的酸性乙醇（用HCl調(diào)pH至3.0）將花色苷洗脫下來(lái)，于40℃下旋蒸濃縮至3 mL左右，氮吹至干，得到花色苷提取物粉末，置于離心管中-20℃條件下保存，待用。

1.3.2 花色苷溶液質(zhì)量濃度測(cè)定 用pH示差法[19]測(cè)定紫茄子花色苷質(zhì)量濃度：取一定質(zhì)量待測(cè)樣，分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖液將樣品稀釋數(shù)倍，平衡10 min后，以純水為空白，分別測(cè)定樣液在515 nm和700 nm下的吸光值，按照（1）方程計(jì)算樣液中花色苷的質(zhì)量濃度。

其中M表示花色苷的質(zhì)量濃度；MW表示矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量（449.2 g/mol）；DF是稀釋倍數(shù)；L為光程長(zhǎng)，1 cm；ε為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26 900 L/（mol·cm）。

1.3.3 花色苷-Fe2+螯合物的制備 取一定質(zhì)量花色苷粉末，溶于1 mL濃度0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 3.0），根據(jù)1.3.2測(cè)定花色苷溶液的質(zhì)量濃度，用檸檬酸鈉緩沖液調(diào)整花色苷溶液質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，加入FeSO4·7H2O使花色苷與Fe2+的摩爾比分別為1∶1、1∶75、1∶150、1∶350和1∶700，避光平衡2 h，制備花色苷-Fe2+螯合物。

1.3.4 花色苷-Fe2+螯合物的顏色評(píng)價(jià) 采用紫外分光光度計(jì)在400～700 nm測(cè)定花色苷-Fe2+螯合物的最大吸收波長(zhǎng)及吸光值，分析其紅移及增色效應(yīng)，并借助色差儀測(cè)定顏色變化，確定最優(yōu)花色苷與Fe2+的摩爾比。

1.3.5 花色苷-Fe2+螯合物在模擬飲料體系中穩(wěn)定性研究 采用檸檬酸鈉緩沖液（pH=3.0）配置模擬飲料體系。對(duì)照組的組成為：VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%、花色苷與Fe2+摩爾比為1∶350，花色苷溶液質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL。模型組的組成為：黃原膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、VC質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%、花色苷與Fe2+摩爾比為1∶350，花色苷溶液質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL。

黑暗條件下，對(duì)上述模擬飲料體系（對(duì)照組和模型組）分別進(jìn)行儲(chǔ)藏和熱加工處理。儲(chǔ)藏條件：分別在4℃和20℃儲(chǔ)藏14 d；熱加工條件：分別在80、90、100℃條件下處理30 min；于固定時(shí)間取樣測(cè)定色差。

1.3.6 色差測(cè)定 采用色差儀CM-3601A對(duì)模型體系測(cè)定色差，記錄（L*、a*、b*），使用標(biāo)準(zhǔn)白板（L*=97.43，a*=0.01，b*=1.64）校準(zhǔn)。根據(jù)色差儀計(jì)算的L*、a*、b*值，使用顏色在線轉(zhuǎn)化工具（https://www.colortell.com/labto）獲得RGB值，并制作仿真顏色。

1.3.7 降解動(dòng)力學(xué)計(jì)算 天然色素的降解遵循準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)[20]，確定顏色損失可得到藍(lán)色花色苷-Fe2+螯合物的降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)，b*為負(fù)表示藍(lán)色，當(dāng)-b*減少時(shí)表示藍(lán)色損失。將（bt*/b0*）的對(duì)數(shù)與處理時(shí)間t作圖，圖的斜率為降解速率常數(shù)k，見(jiàn)方程（2）；由此可計(jì)算出半衰期值t1/2，見(jiàn)方程（3）；活化能Eα計(jì)算見(jiàn)方程（4）：

