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    基于HPLC 指紋圖譜的宣肺止咳合劑傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒湯劑成分對比研究

    2021-06-22 09:51:12周曉霞劉麗琴
    關(guān)鍵詞:葛根素湯劑甘草酸

    王 瑩 何 瀠 周曉霞 劉麗琴

    中藥傳統(tǒng)湯劑是我國應(yīng)用最早、最廣泛的劑型[1-2]。然而其貯存不易、攜帶不便等缺點(diǎn),嚴(yán)重制約了其在臨床上的應(yīng)用和發(fā)展。中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)提取、濃縮、制粒、分裝等現(xiàn)代制藥技術(shù)制成[3],用于臨方調(diào)配成湯劑,即配方顆粒湯劑。其在保持傳統(tǒng)湯劑隨證加減優(yōu)勢的前提下,改進(jìn)了傳統(tǒng)湯劑的絕大多數(shù)弊端,在一定程度上推動了劑型改革創(chuàng)新,促進(jìn)了中醫(yī)藥發(fā)展。但自其試點(diǎn)二十多年以來,并未得到業(yè)界共識和有效推廣,根本原因就是配方顆粒湯劑和傳統(tǒng)湯劑的等效性問題未獲根本解決;此外,中藥配方顆粒尚無統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),造成其質(zhì)量參差不齊,限制配方顆粒劑的發(fā)展[4-5]。宣肺止咳合劑(又名清肺飲)是浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院治療上呼吸道感染、肺炎等病的經(jīng)驗方,由麻黃、葛根、苦杏仁、知母、甘草、僵蠶、石膏七味藥組成,具有清熱宣肺,止咳平喘的功效,在臨床中使用多年,療效顯著[6]。本實(shí)驗通過獲取其傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒指標(biāo)成分含量及HPLC 特征圖譜,比較二者在化學(xué)成分方面的差異,為傳統(tǒng)湯劑的改革及配方顆粒的科學(xué)合理應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1 實(shí)驗材料

    1.1試藥 宣肺止咳合劑傳統(tǒng)湯劑所用中藥飲片:麻黃(批號180127)、葛根(批號190727)、苦杏仁(批號191205)、知母(批號190715)、甘草(批號191009)、僵蠶(批號190724)、石膏(批號190807)由浙江惠松制藥有限公司提供,經(jīng)我院副主任中藥師周曉霞鑒定合格;中藥配方顆粒:9 批麻黃配方顆粒(A 廠3 批,批號191001、191003、191004,B 廠3 批,批號1907604、1907608、1903613,C 廠3 批,批號19086302、19076016、19066312)、9 批葛根配方顆粒(A 廠3 批,批號190903、190905、190906,B 廠3 批,批號1907604、1907608、1907608,C 廠3 批,批號19076394、19097016、19097322)、9 批苦杏仁配方顆粒(A 廠3 批,批號190610、190611、190612,B 廠3批,批號1908503、1908506、1908507,C 廠3 批,批號19065385、19065527、19065617)、9 批知母配方顆粒(A 廠3 批,批號190601、190603、190604,B 廠3 批,批號7115907、7115982、7115993,C 廠3 批,批號19066334、19066454、19066587)、9 批甘草配方顆粒(A 廠3 批,批號191001、191005、191008,B 廠3 批,批號1908603、1908607、1908610,C 廠3 批,批號19095214、19095416、19095517)、9 批僵蠶配方顆粒(A 廠3 批,批號190605、190702、190706,B 廠3 批,批號8011282、8011290、8011376,C 廠3 批,批號19066515、19066617、19066738)、9 批石膏配方顆粒(A 廠3 批,批號190801、190806、190807,B 廠3 批,批號1909501、1909503、1909602,C 廠3 批,批號19076714、19076832、19076938);葛根素對照品(批號110752-20181612,中國食品藥品檢定研究院,含量以95.4%計);大豆苷對照品(批號111738-201603,中國食品藥品檢定研究院,含量以93.3%計);甘草酸銨對照品(批號110731-201418,中國食品藥品檢定研究院,含量以93.1%計)。

    1.2儀器及試劑 Thermo Fisher U3000 高效液相色譜儀(DAD 二極管陣列檢測器);AL204 電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);KQ-500DB 數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。乙腈(德國默克公司,色譜純);甲醇和甲酸(杭州試劑公司,分析純);實(shí)驗用水為娃哈哈純凈水;其余試劑為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱,流動相:0.1%甲酸水(A)、乙腈(B),梯度洗脫程序:0~25min,10%~20%B;25~40min,20%~40%B;40~45min,40%~95%B;45~48min,95%B;48~49min,95%~10%B;49~53min,10%B,柱溫30℃,檢測波長254nm,進(jìn)樣量5μL,流速1.0mL/min。

