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    五味子乙素對CCl4 誘導(dǎo)的肝損傷大鼠NF-κB/COX-2 的影響

    2021-06-22 09:51:06孫惠萍張小芳
    關(guān)鍵詞:乙素五味子批號

    孫惠萍 王 劍 張小芳

    肝纖維化損傷是各種新陳代謝、病毒和毒性刺激引起的肝臟急性或慢性損傷,最終會導(dǎo)致肝硬化和各種并發(fā)癥,如門脈高壓、肝衰竭和肝細胞癌等[1]。目前肝纖維化損傷發(fā)生發(fā)展機制尚不明確。核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)是一種轉(zhuǎn)錄因子,控制參與多種生物過程,抑制NF-κB 信號通路可改善肝纖維化損傷[2-3]。在NF-κB 靶基因中,環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)可促進包括肝細胞癌和肝纖維化在內(nèi)的炎性疾病發(fā)生[4-5]。因此,抑制NF-κB 和COX-2 可能是肝損傷的潛在治療策略。五味子乙素是五味子的主要活性成分,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和保肝等多種藥理活性[6-7]。研究表明,五味子乙素通過多種調(diào)節(jié)機制減輕四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)誘導(dǎo)的肝損傷[1]。本研究探討五味子乙素對CCl4誘導(dǎo)大鼠肝損傷的保護作用及其可能機制。

    1 實驗材料

    1.1動物 雄性SPF 級Wistar 大鼠18 只,體質(zhì)量(180±20)g,購自北京維通利華有限公司,動物合格證號:201907005,許可證號:SYXK(浙)2018-0017。本實驗通過浙江省溫州市溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審核,倫理審批號:WYDW2019-0232。所有大鼠在恒定溫度(18~25℃)、濕度(40%~70%)和12h明/12h 暗循環(huán)的環(huán)境中,自由飲水和進食,飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。

    1.2細胞 人肝癌HepG2 細胞系(批號HB-8065)購于美國模式培養(yǎng)物保存中心(ATCC)。

    1.3主要試劑及儀器 Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基(DMEM)和胎牛血清(FBS,批號61870044)購自美國Gibco 公司。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,批號257621) 購自Sigma 公司,五味子乙素(批號1910028)購自成都瑞芬思生物科技有限公司,CCl4(批號40006861)和橄欖油(批號69018028)購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。NF-κB(批號sc-8008)、COX-2(批號sc-376861)和β 肌動蛋白(β-actin,批號sc-8432)購自美國Santa Cruz 公司,辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗鼠二抗(批號#7076)購自美國Cell Signaling 公司。蘇木精-伊紅(HE,批號20190517)試劑盒購自北京博奧森生物科技有限公司)。細胞計數(shù)-8(CCK-8)試劑盒(批號20190414)、BCA 蛋白質(zhì)分析試劑盒(批號20190405)、增強型ECL 化學(xué)發(fā)光試劑(批號20190528)、堿性磷酸酶(ALP,批號20190115)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT,批號20190517)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST,批號20190606)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。倒置光學(xué)顯微鏡(型號:AI09)購自日本奧林巴斯公司。酶標儀(Multiskan MS 型) 購自美國Thermo Scientific 公司,紫外可見分光光度計(UV-2800)購自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

    2 實驗方法

    2.1細胞培養(yǎng)及細胞活力測定 人肝癌HepG2 細胞系在含有10% FBS 的DMEM 中培養(yǎng),置于37℃的5%CO2環(huán)境下。使用CCK-8 測定法來測量HepG2 細胞活力,將細胞以每孔5×103個細胞接種在96 孔板中,并將細胞暴露于不同濃度(0、5、10、20、40 和80μM)五味子乙素24h。然后,將細胞與10μL CCK-8 在37℃下再孵育1h。使用酶標儀在450nm 下測量。

    2.2五味子乙素的抗氧化活性 采用DPPH 自由基清除活性測量五味子乙素的抗氧化活性。采用文獻[8]方法測定五味子乙素對DPPH 自由基的清除作用,稱取DPPH 10mg,95%乙醇配制成0.2mmol/L 溶液備用。五味子乙素配制不同濃度(50、100、150 和200μM) 樣品溶液備用。50μL 樣品溶液和50μL DPPH 溶液加到96 孔板中,在避光處靜置30min,UV-VIS 分光光度計于517nm 處測定其吸光值(Ai)。同一條件下,乙醇+樣品溶液的吸光度為Aj,DPPH溶液+乙醇的吸光度為A0。DPPH 自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%,實驗重復(fù)3 次。

