天香丹膠囊含藥血漿對(duì)H2O2誘導(dǎo)損傷心肌細(xì)胞的影響①

唐 梅，杜古加·嘎?tīng)柆?，?林

（新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830000）

天香丹膠囊是新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，具有益氣活血、補(bǔ)虛通絡(luò)的功效，臨床上長(zhǎng)期用于心肌缺血的治療[1]。心肌缺血是一種因體內(nèi)心臟冠狀動(dòng)脈出現(xiàn)粥樣化、血管狹窄閉塞或血液黏度異常使得心臟中血流量減少，引發(fā)心臟出現(xiàn)缺血缺氧的病理狀態(tài)[2]。當(dāng)心臟出現(xiàn)缺血后，會(huì)使機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的應(yīng)激性損傷，其中過(guò)量氧自由基引起的氧化損傷、炎性反應(yīng)對(duì)細(xì)胞的浸潤(rùn)和線粒體能量供應(yīng)不足都會(huì)進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷[3]。心肌缺血在現(xiàn)代中醫(yī)上歸于“胸痹”，屬血瘀證的范疇。中醫(yī)認(rèn)為心肌缺血的主要病因是本虛標(biāo)實(shí)，虛為心脾肝腎氣血陰陽(yáng)虧虛，心脈失養(yǎng)，實(shí)為寒凝、氣滯、血瘀、痰阻[4]，主要病機(jī)是上焦陽(yáng)虛、陰邪上乘、邪正相搏，基本治療原則是辛溫通陽(yáng)、活血化瘀[5]。研究表明，心血管疾病的患病及死亡的因素與飲食習(xí)慣、生活環(huán)境、情緒觀念和各種慢性病并發(fā)癥有關(guān)[6-7]。在模擬心肌缺血缺氧損傷時(shí)，常用超氧法建立心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，通過(guò)外源性H2O2刺激心肌細(xì)胞釋放氧自由基來(lái)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[8]。本研究建立氧化損傷模型模擬人體內(nèi)心肌缺血氧化應(yīng)激損傷，探究天香丹膠囊含藥血漿對(duì)氧化損傷心肌細(xì)胞的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），LXJ-2B型低速多管離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司），Benchmark PLUS全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司），TCS SP8型激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica公司）。

1.2 試劑DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司，批號(hào)AE29163346），澳洲胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)2145068CP），青霉素-鏈霉素（美國(guó)HyClone公司，批號(hào)J190003），0.25%胰蛋白酶-EDTA（美國(guó)Gib?co公司，批號(hào)10493E16），Ⅱ型膠原酶（美國(guó)Worthing?ton公司，批號(hào)45K16005），過(guò)氧化氫（天津市紅巖試劑廠，批號(hào)20190411），MTT（賽果生物科技有限公司，批號(hào)5679C133），Hoechst 33342染色液（碧云天生物科技有限公司，批號(hào)C1025），超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（碧云天生物科技有限公司，批號(hào)S0101），丙二醛（MDA）試劑盒（碧云天生物科技有限公司，批號(hào)S0131），總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（南京建成生物科技有限公司，批號(hào)A015-3-1），肌動(dòng)蛋白（Actin）（艾博抗貿(mào)易有限公司，批號(hào)ab150113），F(xiàn)ITC標(biāo)記二抗（艾博抗貿(mào)易有限公司，批號(hào)ab6717），Anti-Nrf2（艾博抗貿(mào)易有限公司，批號(hào)ab137550），βactin（美國(guó)CST公司，批號(hào)#8457），Anti-IP3R（美國(guó)CST公司，批號(hào)#8568），Anti-rabbit IgG（美國(guó)CST公司，批號(hào)#7074）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物40只2月齡SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（200±50）g，30只1～3 d SD乳鼠，雌雄不限，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（新疆）20200003］。

1.4 藥物天香丹膠囊由新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院中藥房提供（批號(hào)20191016）。