其中bt*為處理t時(shí)刻后的b*值；b0*為初始的b*值；k為斜率和降解速率常數(shù)；t為處理時(shí)間（h）；k0為頻率常數(shù)；R為氣體常數(shù)8.314×10-3kJ/（mol·K）；T為絕對(duì)溫度（K）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0、Origin 2018C軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05表示試驗(yàn)結(jié)果具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fe2+濃度對(duì)花色苷-Fe2+螯合物顏色的影響

Fe2+濃度對(duì)花色苷-Fe2+螯合物顏色的影響如圖1和圖2所示，圖1為不同F(xiàn)e2+濃度下花色苷-Fe2+螯合物的顏色變化。在花色苷與Fe2+的摩爾比為1∶1至1∶75時(shí)，溶液顏色逐漸由紅色轉(zhuǎn)為粉紅色和粉色，這表明花色苷與Fe2+開(kāi)始發(fā)生絡(luò)合形成金屬螯合物，游離花色苷的質(zhì)量濃度降低使溶液顏色變淡。隨著花色苷與Fe2+的摩爾比逐漸增大，顏色又由粉色向藍(lán)紫色和藍(lán)色轉(zhuǎn)變，這可能是在低pH值時(shí)，花色苷往往以紅色的黃烷結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，并與藍(lán)色金屬螯合物競(jìng)爭(zhēng)，使溶液顏色最終呈紫色或藍(lán)紫色[14]。在所選Fe2+濃度范圍內(nèi)，花色苷-Fe2+螯合物的溶液均呈澄清透明，未出現(xiàn)沉淀絮凝現(xiàn)象，而Sigurdson等制備的花色苷-Al3+螯合物和Buchweitz等制備的花色苷-Fe3+螯合物出現(xiàn)少量沉淀絮凝，這是因?yàn)锳l3+、Fe3+在溶液中發(fā)生水解產(chǎn)生氫氧化合物造成的[14，21]。不同F(xiàn)e2+濃度對(duì)溶液的吸光值和最大吸收波長(zhǎng)也有影響：與對(duì)照組相比，當(dāng)花色苷與Fe2+的摩爾比處于1∶1和1∶75時(shí)，溶液吸光值顯著降低（P＜0.05）（圖2）；隨花色苷與Fe2+的摩爾比增大，吸光值顯著增大（P＜0.05）；花色苷與Fe2+的摩爾比在1∶350和1∶700之間時(shí)，吸光值沒(méi)有出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05）。Sigurdson等[14]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)花色苷濃度為100μmol/L時(shí)，Al3+與花色苷的摩爾比處于100～500具有最高吸收強(qiáng)度和最大紅移現(xiàn)象，這種現(xiàn)象歸結(jié)于Al3+與花色苷的醌式堿陰離子結(jié)合發(fā)生絡(luò)合，而其余花色苷黃烷陽(yáng)離子堆積在醌式堿陰離子頂部，并通過(guò)π-π堆積造成泛色位移而突顯出藍(lán)色；當(dāng)金屬離子濃度增加，促進(jìn)溶液中醌式堿陰離子百分比增加，而濃度過(guò)大則減弱此現(xiàn)象[14，22]。此外，溶液的最大吸收波長(zhǎng)由528 nm增至535 nm，這表明：較高Fe2+濃度能夠產(chǎn)生增色和紅移效應(yīng)[23]，進(jìn)而導(dǎo)致顏色改變。因此，在不引入高濃度Fe2+前提下，選擇花色苷與Fe2+的摩爾比為1∶350配置模擬飲料體系研究其穩(wěn)定性。

圖1 Fe2+濃度對(duì)花色苷-Fe2+螯合物的顏色的影響Fig.1 Effect of Fe2+concentration on the color of anthocyanin-Fe2+chelates