    2.2樣品制備

    2.2.1傳統(tǒng)湯劑制備 按宣肺止咳合劑處方比例分別稱取麻黃50g、苦杏仁78g、石膏422g、知母118g、甘草78g、葛根118g、僵蠶78g,加入藥材用量的8 倍水量,浸泡30min,煎煮2 次,第1 次1h,第2 次30min,濾過,合并煎液濃縮至1000mL,即得,同法制備3 批。

    2.2.2配方顆粒湯劑制備 取相當(dāng)于麻黃5g、苦杏仁7.8g、石膏42.2g、知母11.8g、甘草7.8g、葛根11.8g、僵蠶7.8g 的A、B、C 廠配方顆粒(各3 批)置100mL 量瓶中,加溫水使溶解并定容至刻度,混勻,即得。

    2.3供試品溶液制備 取“2.2.1”項下3 批傳統(tǒng)湯劑,3 批A 廠、3 批B 廠及3 批C 廠配方顆粒湯劑各25mL,分別置于50mL 量瓶中,加50%甲醇適量,超聲提取30min,冷卻至室溫,加50%甲醇至刻度,經(jīng)0.45μm 微孔濾膜過濾,即得。傳統(tǒng)湯劑3 批以及3廠家各3 批配方顆粒湯劑分別標(biāo)記為S1~S12。

    2.4對照品溶液制備 分別精密稱取葛根素、大豆苷、甘草酸銨對照品適量,精密稱定,加甲醇溶解分別配制成每1mL 含葛根素1852.0μg、大豆苷450.0μg、甘草酸銨612.0μg 的混合對照品溶液。

    2.5方法學(xué)考察

    2.5.1精密度試驗 精密吸取S2 供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件,進(jìn)樣測定,連續(xù)6 次,記錄色譜圖。結(jié)果各主要共有特征峰的相對保留時間無明顯變化,RSD 在0.03%~0.24%;相對峰面積RSD 在0.42%~3.59%,葛根素、大豆苷、甘草酸銨的保留時間的RSD 值分別為0.06%、0.22%、0.16%,峰面積的RSD 值分別為3.19%、2.65%、3.06%,表明儀器精密度良好。

    2.5.2穩(wěn)定性試驗 精密吸取S2 供試品溶液,分別于制備后0、2、4、6、8、12、24h 進(jìn)樣,按“2.1”項下色譜條件測定。結(jié)果各主要共有特征峰的相對保留時間無明顯變化,RSD 在0.08%~0.36%;相對峰面積RSD在0.71%~4.42%,葛根素、大豆苷、甘草酸銨的保留時間的RSD 值分別為0.17%、0.12%、0.21%,峰面積的RSD 值分別為3.27%、1.26%、3.68%,表明供試品在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.5.3重復(fù)性試驗 取同一批傳統(tǒng)湯劑樣品(S2),按“2.3”項下的方法,制備6 份供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件測定,記錄色譜圖。結(jié)果各主要共有特征峰的相對保留時間無明顯變化,RSD 在0.04%~0.68%;相對峰面積RSD 在0.15%~2.46%,葛根素、大豆苷、甘草酸銨的保留時間的RSD 值分別為0.21%、0.43%、0.36%,峰面積的RSD 值分別為1.99%、1.43%、2.51%,表明方法重復(fù)性良好。

    2.5.4線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液2、4、5、6、8、10mL,分別置10mL 量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,配成系列濃度的混合對照品溶液。取10μL 注入液相色譜儀,測定峰面積值,以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),對照品濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果葛根素對照品溶液回歸方程為Y=4.1621X-0.0744,r=1.0000,線性范圍為370.4~1852.0μg/mL,大豆苷對照品溶液回歸方程為Y=4.3559X+0.074,r=0.9999,線性范圍為90~450.0μg/mL,甘草酸銨對照品溶液回歸方程為Y=0.795X+0.0414,r=0.9999,線性范圍為122.4~612.0μg/mL。

    2.5.5加樣回收率試驗 精密量取已測定指標(biāo)成分量的傳統(tǒng)湯劑樣品(S2)0.50mL 共6 份,分別精密加入混合對照品溶液1.0mL,加50%甲醇定容至25mL,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析,并計算回收率。結(jié)果葛根素、大豆苷、甘草酸的平均回收率分別為99.2%、98.8%、99.6%,RSD 分別為1.0%、0.8%、0.9%。

    2.7指紋圖譜建立及共有峰確定

    2.7.1指紋圖譜采集 分別精密吸取“2.3”和“2.4”項下對照品溶液和各供試品溶液,按照“2.1”項下建立的色譜條件進(jìn)樣測定,分別記錄3 批傳統(tǒng)湯劑及3廠家3 批配方顆粒湯劑的HPLC 指紋圖譜。

