基于HPLC 指紋圖譜的宣肺止咳合劑傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒湯劑成分對比研究

王 瑩 何 瀠 周曉霞 劉麗琴

中藥傳統(tǒng)湯劑是我國應(yīng)用最早、最廣泛的劑型[1-2]。然而其貯存不易、攜帶不便等缺點(diǎn)，嚴(yán)重制約了其在臨床上的應(yīng)用和發(fā)展。中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)提取、濃縮、制粒、分裝等現(xiàn)代制藥技術(shù)制成[3]，用于臨方調(diào)配成湯劑，即配方顆粒湯劑。其在保持傳統(tǒng)湯劑隨證加減優(yōu)勢的前提下，改進(jìn)了傳統(tǒng)湯劑的絕大多數(shù)弊端，在一定程度上推動了劑型改革創(chuàng)新，促進(jìn)了中醫(yī)藥發(fā)展。但自其試點(diǎn)二十多年以來，并未得到業(yè)界共識和有效推廣，根本原因就是配方顆粒湯劑和傳統(tǒng)湯劑的等效性問題未獲根本解決；此外，中藥配方顆粒尚無統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，造成其質(zhì)量參差不齊，限制配方顆粒劑的發(fā)展[4-5]。宣肺止咳合劑（又名清肺飲）是浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院治療上呼吸道感染、肺炎等病的經(jīng)驗方，由麻黃、葛根、苦杏仁、知母、甘草、僵蠶、石膏七味藥組成，具有清熱宣肺，止咳平喘的功效，在臨床中使用多年，療效顯著[6]。本實(shí)驗通過獲取其傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒指標(biāo)成分含量及HPLC 特征圖譜，比較二者在化學(xué)成分方面的差異，為傳統(tǒng)湯劑的改革及配方顆粒的科學(xué)合理應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗材料

1.1試藥 宣肺止咳合劑傳統(tǒng)湯劑所用中藥飲片：麻黃（批號180127）、葛根（批號190727）、苦杏仁（批號191205）、知母（批號190715）、甘草（批號191009）、僵蠶（批號190724）、石膏（批號190807）由浙江惠松制藥有限公司提供，經(jīng)我院副主任中藥師周曉霞鑒定合格；中藥配方顆粒：9 批麻黃配方顆粒（A 廠3 批，批號191001、191003、191004，B 廠3 批，批號1907604、1907608、1903613，C 廠3 批，批號19086302、19076016、19066312）、9 批葛根配方顆粒（A 廠3 批，批號190903、190905、190906，B 廠3 批，批號1907604、1907608、1907608，C 廠3 批，批號19076394、19097016、19097322）、9 批苦杏仁配方顆粒（A 廠3 批，批號190610、190611、190612，B 廠3批，批號1908503、1908506、1908507，C 廠3 批，批號19065385、19065527、19065617）、9 批知母配方顆粒（A 廠3 批，批號190601、190603、190604，B 廠3 批，批號7115907、7115982、7115993，C 廠3 批，批號19066334、19066454、19066587）、9 批甘草配方顆粒（A 廠3 批，批號191001、191005、191008，B 廠3 批，批號1908603、1908607、1908610，C 廠3 批，批號19095214、19095416、19095517）、9 批僵蠶配方顆粒（A 廠3 批，批號190605、190702、190706，B 廠3 批，批號8011282、8011290、8011376，C 廠3 批，批號19066515、19066617、19066738）、9 批石膏配方顆粒（A 廠3 批，批號190801、190806、190807，B 廠3 批，批號1909501、1909503、1909602，C 廠3 批，批號19076714、19076832、19076938）；葛根素對照品（批號110752-20181612，中國食品藥品檢定研究院，含量以95.4%計）；大豆苷對照品（批號111738-201603，中國食品藥品檢定研究院，含量以93.3%計）；甘草酸銨對照品（批號110731-201418，中國食品藥品檢定研究院，含量以93.1%計）。

1.2儀器及試劑 Thermo Fisher U3000 高效液相色譜儀（DAD 二極管陣列檢測器）；AL204 電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；KQ-500DB 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。乙腈（德國默克公司，色譜純）；甲醇和甲酸（杭州試劑公司，分析純）；實(shí)驗用水為娃哈哈純凈水；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱，流動相：0.1%甲酸水（A）、乙腈（B），梯度洗脫程序：0～25min，10%～20%B；25～40min，20%～40%B；40～45min，40%～95%B；45～48min，95%B；48～49min，95%～10%B；49～53min，10%B，柱溫30℃，檢測波長254nm，進(jìn)樣量5μL，流速1.0mL/min。