2.2 儲(chǔ)藏條件對(duì)花色苷-Fe2+螯合物顏色穩(wěn)定性的影響

采用酸性模擬飲料體系研究花色苷-Fe2+螯合物儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，結(jié)果如圖3所示。L*值表示明度值，衡量顏色深淺，0表示黑色，100表示白色[23]。在4℃和20℃，對(duì)照組和模擬飲料體系的L*值都增加，對(duì)照組從第6天開(kāi)始L*值達(dá)到平衡，而模擬飲料體系逐步增加，且顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），這可能有兩個(gè)原因：其一是花色苷-Fe2+螯合物在儲(chǔ)藏過(guò)程中形成灰色的氧/羥基絡(luò)合物，導(dǎo)致L*值增加，而黃原膠能減少此類產(chǎn)物形成[15]；其二是花色苷-Fe2+螯合物降解導(dǎo)致藍(lán)色褪去，溶液逐漸呈現(xiàn)Fe2+的顏色（黃綠色）。a*值和b*值表示色品指數(shù)，a*值為正表示紅色，為負(fù)表示綠色，b*值為正表示黃色，b*值為負(fù)表示藍(lán)色[24]。在4℃和20℃儲(chǔ)藏過(guò)程中對(duì)照組和模擬飲料體系的a*值和b*值分別出現(xiàn)下降和增加，這可能是在儲(chǔ)藏過(guò)程中溶液中游離的花色苷及花色苷-Fe2+螯合物發(fā)生降解，導(dǎo)致顏色損失[15]。此外，添加黃原膠的模擬飲料體系b*值均小于對(duì)照組，說(shuō)明黃原膠與花色苷-Fe2+螯合物之間可能存在相互作用[24]，延緩藍(lán)色的損失，提高花色苷-Fe2+螯合物的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。Buchweitz等[21]報(bào)道甜菜果膠可改善花色苷-Al3+螯合物和花色苷-Fe3+螯合物的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，有效防止沉淀產(chǎn)生并獲得藍(lán)色。

圖2 Fe2+濃度對(duì)花色苷-Fe2+螯合物吸光值及最大吸收波長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of molar ratio of anthocyanin：Fe2+on the absorption value and maximum absorption wavelength of anthocyanin-Fe2+chelates

2.3 熱加工對(duì)花色苷-Fe2+螯合物顏色穩(wěn)定性影響

分別在80、90、100℃的條件下對(duì)模擬飲料體系和對(duì)照組的花色苷-Fe2+螯合物處理30 min，其顏色變化如圖4所示，在加熱條件下，模擬飲料體系和對(duì)照組的a*值和b*值分別出現(xiàn)下降和增加，a*值下降說(shuō)明加熱使花色苷的黃烷結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而b*值增加可能是因?yàn)榧訜釋?dǎo)致花色苷-Fe2+螯合物發(fā)生氧化、褐變[25]。此外，模擬飲料體系的L*值、a*值顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），其變化趨勢(shì)與儲(chǔ)藏條件基本一致，不同的是兩組樣品在熱處理5 min后L*值基本達(dá)到平衡。同時(shí)，熱加工溫度對(duì)花色苷-Fe2+螯合物的影響存在差異，在80、90℃熱加工中模擬飲料體系b*值低于對(duì)照組，而在100℃時(shí)模擬飲料體系b*值高于對(duì)照組，這說(shuō)明在較高溫條件下黃原膠并不能有效提高花色苷-Fe2+螯合物顏色的穩(wěn)定性，原因是：黃原膠在高溫下結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，容易受到外部自由基攻擊[26]，失去對(duì)花色苷-Fe2+螯合物的保護(hù)作用。因此，使用熱穩(wěn)定性較好的多糖可能有助于改善花色苷-Fe2+螯合物的顏色穩(wěn)定性?？傮w來(lái)看，所制備的花色苷-Fe2+螯合物熱穩(wěn)定性較差，這與此前報(bào)道的花色苷-Al3+螯合物和花色苷-Fe3+螯合物的顏色穩(wěn)定性結(jié)果一致[21，27]。高溫加快花色苷-Fe2+螯合物顏色損失，黃原膠可改善其在80、90℃熱加工條件下的顏色穩(wěn)定性。

