應(yīng)用選擇性反應(yīng)/多反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)（SRM/MRM）對驅(qū)蟲斑鳩菊黃酮成分的分析研究①

胡 雯，王紅娟，康曉靜

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科；新疆皮膚病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（XJYS1707），烏魯木齊 830001）

驅(qū)蟲斑鳩菊[Vernoni a anth elmi nt ica(L.)willd]為菊科斑鳩菊屬1年生草本植物，主要生長在新疆喀什、阿克蘇等地區(qū)，是新疆特色藥中最常用的增加色素藥[1]。研究表明驅(qū)蟲斑鳩菊的化學(xué)成分主要包括黃酮類、咖啡?；鼘幩犷?、倍半鞛類及揮發(fā)油等[2-3]，具有清熱解毒、消炎、活血化瘀、殺蟲祛斑等功效[4-5]，臨床上主要用于白癜風(fēng)、糖尿病、高血脂、抗腫瘤等的治療[6]。驅(qū)蟲斑鳩菊所含化學(xué)成分復(fù)雜，黃酮類是驅(qū)蟲斑鳩菊的主要活性成分[7-8]，具有抗氧化、抗炎等多種功能[9-10]。本研究采用選擇性反應(yīng)/多反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)（SRM/MRM），利用超高效液相色譜及MRM質(zhì)譜分析法，對驅(qū)蟲斑鳩菊種子類黃酮物質(zhì)進(jìn)行定量鑒定，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器8453型紫外可見分光光度儀（美國Agi?lent公司），F(xiàn)A-1004型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），5500 QTRAP型質(zhì)譜儀（北京柏萊斯特科技發(fā)展有限公司），ACQUITY UPLC I-Class系統(tǒng)(沃特世科技（上海）有限公司)，BR4I型離心機(jī)（北京軍洋科技有限公司），Eppendorf 5430R型低溫高速離心機(jī)（上海妙生科貿(mào)有限公司），Waters色譜柱（沃特世科技（上海）有限公司，2.5μm,2.1 mm×150 mm）。

1.2 試藥蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司），乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），甲酸（美國Honeywell公司，批號94318），甲醇（美國Fisher Chemical公司，批號A452-4），乙腈（美國Sigma公司，批號34851-4L），異丙醇（Fisher Chemical，A461-4）、標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma-Al?drich和Steraloids公司。

1.3 藥材驅(qū)蟲斑鳩菊2020年1月購于新疆烏魯木齊市埃力克維吾爾醫(yī)藥房，由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所艾塔爾主任藥師鑒定為菊科植物驅(qū)蟲斑鳩菊[Vernoni a anth elmi nt i ca(L．)Willd．]的干燥成熟種子。

1.4 驅(qū)蟲斑鳩菊種子總黃酮含量測定

1.4.1 測試溶液的配制 稱取適量粉碎后驅(qū)蟲斑鳩菊種子粉末于具塞三角瓶中，加乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)60%）50 mL，40℃超聲提取50 min后，過濾，再加入40 mL乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)60%）40℃超聲提取20 min，過濾，合并濾液，用10 mL熱乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)60%）洗滌濾渣，濾液并于容量瓶中，冷卻至室溫，用乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)60%）定容至刻度，搖勻，備用。

1.4.2 總黃酮含量測定 吸取2.0 mL測試溶液于25mL具塞比色管中，用乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)60%）補(bǔ)充至5.0 mL，加入1 mL亞硝酸鈉溶液（50 g/L）搖勻，放置6 min，加入1.5 mL硝酸鋁溶液（100 g/L），搖勻，放置6 min，加入4 mL氫氧化鈉溶液（200 g/L）用乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)60%）定容至刻度，搖勻，放置15 min。用1 cm比色皿以相應(yīng)的不添加硝酸鋁溶液（100g/L）的試樣液作為空白進(jìn)行校正，在波長510 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁含量為橫坐標(biāo)計算回歸方程為：Y=0.003 8X-0.001 8（r=0.999 8）。樣品中總黃酮含量計算公式：X=[（m1×V）/（M×V1）]×100，式中X為樣品中總黃酮含量（mg/100 g）；M為試樣的質(zhì)量（g）；m1為回歸方程計算出試樣溶液中總黃酮的質(zhì)量（mg）；V1為測定時吸取試樣的體積（mL）；V為試樣的提取體積(mL)。

