乙酰紫草素對(duì)黑色素瘤A375細(xì)胞增殖和凋亡作用研究①

錢 乾，許 芳，李 敏，李建光

（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011）

黑色素瘤是一種具有極強(qiáng)侵襲轉(zhuǎn)移能力的黑色素細(xì)胞惡性腫瘤，常起源于皮膚色素沉著部，由位于皮膚表皮層的神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞調(diào)控異常增殖形成[1]。惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，易發(fā)生血液及淋巴轉(zhuǎn)移，約80%的皮膚癌患者死于黑色素瘤，是死亡率最高的皮膚癌類型[2]。我國(guó)黑色素瘤的發(fā)病率為0.49/10萬(wàn)，占腫瘤患者的2%[3]。近年來(lái)，多種腫瘤的發(fā)病增長(zhǎng)率開(kāi)始下降，但黑色素瘤仍以每年3%的趨勢(shì)增長(zhǎng)且呈年輕化趨勢(shì)[4]。目前常規(guī)的放射、化學(xué)藥物、靶向藥物以及免疫治療藥物等治療方法，存在不良反應(yīng)明顯、單靶點(diǎn)易產(chǎn)生耐藥等諸多問(wèn)題[5]。乙酰紫草素是從新疆紫草[Arnebia euchroma(Royle)Johnst.]根中提取的一種萘醌類活性產(chǎn)物[6]，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等活性[7-9]。紫草素通過(guò)激活ROS、線粒體途徑以及JNK信號(hào)通路等誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[10,11]。乙酰紫草素作為紫草素的一種衍生物，其對(duì)黑色素瘤A375細(xì)胞的作用目前鮮有研究報(bào)道。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)黑色素瘤A375細(xì)胞，采用CCK-8法，形態(tài)學(xué)分析，流式細(xì)胞術(shù)以及Western blot法，探究乙酰紫草素對(duì)人黑色素瘤A375細(xì)胞增殖與凋亡的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo scientific公司），全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo scientific公司），冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），倒置顯微鏡（中國(guó)麥克迪奧公司），熒光顯微鏡（中國(guó)麥克迪奧公司），電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Protein Simple公司）。

1.2 試藥乙酰紫草素（新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制，含量＞98%），DMED高糖培養(yǎng)基（以色列BI公司，批號(hào)：20203012），胎牛血清（以色列BI公司，批號(hào)：2021013），雙抗（以色列BI公司，批號(hào)：20205003），0.25%胰蛋白酶（以色列BI公司，批號(hào)：20205026），PBS緩沖液（以色列BI公司，批號(hào)：20211028），DMSO（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：WXBC7821V），CCK-8試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：BJ05203090），ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：BJ07105260），二抗辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記及山羊抗鼠（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：AL10187693），Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD公司，批號(hào)：0027279），Hoechst33342染色試劑盒（北京Solarbio公司，批號(hào)：20191113），細(xì)胞裂解液RIPA（北京Solarbio公司，批號(hào)：20191206），蛋白酶抑制劑（北京Solarbio公司，批號(hào)：20191206），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京Solar?bio公司，批號(hào)：20201017），SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（北京Solarbio公司，批號(hào)：20200711），一抗β-肌動(dòng)蛋白（β-Actin，美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：20170314），一抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9（Caspase-9，美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：20170204），二抗辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗兔（美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：20170226），一抗Bax（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：GR3253667-5），一抗Bcl-2（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：GR3527453-2）。

1.3 細(xì)胞人黑色素瘤A375細(xì)胞（中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，批號(hào)：20190715）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將人黑色素瘤A375細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁鋪滿培養(yǎng)皿70%～80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 乙酰紫草素培養(yǎng)液配制稱取乙酰紫草素2.15 mg，溶于1.303 mL DMSO中，制成5 mmol/L儲(chǔ)備液，于-20℃冰箱保存。后續(xù)實(shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至各實(shí)驗(yàn)濃度（各實(shí)驗(yàn)組DMSO終體積分?jǐn)?shù)≤0.1%）。