1.5 方法

1.5.1 天香丹膠囊含藥血漿的制備 將40只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，對(duì)大鼠進(jìn)行標(biāo)記并按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組和給藥組。給藥組劑量根據(jù)人和動(dòng)物體表面積折算表，以成人推薦每日正常用量（天香丹膠囊，每天3次，每次4粒）計(jì)算，給藥量相當(dāng)于成人的6.3倍，即天香丹膠囊0.378 g/kg/d，連續(xù)給藥3 d，每天2次，第3 d夜間禁食不禁水，第4 d灌胃1次，給足1 d劑量。空白組用生理鹽水灌胃。末次給藥后1 h麻醉，對(duì)大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，室溫靜置30 min，4℃1 000 r/min離心10 min，將血漿按組收集于15 mL離心管中，56℃水浴30 min滅活補(bǔ)體，0.22μm濾器過(guò)濾分裝，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 原代心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法 取30只1～3 d的SD乳鼠，用75%酒精擦拭全身消毒，剪開(kāi)左胸夾取心臟，放入預(yù)冷的D-Hank’s緩沖液中沖洗周邊血凝塊；留取心室部分剪成4～6瓣?duì)畹慕M織碎片放入離心管中，加入30 mL的0.025%胰酶配制液放于4℃冰箱搖床12 h；棄去管中全部液體，加入5mL的0.6 mg/mLⅡ型膠原酶，將離心管置于37℃水浴消化10 min，靜止片刻收集細(xì)胞上清液，重復(fù)此操作消化6次。將所得細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀后種于培養(yǎng)皿中，利用差速貼壁法純化心肌細(xì)胞，細(xì)胞分別貼壁培養(yǎng)50 min和60 min后移取皿中細(xì)胞懸液再進(jìn)行培養(yǎng)（培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2），即為原代心肌細(xì)胞。

1.5.3 原代心肌細(xì)胞存活率檢測(cè) 收集差速貼壁后的原代心肌細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，重懸沉淀稀釋密度為1×106個(gè)/mL。取細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以9∶1混勻，染色3 min，死細(xì)胞著藍(lán)色并膨大，無(wú)光澤；活細(xì)胞不著色并保持正常形態(tài)，有光澤。吸取10μL經(jīng)過(guò)染色的細(xì)胞懸液在顯微鏡下計(jì)數(shù)來(lái)計(jì)算存活率，細(xì)胞存活率=活細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5.4 原代心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 在倒置熒光顯微鏡下觀察正常心肌細(xì)胞在1、2、3、4和15 d時(shí)的形態(tài)變化。

1.5.5 原代心肌細(xì)胞免疫熒光純度鑒定 將培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞接種于多聚賴氨酸預(yù)處理過(guò)的激光共聚焦培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好后PBS清洗3次，每次5 min。在室溫下用4%多聚甲醛固定40 min，固定后PBS清洗3次，每次5 min。培養(yǎng)皿中加入0.3%Triton X-100工作液于37℃孵育30 min打孔通透。再加入5%BSA于37℃下封閉1 h。加入0.3%Triton X-100工作液稀釋的一抗，即肌動(dòng)蛋白（Anti-alpha smooth muscle Actin，1∶500），于4℃冰箱孵育一抗12h后取出，室溫放置30 min，PBS清洗3次，每次5 min。加FITC標(biāo)記的二抗（1∶500）于37℃下避光孵育1 h。用PBS清洗3次，每次5 min。加入1μg/mL的DAPI工作液染核10 min，用PBS清洗3次，每次5 min。激光共聚焦顯微鏡488 nm處觀察肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，在紫外光波長(zhǎng)激發(fā)下觀察DAPI染核情況，將2種激光疊加，同時(shí)表達(dá)的即為陽(yáng)性細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。

1.5.6 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 將心肌細(xì)胞懸液按1×106個(gè)/mL的密度接種于96孔板于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁72 h后待80%的心肌細(xì)胞出現(xiàn)良好搏動(dòng)狀態(tài)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將孔內(nèi)液體換為無(wú)FBS的高糖培養(yǎng)液，設(shè)對(duì)照組：只加DMEM高糖培養(yǎng)液；不同濃度H2O2模型組：加入終濃度分別為1 600、800、400、200、100、50μmol/L的H2O2，放于培養(yǎng)箱中分別繼續(xù)培養(yǎng)1、2、4 h。用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力篩選出氧化損傷模型的最合適的H2O2濃度和損傷時(shí)間。