2.2樣品制備

2.2.1傳統(tǒng)湯劑制備 按宣肺止咳合劑處方比例分別稱取麻黃50g、苦杏仁78g、石膏422g、知母118g、甘草78g、葛根118g、僵蠶78g，加入藥材用量的8 倍水量，浸泡30min，煎煮2 次，第1 次1h，第2 次30min，濾過，合并煎液濃縮至1000mL，即得，同法制備3 批。

2.2.2配方顆粒湯劑制備 取相當(dāng)于麻黃5g、苦杏仁7.8g、石膏42.2g、知母11.8g、甘草7.8g、葛根11.8g、僵蠶7.8g 的A、B、C 廠配方顆粒（各3 批）置100mL 量瓶中，加溫水使溶解并定容至刻度，混勻，即得。

2.3供試品溶液制備 取“2.2.1”項下3 批傳統(tǒng)湯劑，3 批A 廠、3 批B 廠及3 批C 廠配方顆粒湯劑各25mL，分別置于50mL 量瓶中，加50%甲醇適量，超聲提取30min，冷卻至室溫，加50%甲醇至刻度，經(jīng)0.45μm 微孔濾膜過濾，即得。傳統(tǒng)湯劑3 批以及3廠家各3 批配方顆粒湯劑分別標(biāo)記為S1～S12。

2.4對照品溶液制備 分別精密稱取葛根素、大豆苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解分別配制成每1mL 含葛根素1852.0μg、大豆苷450.0μg、甘草酸銨612.0μg 的混合對照品溶液。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1精密度試驗 精密吸取S2 供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，進(jìn)樣測定，連續(xù)6 次，記錄色譜圖。結(jié)果各主要共有特征峰的相對保留時間無明顯變化，RSD 在0.03%～0.24%；相對峰面積RSD 在0.42%～3.59%，葛根素、大豆苷、甘草酸銨的保留時間的RSD 值分別為0.06%、0.22%、0.16%，峰面積的RSD 值分別為3.19%、2.65%、3.06%，表明儀器精密度良好。

2.5.2穩(wěn)定性試驗 精密吸取S2 供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24h 進(jìn)樣，按“2.1”項下色譜條件測定。結(jié)果各主要共有特征峰的相對保留時間無明顯變化，RSD 在0.08%～0.36%；相對峰面積RSD在0.71%～4.42%，葛根素、大豆苷、甘草酸銨的保留時間的RSD 值分別為0.17%、0.12%、0.21%，峰面積的RSD 值分別為3.27%、1.26%、3.68%，表明供試品在24h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3重復(fù)性試驗 取同一批傳統(tǒng)湯劑樣品（S2），按“2.3”項下的方法，制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。結(jié)果各主要共有特征峰的相對保留時間無明顯變化，RSD 在0.04%～0.68%；相對峰面積RSD 在0.15%～2.46%，葛根素、大豆苷、甘草酸銨的保留時間的RSD 值分別為0.21%、0.43%、0.36%，峰面積的RSD 值分別為1.99%、1.43%、2.51%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.4線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液2、4、5、6、8、10mL，分別置10mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成系列濃度的混合對照品溶液。取10μL 注入液相色譜儀，測定峰面積值，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果葛根素對照品溶液回歸方程為Y=4.1621X-0.0744，r=1.0000，線性范圍為370.4～1852.0μg/mL，大豆苷對照品溶液回歸方程為Y=4.3559X+0.074，r=0.9999，線性范圍為90～450.0μg/mL，甘草酸銨對照品溶液回歸方程為Y=0.795X+0.0414，r=0.9999，線性范圍為122.4～612.0μg/mL。

2.5.5加樣回收率試驗 精密量取已測定指標(biāo)成分量的傳統(tǒng)湯劑樣品（S2）0.50mL 共6 份，分別精密加入混合對照品溶液1.0mL，加50%甲醇定容至25mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，并計算回收率。結(jié)果葛根素、大豆苷、甘草酸的平均回收率分別為99.2%、98.8%、99.6%，RSD 分別為1.0%、0.8%、0.9%。

2.7指紋圖譜建立及共有峰確定

2.7.1指紋圖譜采集 分別精密吸取“2.3”和“2.4”項下對照品溶液和各供試品溶液，按照“2.1”項下建立的色譜條件進(jìn)樣測定，分別記錄3 批傳統(tǒng)湯劑及3廠家3 批配方顆粒湯劑的HPLC 指紋圖譜。

