昆布多糖對(duì)新生小鼠病毒性心肌炎的影響

王英娟，李迎俠，蘇樂(lè)

1.榆林市第一醫(yī)院，陜西 榆林719000；2.西安市中心醫(yī)院，陜西 西安710000

柯薩奇病毒B3（coxsackievirus group B type3，CVB3）感染是誘發(fā)人病毒性心肌炎的最主要因素，直接造成心肌細(xì)胞損害，引起心肌細(xì)胞的變性和壞死［1－3］。病毒性心肌炎患者通過(guò)治療均可自愈，但部分患者存在再次感染、病情反復(fù)的情況，嚴(yán)重者可能會(huì)引起心源性休克和心力衰竭，迅速惡化導(dǎo)致猝死［4］。昆布屬翅藻科，性寒，具有利水消腫、消痰、軟堅(jiān)散結(jié)的作用［5］。昆布多糖（laminarin，LA）是從昆布中提取分離的多糖，具有抑菌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗腫瘤等作用，對(duì)新生小鼠心肌損傷具有一定的保護(hù)作用［6－7］，但對(duì)CVB3誘導(dǎo)心肌炎的作用尚不清楚。因此，本文主要探討LA通過(guò)抑制NF－κB的活化對(duì)CVB3誘導(dǎo)的新生小鼠病毒性心肌炎病理?yè)p傷和免疫失衡的調(diào)節(jié)作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物BALB／c雄性新生小鼠100只，日齡3～5 d，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2017－0022，飼養(yǎng)于榆林市第一醫(yī)院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室，保持室溫恒定為25℃，模擬晝夜光照，自由攝食與飲水，經(jīng)本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑LA（北京凱森萊科技有限公司，貨號(hào)：9008－22－4）；CVB3（上海中山醫(yī)院病毒性心臟病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）。肌紅蛋白（myohemoglobin，Mb）、肌酸激酶同工酶－MB（creatine kinase－MB，CK－MB）和心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTn I）試劑盒（上海研生生化試劑有限公司，批號(hào)分別為：190221、190316、190301）；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和白細(xì)胞介素－10（interleukin－10，IL－10）ELISA試劑盒（美國(guó)R＆D公司，批號(hào)分別為：180816，180915）；TUNEL染色試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，批號(hào)：181213）；Bax、Bcl－2、NF－κB p65、p－p65、TNF－α、GAPDH（美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)分別為：sc－7480、sc－7382、sc－372、sc－8008、sc－52746、sc－32233）；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG（美國(guó)Thermo公司，批號(hào)分別為：A16072、A16104）；HE染色試劑盒、IL－6免疫組化試劑盒、細(xì)胞裂解液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為：190308、190309、190224、190521）；瓊脂糖（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：75510－019）；Real time PCR Master Mix（SYBR Green）（瑞士Roche公司，批號(hào)：04913850001）；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT－PCR試劑盒（百奧邁科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為：190224、190301、190206）。

1.3 儀器HX－II型小動(dòng)物血壓測(cè)量計(jì)（中國(guó)北京明心痛生物科技有限公司）；XD－202型倒置顯微鏡（中國(guó)南京江南永新光學(xué)有限公司）；DNM－9606型酶標(biāo)分析儀（中國(guó)北京朗普新技術(shù)有限公司）；BioLab－410型生物信號(hào)采集和處理系統(tǒng)（德國(guó)Eppendorf公司）；Gel Doc XR型圖像采集及圖像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio－Rad公司）；Lightcycle 96 realtime－PCR檢測(cè)儀（瑞士羅氏公司）；TaKaRa Thermal Cycler PCR儀（TaKaRa公司）；Nano－100微量檢測(cè)儀（杭州奧盛公司），Ion S5TMXL測(cè)序系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；垂直凝膠電泳槽、DYY－6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及模型復(fù)制采用隨機(jī)數(shù)字表法將100只新生的BALB／c新生小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（n＝20）、LA組（n＝20）、CVB3組（n＝30）和CVB3＋LA組（n＝30）。CVB3組和CVB3＋LA組腹腔注射0.1 mL CVB3病毒制備新生小鼠病毒性心肌炎模型［8］，對(duì)照組和LA組腹腔注射0.1 mL CVB3病毒培養(yǎng)液，CVB3組和CVB3＋LA組各隨機(jī)選取3只小鼠，取心臟進(jìn)行HE染色，若HE染色顯示心肌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變，則為造模成功。造模后，LA組和CVB3＋LA組腹腔注射50 mg·kg－1的LA；對(duì)照組和CVB3組腹腔注射同體積的生理鹽水，連續(xù)注射12 d。