1.5.7 觀察天香丹膠囊含藥血漿低、中、高濃度組在單純處理心肌細(xì)胞和干預(yù)處理心肌細(xì)胞時(shí)對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響 將心肌細(xì)胞懸液按1×106個(gè)/mL的密度接種于96孔板于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁72 h后待80%的心肌細(xì)胞出現(xiàn)良好搏動(dòng)狀態(tài)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組如下：（1）單純處理分組為對(duì)照組：只加DMEM高糖培養(yǎng)液；模型組：加入用DMEM高糖培養(yǎng)液配制成100μmol/L的H2O2液損傷2 h；空白血漿組：加入用DMEM高糖培養(yǎng)液配制的含15%的空白血漿液處理24 h；天香丹膠囊含藥血漿低、中、高濃度組:加入用DMEM高糖培養(yǎng)液配制的含5%、10%、15%的含藥血漿液處理24 h。（2）干預(yù)處理分組為對(duì)照組：只加DMEM高糖培養(yǎng)液；模型組：加入用DMEM高糖培養(yǎng)液配制成100μmol/L的H2O2液損傷2 h；空白血漿組：加入用DMEM高糖培養(yǎng)液配制的含15%的空白血漿液處理24 h，再加入100μmol/L的H2O2液損傷2 h；天香丹膠囊含藥血漿低、中、高濃度組:加入用DMEM高糖培養(yǎng)液配制的含5%、10%、15%的含藥血漿液處理24 h，再加入100μmol/L的H2O2液損傷2 h。按實(shí)驗(yàn)分組處理結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，每孔加入100μL的DMEM高糖液及10μL的5 mg/mL MTT工作液于37℃培養(yǎng)4 h，加入150μL DMSO放于搖床10 min，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度，細(xì)胞存活率（%）=（A藥物組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%。

1.5.8 Hoechst 33342染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)變化將心肌細(xì)胞懸液按1×106個(gè)/mL的密度接種于裝有蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)3 d后待細(xì)胞狀態(tài)良好后，按“1.5.7”項(xiàng)下（2）的實(shí)驗(yàn)分組處理。處理結(jié)束后，PBS清洗3遍，4%的多聚甲醛室溫固定20 min，10 mg/mL的Hoechst 33342染色液于37℃下染色10 min，PBS清洗3次，取出細(xì)胞爬片，在熒光焦顯微鏡下觀察各組心肌細(xì)胞的凋亡形態(tài)變化。

1.5.9 測(cè)定心肌細(xì)胞中T-AOC，SOD和MDA的含量將心肌細(xì)胞懸液按1×106個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)3 d后待細(xì)胞狀態(tài)良好后，按“1.5.7”項(xiàng)下（2）的實(shí)驗(yàn)分組處理。處理結(jié)束后，按照T-AOC，SOD和MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定。

1.5.10 Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞Nrf2和IP3R蛋白表達(dá)水平 將心肌細(xì)胞懸液按1×106個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)3 d后待細(xì)胞狀態(tài)良好后，按“1.5.7”項(xiàng)下（2）的實(shí)驗(yàn)分組處理。處理結(jié)束后，PBS清洗1次，加入含1mM PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液于冰上裂解細(xì)胞30 min，12 000 r/min 4℃離心收集上清，用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度，置于-80℃冰箱備用。將等量的樣品蛋白用SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1 h。分別加入一抗：β-actin（1∶1000）、Anti-Nrf2（1∶500）和Anti-IP3R（1∶1000）于4℃搖床孵育12 h；取出室溫?fù)u床孵育1 h，用HRP偶聯(lián)二抗室溫?fù)u床孵育1 h，在紅外燈下用ECL化學(xué)發(fā)光液曝出PVDF膜上的蛋白條帶。采用Image J軟件對(duì)Western blot蛋白條帶進(jìn)行分析處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)用Duunett's T3法，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代心肌細(xì)胞存活率血球計(jì)數(shù)板上觀察臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率為90.25%以上。

2.2 原代心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察在倒置顯微鏡下觀察正常原代心肌細(xì)胞形態(tài)，第二次差速純化結(jié)束未貼壁時(shí)，細(xì)胞為透亮的圓球形，24 h后細(xì)胞大多數(shù)貼壁并生出偽足，有明顯的立體感，少數(shù)細(xì)胞有自發(fā)搏動(dòng)狀態(tài)（圖1A）；48 h后可見(jiàn)細(xì)胞基本貼壁，偽足伸長(zhǎng)，多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)自發(fā)搏動(dòng)且為局部同步搏動(dòng)狀態(tài)（圖1B）；3 d后細(xì)胞間偽足交織成簇狀，為放射狀排列，搏動(dòng)基本同步（圖1C）；4 d后細(xì)胞偽足明顯延長(zhǎng)連成一片，完全同步化搏動(dòng)（圖1D），同步搏動(dòng)頻率為80～100次/min；15 d后細(xì)胞明顯老化，但仍可觀察到有搏動(dòng)狀態(tài)（圖1E）。