    2.3動物分組及給藥 18 只大鼠根據(jù)隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組和五味子乙素組,每組6 只。模型組和五味子乙素組大鼠每周3 次腹腔注射溶于橄欖油(20%,2mL/kg)的CCl4處理,持續(xù)8 周以誘導(dǎo)肝損傷。8 周后五味子乙素組每天予50mg/kg 五味子乙素灌胃,對照組和模型組每天給予等體積0.9%氯化鈉溶液,持續(xù)4 周。末次處理后,頸脫位處死,收集大鼠肝臟和血清樣品用于生化和分子分析。

    2.4組織學(xué)分析及肝功能指標檢測 將肝組織在10%甲醛中固定,石蠟包埋切片(厚度3μm),并將其安裝在載玻片上。將切片用HE 染色,通過倒置光學(xué)顯微鏡成像。使用比色法檢測大鼠血清AST、ALT 和ALP 含量。

    2.5蛋白質(zhì)印跡 根據(jù)制造商的說明,使用裂解緩沖液試劑盒從肝臟組織和HepG2 細胞中制備總蛋白,并使用BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。在SDS-PAGE 凝膠上分離總蛋白,電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂牛奶封閉1h。將膜與一抗在4℃孵育過夜,一抗包括NF-κB、COX-2 和βactin(1∶1000),TBST 溶液洗膜3 次,加入抗鼠二抗在室溫下孵育1h,使用ECL 試劑進行顯像,條帶灰度值通過Image J 軟件進行分析,β-actin 為內(nèi)參。

    2.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s),采用單因素方差分析(ANOVA)和LSD 事后檢驗確定組間差異,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1不同濃度五味子乙素的抗氧化活性 五味子乙素的抗氧化活性隨濃度增加而增強(P<0.05),見表1。

    表1 不同濃度五味子乙素的抗氧化活性(%,±s)

    注:DPPH 為1,1-二苯基-2-三硝基苯肼;與50μM 組比較,aP<0.05;與100μM 組比較,bP<0.05;與150μM 組比較,cP<0.05

    3.2不同濃度五味子乙素抑制HepG2 細胞活力五味子乙素(40 和80μM)處理可降低HepG2 細胞活力,且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表2。

    表2 不同濃度五味子乙素對HepG2 細胞活力影響(%,±s)

    表2 不同濃度五味子乙素對HepG2 細胞活力影響(%,±s)

    注:與0μM 組比較,aP<0.05;與40μM 組比較,bP<0.05

    3.3三組大鼠體質(zhì)量、肝臟重量和肝指數(shù)比較 與對照組比較,模型組大鼠體質(zhì)量降低,肝臟重量和肝指數(shù)顯著升高(P 均<0.05)。與模型組比較,五味子乙素組大鼠體質(zhì)量升高,肝臟重量和肝指數(shù)降低(P均<0.05)。見表3。

    表3 三組大鼠體質(zhì)量、肝臟重量和肝指數(shù)比較(±s)

    表3 三組大鼠體質(zhì)量、肝臟重量和肝指數(shù)比較(±s)

    注:對照組為健康大鼠,予生理鹽水;模型組為肝損傷模型大鼠,予生理鹽水;五味子乙素組為肝損傷模型大鼠,予50mg/kg 五味子乙素灌胃;與對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05

    3.4三組大鼠肝組織肝功能比較 對照組大鼠肝細胞具有正常結(jié)構(gòu),沒有明顯炎癥跡象,在模型組中觀察到炎性細胞浸潤,提示五味子乙素處理可明顯減輕CCl4引起的損害(見圖1)。與對照組比較,模型組大鼠血清ALP、ALT、AST 水平均升高(P 均<0.05)。與模型組比較,五味子乙素組血清ALP、ALT、AST 水平降低(P 均<0.05),見表4。

    圖1 三組大鼠肝組織病理切片(蘇木精-伊紅染色×100)

    表4 三組大鼠血清ALT、AST 和ALP 水平比較(U/L,±s)

    表4 三組大鼠血清ALT、AST 和ALP 水平比較(U/L,±s)

    注:對照組為健康大鼠,予生理鹽水;模型組為肝損傷模型大鼠,予生理鹽水;五味子乙素組為肝損傷模型大鼠,予50mg/kg 五味子乙素灌胃;ALP 為血清堿性磷酸酶;ALT 為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;AST 為天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;與對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05

    3.5各組體外和體內(nèi)NF-κB 和COX-2 蛋白表達水平比較 體外實驗中,20、40μM 五味子乙素顯著降低細胞NF-κB 和COX-2 的蛋白表達(見圖2A、表5,P<0.05)。體內(nèi)實驗中,與對照組比較,模型組大鼠肝組織NF-κB 和COX-2 蛋白表達增強(P<0.05)。與模型組比較,五味子乙素組NF-κB、COX-2 蛋白表達減弱(P<0.05),見圖2B、表6。