    2.7.2指紋圖譜建立 將12 批樣品的色譜圖依次導(dǎo)入國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004 版A)》,構(gòu)建HPLC 指紋圖譜,共標(biāo)示出共有峰28 個,通過與對照品保留時間及紫外吸收光譜圖比對,指認(rèn)了9 號峰葛根素、12 號峰大豆苷、26 號峰甘草酸銨,結(jié)果見圖1。

    圖1 混合對照品色譜圖(A)和宣肺止咳合劑不同樣品匹配色譜圖(B)(9-葛根素12-大豆苷26-甘草酸)

    2.8指紋圖譜比較

    2.8.1化學(xué)成分種類和數(shù)目比較 通過指紋圖譜峰數(shù)的比較,傳統(tǒng)湯劑中的23 號峰在配方顆粒3 廠家中均不存在;傳統(tǒng)湯劑中的26 號峰的峰面積均比配方顆粒3 廠家??;9 號峰在B 廠家和C 廠家中峰面積較小。綜上所述,3 種配方顆粒湯劑及傳統(tǒng)湯劑在化學(xué)成分的種類和數(shù)目上存在一定的差異。

    2.8.2共有峰總峰面積比較 以3 批傳統(tǒng)湯劑色譜圖中所有共有峰總峰面積的均值定為1,采用歸一化法求得其他供試品共有峰總峰面積的相對值。結(jié)果顯示4 類供試品(傳統(tǒng)湯劑、A、B、C 廠配方顆粒)中各共有峰峰面積總和比值分別為1.00、1.02、0.67、0.59,說明A 廠配方顆粒各成分含量的總和最接近傳統(tǒng)湯劑,B、C 廠配方顆粒各成分含量的總和均低于傳統(tǒng)湯劑。

    2.8.3指標(biāo)性成分含量比較 取3 批傳統(tǒng)湯劑,3 批A 廠、3 批B 廠及3 批C 廠配方顆粒湯劑,按“2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件測定指標(biāo)性成分的含量。運(yùn)用t 檢驗評價配方顆粒湯劑供試品中葛根素、大豆苷、甘草酸銨含量與傳統(tǒng)湯劑的差異(見圖2)。由圖2 可知,不同供試品中葛根素含量的排序為A 廠配方顆粒湯劑>傳統(tǒng)湯劑>B 廠配方顆粒湯劑>C 廠配方顆粒湯劑,而大豆苷含量的排序為傳統(tǒng)湯劑>A 廠配方顆粒湯劑>B 廠配方顆粒湯劑>C 廠配方顆粒湯劑,甘草酸銨含量的排序為B 廠配方顆粒湯劑>C 廠配方顆粒湯劑>A 廠配方顆粒湯劑>傳統(tǒng)湯劑。

    圖2 宣肺止咳合劑不同樣品中葛根素、大豆苷、甘草酸銨含量的比較(n=3)

    2.8.4指紋圖譜的相關(guān)性 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A 版)》對傳統(tǒng)湯劑、3 廠家配方顆粒供試品的特征圖譜相關(guān)參數(shù)進(jìn)行評價,設(shè)定參照圖譜,將色譜峰自動匹配,生成對照圖譜(R,平均值法),并進(jìn)行譜峰差異性評價和整體相似性評價。結(jié)果顯示,3 廠家配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑相似度均大于0.95,相似度較高。整體上,A 廠的相似度略高于B 廠和C 廠。見表1。

    表1 相似度計算結(jié)果

    2.8.5主成分分析 主成分分析法(PCA)是對多變量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理的一種數(shù)據(jù)線性投影方法。近年來,主成分分析法被越來越多應(yīng)用于中藥質(zhì)量評價中[9]。本研究通過對3 批傳統(tǒng)湯劑及3 廠家3 批配方顆粒湯劑指紋圖譜特征峰的峰面積進(jìn)行PCA 分析,結(jié)果顯示,第一主成分(PC1)的累積貢獻(xiàn)率為97.02%,第二主成分(PC2)的累積貢獻(xiàn)率為1.08%,其他累積貢獻(xiàn)率可忽略不計。3 批傳統(tǒng)湯劑及3 廠家3 批配方顆粒湯劑被劃分在不同的區(qū)域范圍,區(qū)分效果明顯。見圖3。

    圖3 3 批傳統(tǒng)湯劑與3 廠家3 批配方顆粒湯劑的PCA 得分圖(A)和載荷圖(B)