圖1 原代心肌細(xì)胞經(jīng)分離消化培養(yǎng)后在不同時(shí)間點(diǎn)的顯微學(xué)形態(tài)變化

2.3 心肌細(xì)胞免疫熒光純度鑒定培養(yǎng)至第3 d的原代心肌細(xì)胞經(jīng)免疫熒光鑒定結(jié)果顯示，在激光共聚焦顯微鏡下原代心肌細(xì)胞中有α-Actin表達(dá)，其由FITC標(biāo)記的二抗可與原代心肌細(xì)胞中的特異性蛋白α-Actin一抗結(jié)合，經(jīng)過(guò)488 nm激光激發(fā)呈現(xiàn)出絲狀或梭形的綠色熒光；DAPI染核后，經(jīng)紫外光激光激發(fā)呈現(xiàn)出橢圓形或圓形的藍(lán)色熒光，合并結(jié)果中可清晰觀察到原代心肌細(xì)胞的完整形態(tài)，多呈倒三角形或梭形，細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白呈絲狀分布，連成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。每個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)取5個(gè)視野，同時(shí)表達(dá)藍(lán)色熒光和綠色熒光的為陽(yáng)性細(xì)胞，其中藍(lán)色熒光的細(xì)胞數(shù)記為細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，結(jié)果顯示原代乳鼠心肌細(xì)胞純度大于95%。見(jiàn)圖2。

2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力確定氧化損傷模型在相同培養(yǎng)時(shí)間下，觀察不同濃度的H2O2對(duì)心肌細(xì)胞損傷影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其細(xì)胞存活率隨著濃度的降低而升高。當(dāng)H2O2濃度為100μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率為50%左右，達(dá)到損傷效果且沒(méi)有對(duì)細(xì)胞造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷（圖3A)，因此，確定氧化損傷的濃度為100μmol/L；再觀察100μmol/LH2O2處理不同時(shí)間下對(duì)心肌細(xì)胞損傷影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞存活率隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈梯度降低（圖3B）。故最終確定H2O2損傷濃度為100μmol/L，處理時(shí)間為2 h。

圖3 氧化損傷模型H2O2濃度和處理時(shí)間的篩選

2.5 天香丹膠囊含藥血漿對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響加入天香丹膠囊含藥血漿低、中、高濃度組單純處理影響心肌細(xì)胞后顯示，與對(duì)照組比較，天香丹膠囊含藥血漿各濃度組均可提高心肌細(xì)胞活力，并隨著含藥血漿濃度的增加，細(xì)胞存活率也逐漸增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；加入天香丹膠囊含藥血漿低、中、高濃度組干預(yù)處理影響心肌細(xì)胞后顯示，與模型組比較，天香丹膠囊含藥血漿各濃度組均能提高細(xì)胞存活率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中天香丹膠囊含藥血漿高濃度組提高細(xì)胞存活率最高，見(jiàn)圖4。

圖4 天香丹膠囊含藥血漿單純處理和干預(yù)處理心肌細(xì)胞時(shí)對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響

2.6 Hoechst 33342染色細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化對(duì)照組細(xì)胞核呈卵圓形，染色質(zhì)均勻，而模型組的心肌細(xì)胞有明顯凋亡小體的形成和細(xì)胞核皺縮，染色質(zhì)聚集等凋亡形態(tài)變化。與模型組比較，天香丹膠囊含藥血漿低、中、高濃度組對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡形態(tài)有明顯的改善，見(jiàn)圖5。

圖5 Hoechst 33342染色法觀察天香丹膠囊含藥血漿對(duì)氧化損傷的心肌細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響（×200）

2.7 心肌細(xì)胞中T-AOC，SOD和MDA的含量的變化與對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞MDA含量增加，T-AOC和SOD水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，空白血漿組中心肌細(xì)胞TAOC、SOD和MDA含量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），天香丹膠囊含藥血漿低、中、高濃度組中心肌細(xì)胞MDA含量下降，T-AOC、SOD水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.8 心肌細(xì)胞中Nrf2和IP3R蛋白表達(dá)水平的變化

與對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞中Nrf2的蛋白表達(dá)水平降低，IP3R的蛋白表達(dá)水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組相比，天香丹膠囊含藥血漿低、中、高濃度組預(yù)處理后心肌細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)水平增加，IP3R蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