1.5 SRM/MRM技術(shù)定量驅(qū)蟲斑鳩菊種子類黃酮物質(zhì)

1.5.1 類黃酮物質(zhì)提取 取“1.4.1”項(xiàng)下樣品500μL于2 mL離心管中，4 000 r/min離心5 min,取上清液過Ostra96孔板，進(jìn)樣5μL進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析。

1.5.2 高效液相色譜條件 Waters ACQUITY UPLC I-Class系統(tǒng)，自動進(jìn)樣器溫度：4℃；流動相A和B分別為0.1%甲酸水-乙腈；梯度洗脫程序?yàn)椋?～3 min B相由5%升至20%，3～4.3 min B相由20%至20%，4.3～9 min B相由20%升至45%，9～11 min B相由45%升至98%，11～13 min B相保持98%，13～13.1 min B相由98%降至5%，13.1～15 min B相保持5%，流速為：400μL/min；進(jìn)樣量：5μL。

1.5.3 質(zhì)譜分析條件 Sciex 5500 QTRAP質(zhì)譜儀，正負(fù)離子切換模式下進(jìn)行MRM質(zhì)譜分析。正離子模式離子源參數(shù)如下：Source temperature,550℃;Gas 1,55;Gas 2,50;CRU,30;ISVF,5 500 V；負(fù)離子模式離子源參數(shù)如下：Source temperature,550℃;Gas 1,55;Gas 2,50;CRU,30;ISVF,4 500 V。

1.6 KEGG數(shù)據(jù)庫富集驅(qū)蟲斑鳩菊種子黃酮類物質(zhì)參與的相關(guān)生物合成過程KEGG compound數(shù)據(jù)庫存儲了在生命活動中發(fā)揮作用的各種小分子，生物大分子和其他類型的化學(xué)物質(zhì)，包括有機(jī)酸,脂類，碳水化合物，核酸，肽鏈，維生素和輔助因子，類固醇，激素和遞質(zhì)，抗生素共9大類別。采用C number進(jìn)行標(biāo)識，用map+數(shù)字組ID表示物種通用通路ID，對于所有compound的分類詳見Brite數(shù)據(jù)庫：http://www.genome.jp/kegg-bin/get_htext?br08001.keg。

2 結(jié)果

2.1 驅(qū)蟲斑鳩菊類黃酮物質(zhì)定量結(jié)果驅(qū)蟲斑鳩菊種子總黃酮類物質(zhì)含量為0.97 g/100 g。各類黃酮化合物的色譜分離較好，峰形尖銳對稱，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，能夠?qū)Ω黝慄S酮化合物進(jìn)行質(zhì)譜定量，見圖1。對驅(qū)蟲斑鳩菊種子樣品采用SRM/MRM技術(shù)，經(jīng)高效液相色譜后進(jìn)行MRM質(zhì)譜分析，共獲得36種類黃酮化合物，含量前5位的化合物為：圣草酚（1 2 650.98 ng/100 g）、異槲皮苷（7 293.86 ng/100 g）、木樨草素（4 503.38 ng/100 g）、紫鉚素（4 320.83 ng/100 g）和柚皮素（3 390.59 ng/100 g）。異黃酮化合物芒柄花黃素和黃豆素含量較少，僅占1.07 ng/100 g和1.81 ng/100 g。保留時間最短的為(-)-表沒食子兒茶素和兒茶素，分別為2.76 min和3.26 min。保留時間最長的為鷹嘴豆芽素A和葛根素，分別為10.65 min和10.81 min，驅(qū)蟲斑鳩菊種子黃酮類物質(zhì)定量結(jié)果見表1。