圖3 儲(chǔ)藏條件對(duì)花色苷-Fe2+螯合物顏色穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of storage conditions on color stability of anthocyanin-Fe2+chelates

2.4 花色苷-Fe2+螯合物降解動(dòng)力學(xué)研究

按照1.3.7方法建立花色苷-Fe2+螯合物的降解動(dòng)力學(xué)方程，進(jìn)一步評(píng)估花色苷-Fe2+螯合物的穩(wěn)定性，結(jié)果如表1所示?；ㄉ?Fe2+螯合物在不同溫度條件下的降解均符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)（R2＞0.80），通過(guò)觀察降解速率常數(shù)和半衰期t1/2可知，對(duì)照組在4℃和20℃儲(chǔ)藏過(guò)程中降解速率變化并不明顯，相比之下，模擬飲料體系添加了穩(wěn)定劑黃原膠，它能有效緩解花色苷-Fe2+螯合物的降解，在4℃儲(chǔ)藏效果顯著，半衰期增加78.48 h。然而，在熱加工條件下，隨著加工溫度的升高，對(duì)照組及模擬飲料體系的降解速率常數(shù)k均顯著增大（P＜0.05），熱加工導(dǎo)致花色苷-Fe2+螯合物的降解加快，藍(lán)色損失較大，半衰期時(shí)間變短，可能因?yàn)闇囟冗^(guò)高使花色苷-Fe2+螯合物發(fā)生解離，導(dǎo)致b*增大（圖4），隨加熱時(shí)間延長(zhǎng)，藍(lán)色逐漸消失。活化能代表物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)變時(shí)所需要吸收的能量，能量越高表示物質(zhì)越穩(wěn)定[25]。在不同溫度下，對(duì)照組活化能Eα為46 kJ/moL，低于模擬飲料體系（48 kJ/moL），這表明黃原膠能夠提高花色苷-Fe2+螯合物的穩(wěn)定性，這與Buchweitz等[27]研究報(bào)道甜菜果膠提高花色苷-Fe3+螯合物顏色穩(wěn)定性的結(jié)果一致。因此，在實(shí)際應(yīng)用中通過(guò)添加多糖穩(wěn)定劑可減緩花色苷-Fe2+螯合物的降解。

圖4 熱處理對(duì)花色苷-Fe2+螯合物顏色穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of thermal treatment on the color stability of anthocyanin-Fe2+chelates

表1 花色苷-Fe2+螯合物的降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetics parameters of degradation of anthocyanin-Fe2+chelates

3 結(jié) 語(yǔ)

本研究討論了不同F(xiàn)e2+濃度對(duì)花色苷-Fe2+螯合物顏色的影響，確定花色苷與Fe2+的最優(yōu)摩爾比為1∶350，所制備的花色苷-Fe2+螯合物顏色呈紫藍(lán)色，采用模擬飲料體系（pH=3.0）評(píng)估其儲(chǔ)藏和熱加工顏色穩(wěn)定性。結(jié)果表明：花色苷-Fe2+螯合物的降解遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)（R2＞0.80），在4℃黑暗儲(chǔ)藏14 d，花色苷-Fe2+螯合物的顏色穩(wěn)定性優(yōu)于20℃條件下處理的螯合物，通過(guò)添加黃原膠能夠提高花色苷-Fe2+螯合物的半衰期和活化能，進(jìn)而減緩螯合物降解和藍(lán)色損失。然而，熱加工過(guò)程中，花色苷-Fe2+螯合物熱穩(wěn)定性較差，高溫加速花色苷-Fe2+螯合物降解。因此，該花色苷-Fe2+螯合物的熱穩(wěn)定性還存在不足，僅適用于食品的低溫加工和儲(chǔ)藏。