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    3D 打印支架聯(lián)合iPSCs-NSCs 對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)細胞凋亡及運動功能的影響

    2021-06-22 09:51:04李長明鄧小梅周化騰全仁夫
    關(guān)鍵詞:脊髓干細胞引物

    李長明 鄧小梅 周化騰 全仁夫

    脊髓損傷一直是困擾醫(yī)學(xué)界的難題,常見于高處墜落、交通外傷,且呈現(xiàn)發(fā)病率高、致殘率高的特點,常造成損傷平面以下的感覺、運動喪失,甚至癱瘓[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計,中國有超過100 萬的脊柱脊髓損傷患者,且以每年12 萬的速度增長,不僅給患者帶來嚴重的身心負擔,同時也給家庭和社會形成了沉重的經(jīng)濟負擔[2]。目前關(guān)于修復(fù)受損神經(jīng)的研究越來越多,其中種子細胞+生物支架療法被證實可以有效促進脊髓損傷的修復(fù)[3-4],但是其機制不明了,且細胞來源受到倫理學(xué)限制,難以擴大應(yīng)用范圍。因此,本實驗采用人尿液來源重編程誘導(dǎo)性多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)并分化為神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)吸附于3D 打印支架上,移植于脊髓受損區(qū)域,觀察其對大鼠運動神經(jīng)元凋亡及運動功能的影響,并探討其可能的機制。

    1 實驗材料

    1.1動物 選用雄性SD 大鼠42 只,SPF 級,體質(zhì)量200~250g,由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供[許可證號:SCXK(湘)2019-0004],給予足量的水和飼料,環(huán)境溫度23~25℃,相對濕度40%~60%,明暗光照12h/12h,分籠飼養(yǎng)。本研究經(jīng)倫理委員會審核,對動物處置方法符合相關(guān)倫理要求[倫理審查號:20170625182365]。

    1.2主要試劑與儀器 聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)(批號P133293)購于美國sigma 公司;山羊抗兔B 淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)多克隆抗體(批號BS1511)、山羊抗兔Bcl 相關(guān)X 蛋白(Bax)多克隆抗體(批號BS1725)和半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)(批號BS7004)均購于美國Bioworld 公司;原位末端轉(zhuǎn)移酶標記法(TUNEL)試劑盒(批號11684817910)購于中國羅氏生物公司。儀器包括熒光顯微鏡(型號CKX53)購于日本Olympus 公司;3D 打印機(型號Bio-Architect-Pro)購于中國杭州捷諾飛生物科技有限公司;可控性皮質(zhì)損傷撞擊儀(型號mode6.3)購于美國Custom Design 公司;手術(shù)器械購于中國江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司。

    2 實驗方法

    2.1支架細胞預(yù)處理 將預(yù)先制備的3D 支架[5]截成2~3mm 的小段,置于干細胞培養(yǎng)基中浸泡48h后,在無菌操作臺中風(fēng)干,滅菌備用。按前期實驗方法制備人來源iPSCs[6],并分離鑒定,并向NSCs 分化,將iPSCs-NSCs 細胞培養(yǎng)至第7 天時,消化計數(shù),將1×106個細胞濃縮為0.2mL,滴于預(yù)處理過的支架上,置于培養(yǎng)箱中2h 后用于實驗?zāi)P椭苽渑c術(shù)后處理。

    2.2實驗設(shè)計與分組 42 只SD 大鼠(SPF 級)按照隨機數(shù)字表法分為三組,每組14 只。采用改良Allen's 法通過可控性皮質(zhì)脊髓撞擊儀構(gòu)建脊髓損傷模型[7]。術(shù)后分籠飼養(yǎng),37℃恒溫下保溫,每天以crede 手法按壓排尿3 次,預(yù)防泌尿系統(tǒng)感染,術(shù)后3天以每天2 次的頻率腹腔注射相同劑量慶大霉素(8mg/kg)預(yù)防感染。1 周后進行實驗。麻醉后于T9-T10節(jié)段去除椎板,三組均切除損傷處脊髓2~3mm,給予不同干預(yù)措施。假手術(shù)組:只打開椎板;模型組:制作脊髓損傷模型,植入DMEM 培養(yǎng)液0.2mL;iPSCs-NSCs 組:植入載iPSCs-NSCs 的2~3mm 支架預(yù)處理。模型成功標準[8]:術(shù)后即刻大鼠出現(xiàn)痙攣性擺動,擺尾反射、雙下肢遲緩性癱瘓,術(shù)后2h 進行Basso,Beattie and Bresnahan(BBB)評分評估小鼠后肢運動能力,BBB 評分為0 分時,則模型構(gòu)建成功。