表1 天香丹膠囊含藥血漿對(duì)心肌細(xì)胞的T-AOC、SOD、MDA含量的影響（±s，n=3）

表1 天香丹膠囊含藥血漿對(duì)心肌細(xì)胞的T-AOC、SOD、MDA含量的影響（±s，n=3）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組空白血漿組天香丹膠囊含藥血漿低濃度組天香丹膠囊含藥血漿中濃度組天香丹膠囊含藥血漿高濃度組T-AOC/（mmol/L）0.66±0.05 0.24±0.03*0.24±0.02 0.30±0.02#0.34±0.01#0.38±0.01#SOD/（U/mg）68.00±0.96 36.50±3.65*38.61±3.22 48.19±7.97#56.29±6.08#59.47±2.40#MDA/（nmol/mL）2.10±0.46 8.82±0.40*8.58±0.34 7.91±0.55#6.72±0.44#4.20±0.35#

圖6 天香丹膠囊含藥血漿對(duì)心肌細(xì)胞中Nrf2和IP3R蛋白水平的影響

3 討論

在心血管疾病中心肌發(fā)生缺血缺氧十分常見(jiàn)，與其他疾病一樣涉及諸多病因，其疾病危險(xiǎn)因素和風(fēng)險(xiǎn)水平相互關(guān)聯(lián)度較高且復(fù)雜多變[9]。細(xì)胞遭受持續(xù)性氧化應(yīng)激損傷后會(huì)導(dǎo)致發(fā)生過(guò)度的細(xì)胞凋亡[10]。細(xì)胞受損嚴(yán)重后會(huì)出現(xiàn)明顯凋亡形態(tài)變化，如凋亡小體的形成、細(xì)胞質(zhì)裂解和核皺縮等，還會(huì)引發(fā)Caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[11]。氧化損傷后細(xì)胞會(huì)應(yīng)激性的產(chǎn)生大量的氧自由基，過(guò)度的氧自由基釋放對(duì)細(xì)胞有毒害作用，將使細(xì)胞發(fā)生老化甚至死亡[12]。要想消除過(guò)度氧自由基釋放帶來(lái)的影響，人體中的酶和非酶類抗氧化物質(zhì)就扮演相當(dāng)重要的角色，能提高細(xì)胞的抗氧化能力從而保護(hù)細(xì)胞[13]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，天香丹膠囊含藥血漿預(yù)處理心肌細(xì)胞后，能降低心肌細(xì)胞的氧化損傷狀態(tài)，增強(qiáng)心肌細(xì)胞活力，改善心肌細(xì)胞凋亡形態(tài)變化；還能顯著降低心肌細(xì)胞MDA含量，提高心肌細(xì)胞T-AOC和SOD水平。機(jī)體如大生物網(wǎng)絡(luò)，需要各個(gè)部分協(xié)調(diào)均衡作用才能使機(jī)體始終保持平衡發(fā)展的狀態(tài)。一旦網(wǎng)絡(luò)中部分調(diào)控出現(xiàn)紊亂，機(jī)體的失調(diào)或過(guò)度調(diào)節(jié)都會(huì)影響各個(gè)靶器官的正常功能。Nrf2是細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在對(duì)抗氧化反應(yīng)過(guò)程中扮演重要角色[14]。有研究顯示，治療藥物能通過(guò)影響PI3K/Akt/Nrf2調(diào)節(jié)細(xì)胞周期穩(wěn)態(tài)、引起細(xì)胞免疫保護(hù)等[15]。IP3R為l，4，5三磷酸肌醇受體，幾乎存在于所有細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，是配體門控式Ca2+通道蛋白。當(dāng)l，4，5三磷酸肌醇（IP3）配體與受體結(jié)合后可使自身內(nèi)部鈣離子通道開(kāi)放，引發(fā)鈣庫(kù)釋放Ca2+從而調(diào)控Ca2+信號(hào)產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[16][17]。當(dāng)IP3R出現(xiàn)過(guò)度表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的Ca2+積累，嚴(yán)重時(shí)會(huì)使細(xì)胞發(fā)生不可逆受損以及壞死[18]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，天香丹膠囊含藥血漿預(yù)處理心肌細(xì)胞后，能顯著提高Nrf2的表達(dá)水平并降低鈣通道上IP3R的蛋白表達(dá)水平。

綜上所述，天香丹膠囊含藥血漿預(yù)處理原代心肌細(xì)胞后，可提高細(xì)胞的抗氧化能力減緩脂質(zhì)化反應(yīng)和細(xì)胞凋亡進(jìn)程，降低IP3R的蛋白表達(dá)減輕氧化損傷引起的Ca超載水平，從而發(fā)揮出保護(hù)心肌細(xì)胞作用。研究后期還需要對(duì)天香丹膠囊含藥血漿的成分進(jìn)行鑒定分析，明確發(fā)揮作用的物質(zhì)成分并建立在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步完善作用機(jī)制研究。