2.3 CCK-8法檢測(cè)乙酰紫草素對(duì)A375細(xì)胞增殖的抑制作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞，用胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，以2×103個(gè)/孔接種于96孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組（細(xì)胞中加入5%FBS的培養(yǎng)基）、空白組（無(wú)細(xì)胞，孔內(nèi)加入5%FBS的培養(yǎng)基）以及乙酰紫草素不同濃度組（18.75、37.5、75、150、300、600、1 200、2 400 nmol/L），每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入CCK-8試劑10μL，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定吸光度（A）。以對(duì)照組細(xì)胞的吸光度（A）的均值作為100%活細(xì)胞數(shù)目，即對(duì)照組相對(duì)生長(zhǎng)抑制率為零。根據(jù)公式計(jì)算：細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)抑制率（%）=（A對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%。

2.4 乙酰紫草素對(duì)A375細(xì)胞形態(tài)的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于6孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（加入5%FBS培養(yǎng)基），乙酰紫草素低、中、高劑量組（400、800、1 600 nmol/L）。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用倒置顯微鏡觀察并記錄細(xì)胞形態(tài)。

2.5 Hoechst 33342熒光染色法觀察乙酰紫草素對(duì)A375細(xì)胞核的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于6孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（加入5%FBS培養(yǎng)基），乙酰紫草素低、中、高劑量組（400、800、1 600 nmol/L）。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，每孔加入1 mL Hoechst 33342染色液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min，棄去染色液，用PBS洗滌2次，在熒光顯微鏡下觀察，拍照。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)乙酰紫草素對(duì)A375細(xì)胞凋亡的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（加入5%FBS培養(yǎng)基），乙酰紫草素低、中、高劑量組（400、800、1 600 nmol/L）。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞，以1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用預(yù)冷的PBS重懸并洗滌細(xì)胞2次。按照Annexin V-FITC試劑盒說(shuō)明書向管中加入Annexin V-FITC染色液5μL，混勻后加入PI染色液5μL，混勻，室溫避光孵育15 min，于1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析細(xì)胞凋亡情況。凋亡率/%=早期凋亡率/%+晚期凋亡率/%。

2.7 Western blot檢測(cè)A375細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜，使細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（加入5%FBS培養(yǎng)基），乙酰紫草素低、中、高劑量組（400、800、1 600 nmol/L）。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用預(yù)冷PBS清洗3次，每孔加入含蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液100μL，冰浴30 min，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，以4℃12 000 r/min離心20 min，收集上清液于新的1 mL離心管中，按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行蛋白含量測(cè)定。在8%～12%的SDS-PAGE凝膠上，每孔加入20～30μg蛋白樣品，80～120 V電泳分離蛋白；300 mA轉(zhuǎn)印1 h至NC膜上；用TBST溶解的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉室溫下封閉2 h，于4℃一抗孵育過(guò)夜后，二抗孵育2 h，TBST洗膜3次后，用ECL發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)目的蛋白條帶，用Im?age J對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較當(dāng)方差齊時(shí)采用t檢驗(yàn)法，方差不齊時(shí)采用Games-Howell法。三組或三組以上組間均值的比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 乙酰紫草素對(duì)A375細(xì)胞增殖的抑制作用不同濃度乙酰紫草素分別作用A375細(xì)胞24、48、72 h后，乙酰紫草素濃度在20～2 400 nmol/L對(duì)A375細(xì)胞增殖具有抑制作用，見(jiàn)圖1。乙酰紫草素作用A375細(xì) 胞24、48和72 h的IC50分 別為(837.94±17.26)、(340.07±39.63)、(156.47±24.72)nmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 不同濃度乙酰紫草素分別在24、48、72 h對(duì)A375細(xì)胞增殖的抑制作用

3.2 不同劑量乙酰紫草素對(duì)A375細(xì)胞形態(tài)的影響

A375細(xì)胞經(jīng)不同濃度（0、400、800、1 600 nmol/L）乙酰紫草素處理48 h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化：對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)情況較好，貼壁較牢固，細(xì)胞間緊密相連，形態(tài)呈規(guī)則的長(zhǎng)梭狀，具有豐富的胞漿，少數(shù)細(xì)胞呈多角形;隨著乙酰紫草素濃度增加，貼壁細(xì)胞數(shù)目明顯減少，由長(zhǎng)梭形變?yōu)榇笮「鳟惖牟灰?guī)則形，懸浮細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞變圓，脫落，出現(xiàn)皺縮和空泡，且細(xì)胞周圍有凋亡小體形成，呈現(xiàn)出明顯的凋亡特征，見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度乙酰紫草素對(duì)A375細(xì)胞形態(tài)變化