2.7.2指紋圖譜建立 將12 批樣品的色譜圖依次導(dǎo)入國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2004 版A）》，構(gòu)建HPLC 指紋圖譜，共標(biāo)示出共有峰28 個，通過與對照品保留時間及紫外吸收光譜圖比對，指認(rèn)了9 號峰葛根素、12 號峰大豆苷、26 號峰甘草酸銨，結(jié)果見圖1。

圖1 混合對照品色譜圖（A）和宣肺止咳合劑不同樣品匹配色譜圖（B）（9-葛根素12-大豆苷26-甘草酸）

2.8指紋圖譜比較

2.8.1化學(xué)成分種類和數(shù)目比較 通過指紋圖譜峰數(shù)的比較，傳統(tǒng)湯劑中的23 號峰在配方顆粒3 廠家中均不存在；傳統(tǒng)湯劑中的26 號峰的峰面積均比配方顆粒3 廠家??；9 號峰在B 廠家和C 廠家中峰面積較小。綜上所述，3 種配方顆粒湯劑及傳統(tǒng)湯劑在化學(xué)成分的種類和數(shù)目上存在一定的差異。

2.8.2共有峰總峰面積比較 以3 批傳統(tǒng)湯劑色譜圖中所有共有峰總峰面積的均值定為1，采用歸一化法求得其他供試品共有峰總峰面積的相對值。結(jié)果顯示4 類供試品（傳統(tǒng)湯劑、A、B、C 廠配方顆粒）中各共有峰峰面積總和比值分別為1.00、1.02、0.67、0.59，說明A 廠配方顆粒各成分含量的總和最接近傳統(tǒng)湯劑，B、C 廠配方顆粒各成分含量的總和均低于傳統(tǒng)湯劑。

2.8.3指標(biāo)性成分含量比較 取3 批傳統(tǒng)湯劑，3 批A 廠、3 批B 廠及3 批C 廠配方顆粒湯劑，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定指標(biāo)性成分的含量。運(yùn)用t 檢驗評價配方顆粒湯劑供試品中葛根素、大豆苷、甘草酸銨含量與傳統(tǒng)湯劑的差異（見圖2）。由圖2 可知，不同供試品中葛根素含量的排序為A 廠配方顆粒湯劑＞傳統(tǒng)湯劑＞B 廠配方顆粒湯劑＞C 廠配方顆粒湯劑，而大豆苷含量的排序為傳統(tǒng)湯劑＞A 廠配方顆粒湯劑＞B 廠配方顆粒湯劑＞C 廠配方顆粒湯劑，甘草酸銨含量的排序為B 廠配方顆粒湯劑＞C 廠配方顆粒湯劑＞A 廠配方顆粒湯劑＞傳統(tǒng)湯劑。

圖2 宣肺止咳合劑不同樣品中葛根素、大豆苷、甘草酸銨含量的比較（n=3）

2.8.4指紋圖譜的相關(guān)性 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A 版）》對傳統(tǒng)湯劑、3 廠家配方顆粒供試品的特征圖譜相關(guān)參數(shù)進(jìn)行評價，設(shè)定參照圖譜，將色譜峰自動匹配，生成對照圖譜（R，平均值法），并進(jìn)行譜峰差異性評價和整體相似性評價。結(jié)果顯示，3 廠家配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑相似度均大于0.95，相似度較高。整體上，A 廠的相似度略高于B 廠和C 廠。見表1。

表1 相似度計算結(jié)果

2.8.5主成分分析 主成分分析法（PCA）是對多變量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理的一種數(shù)據(jù)線性投影方法。近年來，主成分分析法被越來越多應(yīng)用于中藥質(zhì)量評價中[9]。本研究通過對3 批傳統(tǒng)湯劑及3 廠家3 批配方顆粒湯劑指紋圖譜特征峰的峰面積進(jìn)行PCA 分析，結(jié)果顯示，第一主成分（PC1）的累積貢獻(xiàn)率為97.02%，第二主成分（PC2）的累積貢獻(xiàn)率為1.08%，其他累積貢獻(xiàn)率可忽略不計。3 批傳統(tǒng)湯劑及3 廠家3 批配方顆粒湯劑被劃分在不同的區(qū)域范圍，區(qū)分效果明顯。見圖3。