    圖2 各組體外和體內(nèi)NF-κB 和COX-2 的蛋白表達

    表5 不同濃度五味子乙素對外HepG2 細胞NF-κB和COX-2 蛋白表達的影響(±s)

    表5 不同濃度五味子乙素對外HepG2 細胞NF-κB和COX-2 蛋白表達的影響(±s)

    注:NF-κB 為胞核因子-κB;COX-2 為環(huán)氧化酶-2;與0μM 組比較,aP<0.05

    表6 三組大鼠肝組織NF-κB 和COX-2 蛋白表達水平比較(±s)

    表6 三組大鼠肝組織NF-κB 和COX-2 蛋白表達水平比較(±s)

    注:對照組為健康大鼠,予生理鹽水;模型組為肝損傷模型大鼠,予生理鹽水;五味子乙素組為肝損傷模型大鼠,予50mg/kg 五味子乙素灌胃;NF-κB 為核因子-κB;COX-2 為環(huán)氧化酶-2;與對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05

    4 討論

    炎癥是免疫系統(tǒng)針對各種有害刺激(如病原體、毒素、輻射和創(chuàng)傷、有毒化學(xué)物質(zhì)、礦物質(zhì)和抗原)的自然保護機制[9]。但是,持續(xù)性急性炎癥可能會導(dǎo)致心血管、肝臟、代謝類疾病和癌癥[10]。本研究表明,在CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型中,使用五味子乙素可降低肝癌HepG2 細胞活力、炎性介質(zhì)NF-κB 和COX-2的表達以及血清ALT、AST 和ALP 的水平,同樣,形態(tài)學(xué)檢查證實,五味子乙素處理可減少模型組炎癥細胞浸潤并改善肝損傷。這些結(jié)果表明,五味子乙素可以有效保護肝臟免受CCl4毒性的影響,其機制可能與其對炎癥通路NF-κB/COX-2 的抑制作用有關(guān)。

    肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝癌等肝病的發(fā)生發(fā)展與自由基密切相關(guān)[8]。本研究通過使用DPPH 自由基清除活性來證實五味子乙素的體外抗氧化功效。CCl4因在動物和人類中表現(xiàn)出相似的病理變化,已被用作建立肝損傷實驗?zāi)P蚚3,11]。研究表明,使用CCl4會增加炎癥細胞因子,破壞免疫系統(tǒng)和淋巴器官,從而導(dǎo)致慢性炎癥性肝纖維化[3]。此外,本研究中CCl4增加了血清ALP、AST 和ALT 水平,反映肝損傷的程度[12-13]。而五味子乙素治療降低了這些酶的水平,表明五味子乙素可減輕CCl4誘導(dǎo)的肝損傷并改善肝功能。

    NF-κB 在肝臟中產(chǎn)生促炎性細胞因子,并調(diào)控免疫應(yīng)答,繼而引起肝病,是炎癥的主要調(diào)節(jié)劑[3]。CCl4誘導(dǎo)肝損傷大鼠肝組織NF-κB 及IκBα 蛋白表達[12],而五味子乙素處理可顯著抑制CCl4誘導(dǎo)的NF-κB 活化。抑制NF-κB 誘導(dǎo)的促炎因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、COX-2 和基質(zhì)金屬肽酶的活化,可以改善肝功能。因此,阻斷NF-κB/COX-2 途徑的激活可以阻止炎癥介質(zhì)在肝臟疾病中的募集。此外,本研究中五味子乙素降低了CCl4誘導(dǎo)的COX-2 活化,從而減少炎癥,壞死和纖維化。研究表明,五味子乙素能抑制NF-κB 活化及炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β 和IL-6)來對抗炎癥損傷[14],且對巨噬細胞中脂多糖誘導(dǎo)的炎癥具有保護作用,主要通過抑制一氧化氮和PGE2 的產(chǎn)生及NF-κB 通路表達[15]。

    綜上所述,體外實驗五味子乙素可降低體外肝癌細胞活力以及炎性介質(zhì)NF-κB 和COX-2 表達,在體內(nèi),五味子乙素降低CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠血清ALT、AST 和ALP 水平及炎性介質(zhì)NF-κB 和COX-2 表達,減少炎癥細胞浸潤,改善肝損傷,表明五味子乙素可能通過抑制NF-κB/COX-2 信號傳導(dǎo)途徑減輕炎癥,從而減輕肝損傷發(fā)展。

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