2.2 檢測(cè)新生小鼠心臟功能指標(biāo)應(yīng)用小動(dòng)物血壓測(cè)量計(jì)和生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)測(cè)定各組新生小鼠尾部動(dòng)脈收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、心率（heart rate，HR）和左心室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）。檢測(cè)后收集新生小鼠血液并分離血清，然后將新生小鼠處死，取心臟用于免疫組化分析及組織蛋白提取。

2.3 ELISA法檢測(cè)血清相關(guān)指標(biāo)采用ELISA檢測(cè)新生小鼠血清中IL－10和iNOS水平及心臟損傷標(biāo)志物Mb、CK－MB、cTn I水平。

2.4 新生小鼠心臟的病理變化每組隨機(jī)取3只新生小鼠，取心臟固定于40 ng·L－1多聚甲醛中，進(jìn)行常規(guī)的脫水、透明、包埋和切片，制作兩份切片，一份切片進(jìn)行HE染色，于光鏡下觀察肺組織的病理變化；另一份切片采用TUNEL法染色，嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)每個(gè)視野下細(xì)胞總數(shù)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

2.5 免疫組化對(duì)上述心臟切片進(jìn)行免疫組化分析，二甲苯溶液浸泡2次后，梯度乙醇洗脫，加2滴3%H2O2－甲醇溶液，孵育10 min，加入血清封閉20 min，用一抗、二抗依次室溫孵育30 min，DAB顯色、復(fù)染、脫水封片。顯微鏡隨機(jī)選取新生小鼠心肌組織6個(gè)不重復(fù)視野進(jìn)行觀察。

2.6 Western Blot法檢測(cè)心肌組織相關(guān)蛋白表達(dá)

每組隨機(jī)取3只新生小鼠，取心肌組織，提取總蛋白后，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度并進(jìn)行定量，依次進(jìn)行12%SDS－PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗（Bax、Bcl－2、NF－κB p65、p－p65、TNF－α、GAPDH，稀釋比例均為1∶1 000）孵育過(guò)夜、二抗（1∶500）孵育2 h、曝光、顯影。Image J軟件分析蛋白條帶，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)。

2.7 RT－PCR法檢測(cè)心肌組織相關(guān)基因表達(dá)

每組隨機(jī)取3只新生小鼠，取心臟，Trizol法提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行RT－PCR反應(yīng)，CVB3上游引物5′－CGGTACCTTTGTGCGCCTGT－3′，下游引物5′－CAGGCCGCCAACGCAGCC－3′，IFN－γ上游引物5′－CTCAAGTGGCATAGATGTGGAAG－3′，下游引物5′－GCTGGACCTGTGGGTTGTTGA－3′，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，PCR反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)條件：94℃3 min，94℃30 s，60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)，用2－ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。服從正態(tài)分布的連續(xù)型資料，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，當(dāng)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，進(jìn)一步采用SNK方法進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 檢測(cè)新生小鼠心臟功能指標(biāo)與對(duì)照組相比，模型組新生小鼠的SBP、HR和LVSP顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，CVB3＋LA組SBP、HR和LVSP顯著升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

圖1 新生小鼠心臟功能指標(biāo)

3.2 檢測(cè)心臟損傷標(biāo)志物與對(duì)照組相比，模型組Mb、CK－MB和cTn l水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，CVB3＋LA組Mb、CK－MB和cTn l水平顯著下降（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

圖2 新生小鼠心臟損傷標(biāo)志物

3.3 新生小鼠心肌組織的病理學(xué)變化和心肌細(xì)胞的凋亡HE染色顯示，對(duì)照組和LA組新生小鼠的心肌組織排列緊密有序，橫紋清晰；CVB3組心肌組織細(xì)胞排列疏散，橫紋不清，細(xì)胞水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；CVB3＋LA組心肌組織細(xì)胞排列緊密有序，橫紋清晰，少量細(xì)胞水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。TUNEL染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CVB3組心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與CVB3組相比，CVB3＋LA組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）。Western Blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CVB3組Bax的表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl－2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Bax／Bcl－2水平顯著升高（P＜0.01）；與CVB3組相比，CVB3＋LA組Bax蛋白表顯著下調(diào)（P＜0.01），Bcl－2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01），Bax／Bcl－2水平顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3 新生小鼠心肌組織病理學(xué)損傷及相關(guān)蛋白的表達(dá)（HE，×200；TUNEL，×400）

3.4 RT－PCR法檢測(cè)新生小鼠心肌組織中相關(guān)基因的表達(dá)與對(duì)照組相比，CVB3組心肌組織中CVB3 mRNA和IFN－γmRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與CVB3組相比，CVB3＋LA組心肌組織CVB3 mRNA水平顯著降低（P＜0.01），IFN－γ mRNA水平顯著升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖4。