圖3 3 批傳統(tǒng)湯劑與3 廠家3 批配方顆粒湯劑的PCA 得分圖（A）和載荷圖（B）

3 討論

3.1色譜條件的選擇 預(yù)實(shí)驗比較了等度洗脫和梯度洗脫，等度洗脫各成分分離度小，所以選擇梯度洗脫。對不同梯度洗脫系統(tǒng)（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液）進(jìn)行了比較，結(jié)果以乙腈-0.1%甲酸水溶液系統(tǒng)分離度較好，基線較平穩(wěn)，能夠滿足指紋圖譜對色譜峰的要求。采用光電二極管陣列檢測器（DAD）于190～400nm 波長進(jìn)行掃描，結(jié)合色譜峰個數(shù)和強(qiáng)度綜合考察，結(jié)果表明主要成分在254nm 波長處有最大吸收且吸收峰較多，可較全面地體現(xiàn)樣品的圖譜特征。

3.2指標(biāo)性成分的確定 宣肺止咳合劑中君藥麻黃主要含有生物堿，預(yù)實(shí)驗未找到合適的色譜條件進(jìn)行定量分析，臣藥葛根及佐使藥甘草在全方發(fā)揮了重要作用，葛根的主要成分包括異黃酮類、三萜類化合物、生物堿類等，異黃酮類主要有葛根素、大豆苷等；葛根素和大豆苷，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗過敏、改善血循環(huán)等作用[7]，甘草的主要化學(xué)成分以三萜皂苷類和黃酮類為主，三萜類化合物中最主要的是就是甘草酸，具有解毒、抗炎、鎮(zhèn)咳等藥理作用[8]。故選擇葛根中的葛根素、大豆苷以及甘草中的甘草酸這3 種成分作為指標(biāo)性成分。

3.3指標(biāo)性成分含量分析比較 通過對比傳統(tǒng)湯劑和3 廠家配方顆粒湯劑指標(biāo)性成分的含量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葛根素在傳統(tǒng)湯劑中的含量明顯低于A 廠家配方顆粒湯劑的含量，高于B、C 廠家配方顆粒湯劑的含量，大豆苷在傳統(tǒng)湯劑中的含量明顯高于配方顆粒湯劑中的含量，而甘草酸銨在傳統(tǒng)湯劑的含量明顯低于配方顆粒湯劑的含量。傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒指標(biāo)成分含量有極顯著差異，提示臨床用藥時應(yīng)以傳統(tǒng)湯劑為參考標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合傳統(tǒng)湯劑的成分、藥性特點(diǎn)以及患者情況等進(jìn)行全面權(quán)衡，合理確定給藥劑量[9]。3 廠家配方顆粒湯劑的指標(biāo)成分含量有顯著差異，除原料因素和制劑工藝因素外，缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)也是重要的原因。

3.4指紋圖譜分析比較 指紋圖譜技術(shù)能全面反映中藥飲片或制劑的內(nèi)在化學(xué)特征，指紋圖譜技術(shù)已成為控制中藥質(zhì)量的最有效手段[10-11]。本研究通過比較傳統(tǒng)湯劑及3 廠家配方顆粒湯劑的指紋圖譜，結(jié)果表明傳統(tǒng)湯劑和配方顆粒在化學(xué)成分的種類、數(shù)目和含量上均有一定的差異，湯劑的化學(xué)成分種類稍多，其含量因化學(xué)成分不同而有升有降。表明中藥復(fù)方煎煮過程中，會因成分之間增溶、氧化、水解、還原等反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致一些成分含量的變化，甚至產(chǎn)生新的化學(xué)成分[12-13]。相關(guān)性分析結(jié)果表明，傳統(tǒng)湯劑與3 廠家配方顆粒湯劑的相似度均大于0.95，相似度較高。說明他們所含化學(xué)成分間的比例與傳統(tǒng)湯劑差異較小。共有峰總峰面積對比分析結(jié)果表明，A 廠配方顆粒各成分含量的總和最接近傳統(tǒng)湯劑，B、C 廠配方顆粒各成分含量的總和均低于傳統(tǒng)湯劑，與相似度分析結(jié)果一致。

綜上所述，本實(shí)驗通過全面對比傳統(tǒng)湯劑及配方顆粒的差異，表明傳統(tǒng)湯劑的化學(xué)成分種類稍多，配方顆粒相對較少，其指標(biāo)成分的含量有升有降，表明傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒在化學(xué)成分及含量上均有一定差異，應(yīng)當(dāng)對中藥配方顆粒的臨床推薦用量進(jìn)行校正，促進(jìn)臨床合理應(yīng)用。本實(shí)驗僅從體外化學(xué)成分層面對其進(jìn)行對比，其入血成分及藥效層面需進(jìn)一步深入探討，以獲取更全面的差異規(guī)律。