圖1 黃酮類標(biāo)準(zhǔn)品混合物XIC圖譜

2.2 驅(qū)蟲斑鳩菊類黃酮各組分涉及主要分子生物學(xué)過程的KEGG富集分析驅(qū)蟲斑鳩菊類黃酮各組分在KEGG數(shù)據(jù)庫中參與的主要分子生物學(xué)過程見表2，主要包括類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成、異黃酮生物合成、泛醌和其它萜類生物合成及酪氨酸代謝等。

表2 驅(qū)蟲斑鳩菊類黃酮各組分涉及相關(guān)通路的KEGG富集分析

3 討論

本研究采用SRM/MRM技術(shù)，以標(biāo)準(zhǔn)品為參照，對特定代謝物群進(jìn)行有針對性地、特異性地檢測與分析，并可獲得目標(biāo)代謝物的絕對定量結(jié)果，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)。SRM/MRM技術(shù)基于已知或假定的反應(yīng)離子信息，有針對性地選擇數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)譜信號采集，對符合規(guī)則的離子對進(jìn)行信號記錄，去除不符合規(guī)則離子信號的干擾。在定量分析過程中，該技術(shù)首先篩選目標(biāo)代謝物特異性的母離子，然后選擇性地對這些母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)，去除其他離子的干擾，只對選定的MS/MS2離子進(jìn)行質(zhì)譜信號的采集，從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)代謝分子更為特異、靈敏、準(zhǔn)確的分析[11-12]，該方法對成分復(fù)雜的中藥研究具有重要的意義。

驅(qū)蟲斑鳩菊化學(xué)成分的復(fù)雜多樣性以及藥理活性的廣泛性，使其在抗腫瘤、抗感染、免疫學(xué)等方面都具有十分廣闊的開發(fā)前景。目前，國內(nèi)外對驅(qū)蟲斑鳩菊主要集中在粗提物方面的研究，尤其是果實(shí)的氯仿、丙酮等溶劑提取物的藥理活性研究，而對驅(qū)蟲斑鳩菊化學(xué)成分的系統(tǒng)研究較少[13-14]。有文獻(xiàn)報道[15]，從驅(qū)蟲斑鳩菊果實(shí)中共鑒定出15種黃酮類成分，其中黃酮類成分紫鉚素及紫鉚查爾酮能夠調(diào)控機(jī)體內(nèi)黑色素合成和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能，提示驅(qū)蟲斑鳩菊藥材中黃酮類成分可能是治療白癜風(fēng)的活性成分。王加利等[16]發(fā)現(xiàn)驅(qū)蟲斑鳩菊乙醇提取物中30個黃酮類物質(zhì)。本研究采用乙醇萃取法，測定驅(qū)蟲斑鳩菊種子總黃酮類物質(zhì)含量通過SRM/MRM技術(shù)，利用超高效液相色譜及MRM質(zhì)譜分析，對驅(qū)蟲斑鳩菊種子類黃酮物質(zhì)進(jìn)行定量鑒定，共獲得36種類黃酮化合物，含量前5位的化合物為：圣草酚、異槲皮苷、木樨草素、紫鉚素和黃烷類柚皮素。有研究報道通過抑制多巴胺誘導(dǎo)氧化應(yīng)激相關(guān)JNK、p38 MAPK和Akt通路激活，從而有效減少黑素細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，保護(hù)黑素細(xì)胞[17]。本研究步結(jié)合KEGG信號通路，對驅(qū)蟲斑鳩菊類黃酮成分涉及的相關(guān)通路進(jìn)行初探，為進(jìn)一步了解驅(qū)蟲斑鳩菊類黃酮成分作用機(jī)制提供幫助。