    2.3后肢運動功能恢復(fù)的行為學(xué)評估 在術(shù)后1、3、7、14、28 天,將大鼠放入開口箱子,輕敲箱壁,使其爬行,觀察動物運動距離,臀、膝、踝關(guān)節(jié)行走、軀干運動及其協(xié)調(diào)情況,每只大鼠觀察15min,對各組大鼠的運動能力進行BBB 評分測試,評估采取雙盲法,由熟悉BBB 評分量表的實驗人員進行。

    2.4蘇木精-伊紅(HE)染色檢測脊髓損傷程度 各組動物均于干預(yù)8 周后處死,經(jīng)40g/L 多聚甲醛心臟灌注固定取脊髓組織樣本(T9-T10節(jié)段),PBS 清洗后置于40g/L 多聚甲醛中固定,再行脫水、包埋、切片等步驟,行HE 染色,鏡下觀察各組脊髓瘢痕和空洞面積,評價脊髓損傷程度。

    2.5免疫組化檢測Bax、Bcl-2 變化 每只大鼠取3張切片,按SP 試劑盒說明書測定Bcl-2、Bcl-2 相關(guān)性死亡蛋白(Bad)、Bax 的表達,常規(guī)脫蠟至水,3%過氧化氫處理、高溫修復(fù)、血清封閉、滴加一抗過夜(濃度為1∶150),并同時用PBS 代替一抗作為陰性對照,4℃孵育過夜、隔日滴加二抗孵育20min、SABC 37℃孵育20min,繼而DAB 顯色,鏡下觀察顯色背景。以上各步驟間均用0.01mol/L PBS 漂洗3 次,每次5min,梯度乙醇逐級脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,光鏡下觀察脊髓組織變化。

    2.6RT-PCR 檢測Caspase-3 mRNA 表達 采用RNA 自旋試劑盒說明書方法抽提總RNA。反轉(zhuǎn)錄體系含4μL DNAse 處理過的RNA、Buffer 5μL、1μL dNTPs(10μM)、1μL Oligo (dT)、0.5μL 隨機引物(100μM)、1μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/μL)、8.5μL DEPC H2O,共20μL。然后按以下條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。30℃ 10min,42℃ 60min,99℃ 5min,4℃ 5min。取出后在0.2mL PCR 管內(nèi),依次加入1μL 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(RT 產(chǎn)物),各基因上游與下游引物各0.25μL,12.5μL PCR 反應(yīng)mix(Taq 酶,Taq buffer,dNTPs),用ddH2O 補足體積至25μL。按以下條件進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),94℃預(yù)變性2min,94℃變性30s,56℃/55℃/48℃退火30s,72℃延伸30s,72℃延伸10min,擴增35 個循環(huán)。用one-Dscan 圖像分析軟件分析目標條帶的灰度值。

    從GenBank 獲得目的基因mRNA 的全長序列,利用引物和探針設(shè)計軟件Primer 5.0 設(shè)計引物序列。經(jīng)過Blast 分析,引物序列具有特異性。所用的引物及內(nèi)參照β-actin 引物見表1。引物均委托南昌中洪博元生物有限公司合成。

    2.7統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16.0 進行統(tǒng)計分析,計量資料以均數(shù)±標準差(±s) 表示,多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用t 檢驗,P<0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.13D 打印支架聯(lián)合iPSCs-NSCs 促進脊髓損傷大鼠運動功能恢復(fù) 手術(shù)前所有大鼠BBB 評分均為21 分。假手術(shù)組因未損傷脊髓,術(shù)后BBB 評分均為21 分。術(shù)后1、3 天,模型組和iPSCs-NSCs 組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后7、14、28 天,模型組和iPSCs-NSCs 組大鼠雙下肢運動功能均得到一定程度的恢復(fù)(P<0.05),iPSCs-NSCs 組較模型組恢復(fù)更好(P<0.05),見表2。