    3 討論

    3.1色譜條件的選擇 預(yù)實(shí)驗比較了等度洗脫和梯度洗脫,等度洗脫各成分分離度小,所以選擇梯度洗脫。對不同梯度洗脫系統(tǒng)(甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液)進(jìn)行了比較,結(jié)果以乙腈-0.1%甲酸水溶液系統(tǒng)分離度較好,基線較平穩(wěn),能夠滿足指紋圖譜對色譜峰的要求。采用光電二極管陣列檢測器(DAD)于190~400nm 波長進(jìn)行掃描,結(jié)合色譜峰個數(shù)和強(qiáng)度綜合考察,結(jié)果表明主要成分在254nm 波長處有最大吸收且吸收峰較多,可較全面地體現(xiàn)樣品的圖譜特征。

    3.2指標(biāo)性成分的確定 宣肺止咳合劑中君藥麻黃主要含有生物堿,預(yù)實(shí)驗未找到合適的色譜條件進(jìn)行定量分析,臣藥葛根及佐使藥甘草在全方發(fā)揮了重要作用,葛根的主要成分包括異黃酮類、三萜類化合物、生物堿類等,異黃酮類主要有葛根素、大豆苷等;葛根素和大豆苷,具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗過敏、改善血循環(huán)等作用[7],甘草的主要化學(xué)成分以三萜皂苷類和黃酮類為主,三萜類化合物中最主要的是就是甘草酸,具有解毒、抗炎、鎮(zhèn)咳等藥理作用[8]。故選擇葛根中的葛根素、大豆苷以及甘草中的甘草酸這3 種成分作為指標(biāo)性成分。

    3.3指標(biāo)性成分含量分析比較 通過對比傳統(tǒng)湯劑和3 廠家配方顆粒湯劑指標(biāo)性成分的含量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn),葛根素在傳統(tǒng)湯劑中的含量明顯低于A 廠家配方顆粒湯劑的含量,高于B、C 廠家配方顆粒湯劑的含量,大豆苷在傳統(tǒng)湯劑中的含量明顯高于配方顆粒湯劑中的含量,而甘草酸銨在傳統(tǒng)湯劑的含量明顯低于配方顆粒湯劑的含量。傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒指標(biāo)成分含量有極顯著差異,提示臨床用藥時應(yīng)以傳統(tǒng)湯劑為參考標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合傳統(tǒng)湯劑的成分、藥性特點(diǎn)以及患者情況等進(jìn)行全面權(quán)衡,合理確定給藥劑量[9]。3 廠家配方顆粒湯劑的指標(biāo)成分含量有顯著差異,除原料因素和制劑工藝因素外,缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)也是重要的原因。

    3.4指紋圖譜分析比較 指紋圖譜技術(shù)能全面反映中藥飲片或制劑的內(nèi)在化學(xué)特征,指紋圖譜技術(shù)已成為控制中藥質(zhì)量的最有效手段[10-11]。本研究通過比較傳統(tǒng)湯劑及3 廠家配方顆粒湯劑的指紋圖譜,結(jié)果表明傳統(tǒng)湯劑和配方顆粒在化學(xué)成分的種類、數(shù)目和含量上均有一定的差異,湯劑的化學(xué)成分種類稍多,其含量因化學(xué)成分不同而有升有降。表明中藥復(fù)方煎煮過程中,會因成分之間增溶、氧化、水解、還原等反應(yīng)的發(fā)生,導(dǎo)致一些成分含量的變化,甚至產(chǎn)生新的化學(xué)成分[12-13]。相關(guān)性分析結(jié)果表明,傳統(tǒng)湯劑與3 廠家配方顆粒湯劑的相似度均大于0.95,相似度較高。說明他們所含化學(xué)成分間的比例與傳統(tǒng)湯劑差異較小。共有峰總峰面積對比分析結(jié)果表明,A 廠配方顆粒各成分含量的總和最接近傳統(tǒng)湯劑,B、C 廠配方顆粒各成分含量的總和均低于傳統(tǒng)湯劑,與相似度分析結(jié)果一致。

    綜上所述,本實(shí)驗通過全面對比傳統(tǒng)湯劑及配方顆粒的差異,表明傳統(tǒng)湯劑的化學(xué)成分種類稍多,配方顆粒相對較少,其指標(biāo)成分的含量有升有降,表明傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒在化學(xué)成分及含量上均有一定差異,應(yīng)當(dāng)對中藥配方顆粒的臨床推薦用量進(jìn)行校正,促進(jìn)臨床合理應(yīng)用。本實(shí)驗僅從體外化學(xué)成分層面對其進(jìn)行對比,其入血成分及藥效層面需進(jìn)一步深入探討,以獲取更全面的差異規(guī)律。

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