3.3 不同劑量乙酰紫草素對(duì)A375細(xì)胞核凋亡形態(tài)學(xué)的改變Hoechst 33342熒光染色顯示，對(duì)照組細(xì)胞核輪廓清晰可見(jiàn)，小核及染色質(zhì)濃縮現(xiàn)象不明顯，呈弱藍(lán)色，乙酰紫草素處理組細(xì)胞核染色呈明顯的亮藍(lán)色，隨著乙酰紫草素的濃度增大，凋亡細(xì)胞的亮藍(lán)色熒光明顯增強(qiáng)，染色質(zhì)濃縮現(xiàn)象加重。其中，在最高濃度1 600 nmol/L時(shí)，是由于細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞貼壁能力下降，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，熒光強(qiáng)度最為明顯，見(jiàn)圖3。

3.4 不同劑量乙酰紫草素對(duì)A375細(xì)胞凋亡的影響

對(duì)照組的A375細(xì)胞凋亡率為(7.4±1.1)%，乙酰紫草素低、中、高劑量組的A375細(xì)胞凋亡率分別為(8.2±0.7)%、(16.1±1.0)%、(47.5±0.5)%，見(jiàn)圖4、5。

圖3 不同濃度乙酰紫草素對(duì)A375細(xì)胞核形態(tài)變化

3.5 不同劑量乙酰紫草素對(duì)A375細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，乙酰紫草素低、中、高劑量組A375細(xì)胞中Bax與Cleaved caspase-9表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax/Bcl-2顯著增加（P＜0.05），Cleaved caspase-9/β-Actin顯著增加（P＜0.05）。提示乙酰紫草素促進(jìn)Bax與Cleaved caspase-9的表達(dá)，抑制Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖6～8。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乙酰紫草素干預(yù)A375細(xì)胞凋亡的作用

圖5 乙酰紫草素對(duì)A375細(xì)胞凋亡率的影響

圖6 Western blot檢測(cè)A375細(xì)胞中Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-9的表達(dá)

圖7 乙酰紫草素對(duì)A375細(xì)胞中Bax/Bcl-2表達(dá)的影響

圖8 乙酰紫草素對(duì)A375細(xì)胞中Cleaved caspase-9表達(dá)的影響

4 討論

我國(guó)擁有豐富的中醫(yī)藥資源，中藥種類繁多，在抗腫瘤治療方面具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。目前已有許多植物提取物已用于治療癌癥，如紫杉醇、長(zhǎng)春新堿等。中藥紫草提取物紫草素及其衍生物能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，如乳腺癌MCF-7細(xì)胞[12]、卵巢癌A2780細(xì)胞[13]、食管癌ECA109細(xì)胞[14]、人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞[15]、人胃癌MGS-80細(xì)胞[16]等。細(xì)胞過(guò)度增殖與凋亡減少是腫瘤形成的生物學(xué)基礎(chǔ)，同樣也是藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生療效的生物學(xué)基礎(chǔ)。許多化療藥物抗腫瘤的作用機(jī)理之一都是抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞體積變小，變圓，脫落，細(xì)胞膜出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，凋亡晚期可見(jiàn)凋亡小體[17]。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最具代表性的抗凋亡和促凋亡基因。研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Bax在死亡信號(hào)的作用下升高，而B(niǎo)cl-2則在降低。從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；相反，在腫瘤細(xì)胞中，Bcl-2表達(dá)升高，Bax降低，則抑制凋亡，細(xì)胞異常增殖。Caspase-9同樣也是細(xì)胞凋亡過(guò)程中關(guān)鍵因子之一，凋亡過(guò)程一旦觸發(fā)，則會(huì)使其激活形式Cleaved caspase-9增加，后觸發(fā)級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)[18]。

本研究以人黑色素瘤A375細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察不同濃度的乙酰紫草素對(duì)人黑色素瘤A375細(xì)胞增殖與凋亡的影響，結(jié)果表明乙酰紫草素對(duì)黑色素瘤A375細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用，通過(guò)凋亡形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)及凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2及Cleaved caspase-9的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)乙酰紫草素可能通過(guò)誘導(dǎo)黑色素瘤A375細(xì)胞的凋亡從而抑制其增殖。但本研究?jī)H初步探討乙酰紫草素對(duì)黑色素瘤A375細(xì)胞的促凋亡作用，后續(xù)有待深入探討乙酰紫草素促進(jìn)A375細(xì)胞凋亡的具體途徑及其機(jī)制，為乙酰紫草素的臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)，為開(kāi)發(fā)利用中藥資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。