    表2 各組大鼠BBB 評分比較(分,±s)

    表2 各組大鼠BBB 評分比較(分,±s)

    注:假手術(shù)組不做處理;模型組植入DMEM 培養(yǎng)液0.2mL;iPSCs-NSCs 組植入載iPSCs-NSCs 的2~3mm 支架預(yù)處理;iPSCs 為誘導(dǎo)性多能干細胞;NSCs 為神經(jīng)干細胞;BBB 評分為Basso,Beattie and Bresnahan 行為評分法;與同組術(shù)后1 天比較,aP<0.05;與同組術(shù)后3 天比較,bP<0.05;與模型組同期比較,cP<0.05

    3.23D 打印支架聯(lián)合iPSCs-NSCs 促進脊髓損傷大鼠脊髓神經(jīng)元修復(fù) 干預(yù)28 天后,HE 染色顯示假手術(shù)組脊神經(jīng)生長良好;模型組脊神經(jīng)受到損傷,組織水腫,細胞稀疏,細胞之間的間隙增大;iPSCs-NSCs 組細胞生長較模型組緊密,各組織生長間隙縮小,空泡減小,組織水腫消失。見圖1。

    圖1 各組大鼠脊髓組織HE 染色結(jié)果(HE 染色×100)

    3.33D 打印支架聯(lián)合iPSCs-NSCs 抑制脊髓損傷大鼠凋亡相關(guān)蛋白表達 免疫組化染色切片上,免疫陽性染色呈棕褐色。免疫組化結(jié)果顯示,在脊髓損傷后28 天,iPSCs-NSCs 組Bcl-2 陽性細胞的表達較模型組多(P<0.05);iPSCs-NSCs 組Bax 陽性細胞的表達較模型組少(P<0.05)。見圖2、表3。

    表3 各組大鼠脊髓組織Bcl-2、Bax 陽性表達比較(個/mm2,±s)

    表3 各組大鼠脊髓組織Bcl-2、Bax 陽性表達比較(個/mm2,±s)

    注:假手術(shù)組不做處理;模型組植入DMEM 培養(yǎng)液0.2mL;iPSCs-NSCs 組植入載iPSCs-NSCs 的2~3mm 支架預(yù)處理;iPSCs 為誘導(dǎo)性多能干細胞;NSCs 為神經(jīng)干細胞;Bcl-2 為B 淋巴細胞瘤-2;Bax 為Bcl 相關(guān)X 蛋白質(zhì);與假手術(shù)組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05

    圖2 各組大鼠脊髓神經(jīng)組織Bcl-2 和Bax 陽性表達情況(免疫組化×100)

    RT-PCR 結(jié)果顯示,脊髓損傷術(shù)后28 天,iPSCs-NSCs 組Caspsase-3 mRNA 表達量較模型組少(P<0.05),較假手術(shù)組無明顯改變(P>0.05)。見圖3、表4。

    表4 各組大鼠脊髓組織Caspase-3 mRNA 表達量比較(±s)

    表4 各組大鼠脊髓組織Caspase-3 mRNA 表達量比較(±s)

    注:假手術(shù)組不做處理;模型組植入DMEM 培養(yǎng)液0.2mL;iPSCs-NSCs 組植入載iPSCs-NSCs 的2~3mm 支架預(yù)處理;iPSCs 為誘導(dǎo)性多能干細胞;NSCs 為神經(jīng)干細胞;Caspase-3 為半胱氨酸蛋白酶-3;與假手術(shù)組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05