3.5 檢測(cè)新生小鼠血清和心肌組織中的炎癥因子

免疫組化結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CVB3組心肌組織中IL－6表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與CVB3組相比，CVB3＋LA組心肌組織中IL－6表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CVB3組iNOS水平顯著升高（P＜0.01）；與CVB3組相比，CVB3＋LA組血清中iNOS水平顯著降低（P＜0.01），IL－10水平顯著升高（P＜0.01）。見(jiàn)圖5。

圖4 新生小鼠心肌組織CVB3 mRNA和IFN－γmRNA水平

圖5 檢測(cè)新生小鼠血清和心肌組織中的炎癥因子

3.6 Western Blot法檢測(cè)心肌組織中的相關(guān)蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比，CVB3組p－p65和TNF－α的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；與CVB3組相比，CVB3＋LA組p－p65和TNF－α的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）。見(jiàn)圖6。

圖6 Western Blot法檢測(cè)心臟中的相關(guān)蛋白表達(dá)

4 討論

CVB3感染會(huì)直接造成心肌細(xì)胞損害，已成為兒童時(shí)期常見(jiàn)的心血管疾?。?－11］。目前臨床對(duì)病毒性心肌炎主要選擇免疫治療和抗病毒治療，但療效并不理想［12－14］。昆布是海帶科植物海帶或翅藻科植物昆布（鵝掌菜）的干燥葉狀體，味苦、性寒，歸肝、胃、腎經(jīng)，LA是從昆布中獲得的大分子多糖。研究表明，LA具有降壓、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等作用［15－16］。因此，本文通過(guò)CVB3誘導(dǎo)新生小鼠病毒性心肌炎模型，研究LA對(duì)病毒性心肌炎小鼠病理?yè)p傷和免疫失衡的調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，LA對(duì)健康新生小鼠的心肌組織無(wú)影響，CVB3誘導(dǎo)病毒性心肌炎模型新生小鼠的SBP、HR和LVSP指數(shù)顯著降低，CVB3 mRNA和IFN－γmRNA水平明顯升高；經(jīng)LA治療后，CVB3 mRNA顯著降低，SBP、HR、LVSP和IFN－γmRNA顯著增加，提示LA可能通過(guò)促進(jìn)IFN－γ的表達(dá)，降低機(jī)體的CVB3 mRNA水平，改善修復(fù)病毒性心肌炎小鼠的心臟功能損傷，臨床有望應(yīng)用昆布提高機(jī)體免疫，發(fā)揮抗病毒作用。同時(shí)，CVB3誘導(dǎo)病毒性心肌炎新生小鼠可發(fā)生細(xì)胞凋亡，經(jīng)LA治療后，新生小鼠心肌組織病理變化明顯減輕，且LA能上調(diào)Bcl－2蛋白表達(dá)，抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，顯著降低Bax／Bcl－2水平，與Tian等［17］研究是一致的，LA可抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡，提示LA可能調(diào)節(jié)凋亡蛋白Bcl－2和Bax的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌組織損傷。

炎癥反應(yīng)是心肌炎的主要病癥之一，炎癥因子在該疾病中起重要作用［18－20］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LA治療后，iNOS和IL－6表達(dá)顯著降低，IL－10的表達(dá)顯著增加。iNOS、IL－6和IL－10均為機(jī)體常見(jiàn)的可反映全身炎癥反應(yīng)狀態(tài)的細(xì)胞因子，其水平升高可進(jìn)一步加重心肌組織損傷［21－23］，提示LA可降低機(jī)體炎癥因子水平，減輕心肌組織損傷。同時(shí)，LA能抑制病毒性心肌炎模型小鼠心肌組織中p65蛋白磷酸化，下調(diào)TNF－α蛋白表達(dá)，抑制炎癥因子釋放。NF－κB信號(hào)通路廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，參與多種基因的調(diào)控，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)有重要作用［24－27］。在NF－κB信號(hào)傳遞中，活化的p65蛋白起著主要的調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)下游靶蛋白TNF－α的表達(dá)，調(diào)節(jié)從而抑制炎癥反應(yīng)［28－30］，提示LA可能通過(guò)抑制NF－κB信號(hào)通路，抑制炎癥因子的釋放。

綜上所述，LA可能通過(guò)抑制NF－κB p65蛋白磷酸化，下調(diào)TNF－α蛋白表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡和炎癥因子釋放，修復(fù)CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎新生小鼠的心臟功能，臨床有望應(yīng)用昆布治療病毒性心肌炎，保護(hù)心肌組織損傷。