    圖3 各組大鼠受損節(jié)段脊髓組織Caspase-3 mRNA 表達情況

    4 討論

    隨著組織工程學(xué)的發(fā)展,種子細胞+生物支架療法因其類似于體內(nèi)正常組織中細胞-細胞外基質(zhì)間的動態(tài)相互作用,被越來越多地用于脊髓損傷修復(fù)研究[9-10]。張仁坤等[3]研究證實,3D 打印支架載NeuroDl 修飾的NSCs 能夠促進脊髓損傷大鼠神經(jīng)環(huán)路的重建,對運動和感覺功能恢復(fù)有促進作用。曹宗銳等[4]利用膠原-硫酸肝素支架聯(lián)合神經(jīng)干細胞,促進大鼠脊髓損傷處神經(jīng)纖維的再生,改善大鼠雙側(cè)后肢運動功能。本研究通過3D 打印支架聯(lián)合iPSCs-NSCs 治療脊髓損傷大鼠,發(fā)現(xiàn)28 天后,iPSCs-NSCs組BBB 評分高于模型組(P<0.05),且28 天后脊髓組織病理切片顯示iPSCs-NSCs 組細胞生長較模型組緊密,各組織生長間隙縮小,空泡減小,組織水腫消失,說明該方法能促進脊髓損傷后大鼠感覺和運動功能的恢復(fù),但是其機制還需要進一步探討。

    脊髓功能喪失主要是由繼發(fā)改變引起的,在損傷急性期通過減輕或消除繼發(fā)性病理變化、保護殘存的軸突和神經(jīng)元不再遭受二次損傷,是目前關(guān)于脊髓損傷治療研究的重點[11]。脊髓損傷主要是由于損傷后水腫的發(fā)生,激活一系列分子和細胞機制,引發(fā)炎癥反應(yīng)等,最終導(dǎo)致細胞的凋亡和壞死。運動神經(jīng)元細胞凋亡影響運動功能的恢復(fù)。有研究表明,Bcl-2、Bax 蛋白和Caspase-3 在脊髓損傷后神經(jīng)細胞的凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[12]。Bcl-2 是凋亡抑制因子,能夠抑制或有效阻止脊髓損傷后各種途徑引起的細胞凋亡,促進受損神經(jīng)組織的修復(fù)。Bax 是凋亡促進因子,脊髓損傷后可刺激Bax 蛋白使線粒體膜的通透性發(fā)生變化,誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡。Caspase-3 是凋亡執(zhí)行因子,其表達水平可一定程度上反映細胞凋亡的情況。本研究結(jié)果表明,iPSCs-NSCs 組Bcl-2 陽性細胞表達明顯增加,Bax 陽性細胞和Caspase-3 mRNA 表達明顯減少,與模型組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明3D 打印支架聯(lián)合iPSCs-NSCs干預(yù)可使脊髓損傷大鼠Bcl-2 表達上調(diào),Bax 和Caspase-3 表達下調(diào),因而有效抑制神經(jīng)細胞凋亡。

    脊髓損傷后局部膠質(zhì)瘢痕形成,上下行神經(jīng)傳導(dǎo)束中斷,微環(huán)境受損及神經(jīng)元細胞凋亡、壞死造成脊髓不可逆性恢復(fù),本研究中采用3D 打印支架替換受損脊髓,不僅為中斷的神經(jīng)環(huán)路提供了“橋梁”,而且3D 打印支架是中空多孔的結(jié)構(gòu),為上下行傳導(dǎo)束重建和軸突生長提供通道并除去物理隔離,對改善其物理微環(huán)境有著積極的作用。NSCs 是一種多能干細胞,有永久的增殖能力及分化多向性,可改善受損神經(jīng)元細胞,是理想的種子細胞。NSCs 移植能夠抑制神經(jīng)細胞凋亡,改善受損神經(jīng)元神經(jīng)功能缺失[13-14]。本文采用人尿液細胞提取、分化成NSCs,不僅無創(chuàng),費用低,且有效避免了倫理學(xué)的限制。

    綜上所述,3D 打印支架聯(lián)合iPSCs-NSCs 可明顯恢復(fù)脊髓損傷大鼠運動功能,其原因可能為3D 打印支架為中斷的神經(jīng)環(huán)路提供了“橋梁”,NSCs 改善了受損脊髓微環(huán)境,其具體機制可能與上調(diào)Bcl-2表達及下調(diào)Bax、Caspase-3 表達,從而降低脊髓神經(jīng)元細胞凋亡相關(guān)。

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