南蛇藤提取物對ERK／MAPK通路介導(dǎo)的人胃癌MKN45細胞侵襲轉(zhuǎn)移的研究*

馬霜，向亮亮，文佩宇，劉延慶

揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州225009

胃癌（gastric cancer，GC）是世界上最致命的惡性腫瘤之一，在眾癌癥中發(fā)病率排第五，病死率排第三。除非在早期發(fā)現(xiàn)，否則很難通過手術(shù)、化療和放療等方法治愈［1］。患者局部復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移，或在腫瘤播散時確診為胃癌，生存期很少超過12個月，5年生存期小于10%［2］。腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是影響胃癌治療的最主要原因之一［3］。因此，抑制胃癌的轉(zhuǎn)移過程是胃癌治療的重要環(huán)節(jié)。目前，普遍認為基質(zhì)金屬蛋白酶［4］（matrix metalloproteinases，MMPs）及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［5］（epithelial－mesenchymal transitions，EMT）等是包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力的重要調(diào)節(jié)因素，已成為抗腫瘤藥物研究的重要方向。南蛇藤為衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物，具有清熱解毒的功效。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，南蛇藤乙酸乙酯提取物（celastrus orbiculatus extracts，COE）有顯著的抗腫瘤活性，可抑制多種惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成［6－7］及促進凋亡［8］。但COE抑制胃癌MKN45細胞侵襲轉(zhuǎn)移的研究及內(nèi)在可能分子機制還未清楚，在國內(nèi)外未見報道。本研究擬探討COE對人胃癌細胞MKN45侵襲和遷移的影響及其可能的作用機制。

1 材料

1.1 細胞人胃癌MKN45細胞株（中科院上海細胞庫）。

1.2 藥物與試劑南蛇藤（廣州致信藥業(yè)有限公司，批號：070510）；5－氟尿嘧啶注射液（5－fluorouracil，5－fu）（上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號：170724）。RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco公司，批號：12633012）；胎牛血清（Gibco公司，批號：10099－141）；胰酶細胞消化液（碧云天公司，批號：C0201）；MTT粉劑（美國Sigma公司，批號：M2128）；Matrigel膠（北京索萊寶科技有限公司，批號：M8370）；MMP－2、MMP－9、EMT、Ras、Raf、MEK、ERK、β－actin（美國CST公司，貨號分別為：4022S、3852S、9782S、3339S、9422S、4694S、4695S、4970S）；增強型化學(xué)發(fā)光試劑盒（英國Amersham Life Science公司，貨號：RPN2232）。

1.3 儀器Heracell 150i型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；MSC1.2型生物安全柜（美國Thermo公司）；EnSpire型多功能酶標儀（美國PerkinElmer公司）；電泳槽、凝膠成像分析儀（美國Bio－Rad公司）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 藥物的制備南蛇藤由秦民堅教授（中國藥科大學(xué)中藥資源研究室）鑒定，后由王強教授課題組（中國藥科大學(xué)）完成對南蛇藤的提取、純化和鑒定［9－10］。將南蛇藤莖充分粉碎后，經(jīng)95%乙醇加熱回流提取3次，回收溶劑得到浸膏后用硅藻土拌勻，再進行真空低溫抽干，用乙酸乙酯熱水浴回流加熱、過濾，即得到南蛇藤乙酸乙酯提取物（COE），其中，萜類化合物含量約為68%［11］。該制備法已取國家發(fā)明專利（專利號：ZL200710025343.3）。

2.2 MTT比色法檢測細胞增殖取對數(shù)生長期的MKN45細胞用胰酶消化，收集單細胞懸液，計數(shù)后調(diào)整濃度為每孔約5×104個，接種于96孔板。待細胞貼壁生長后換入無血清培養(yǎng)基配制的COE（20 mg·L－1、40 mg·L－1、80 mg·L－1、160 mg·L－1、320 mg·L－1）200μL，繼續(xù)孵育24 h、48 h、72 h后，分別加入0.5%MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔中加150μL DMSO溶劑，置酶標儀內(nèi)低速振蕩10 min，充分溶解后在490 nm處檢測各孔吸光度值。每組設(shè)5個復(fù)孔，重復(fù)3次。

2.3 劃痕實驗細胞制備同上，均勻接種于6孔板中。待細胞貼壁并生長良好后，用槍頭在每孔中輕輕刮出2 mm左右刮痕，無菌PBS沖洗劃痕中部漂浮細胞，置倒置顯微鏡下確認刮痕內(nèi)無細胞后拍照。設(shè)立 對 照組、COE（20 mg·L－1、40 mg·L－1、80 mg·L－1）組、5－fu組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，于倒置顯微鏡下觀察拍照，記錄各孔中劃痕距離。每組設(shè)3個復(fù)孔。

2.4 細胞侵襲實驗Matrigel膠用培養(yǎng)基按1∶6稀釋后，均勻鋪在Transwell小室的上室底部孵育待用。設(shè)對照組、COE組（20 mg·L－1、40 mg·L－1、80 mg·L－1）、5－fu組，培養(yǎng)24 h后，將各組細胞消化，用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基制成濃度為每1 mL含5×105個細胞。在Transwell的上室加入200μL各組單細胞懸液，下室加入500μL含20%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室用無菌PBS清洗3次，用棉簽拭去上室膜表面的細胞后，甲醇固定20 min，0.1%結(jié)晶紫常溫下染色20 min，再洗脫結(jié)晶紫。每組設(shè)置3個復(fù)孔。倒置顯微鏡下計數(shù)中間和四周5個視野侵襲的細胞數(shù)目，取平均值。

2.5 細胞遷移實驗除了Transwell小室上室底面不用Matrigel膠稀釋包被外，其余步驟均同2.4。

2.6 Western Blot法檢測蛋白的表達取對數(shù)期細胞，分組同上，經(jīng)不同藥物處理24 h后，提取總蛋白，并進行濃度定量分析，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育，一抗?jié)舛仍O(shè)為1∶1 000，二抗?jié)舛葹?∶2 000，ECL發(fā)光，采集并分析圖像。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 CEO對MKN45細胞增殖的影響采用MTT法探討不同濃度的COE（10 mg·L－1、20 mg·L－1、40 mg·L－1、80 mg·L－1、160 mg·L－1、320 mg·L－1）作用后對MKN45細胞增殖能力的影響。藥物作用24 h、48 h、72 h后，細胞生長呈現(xiàn)出不同程度的增殖抑制，且呈濃度及時間依賴性。在藥物作用24 h條件下，計算CEO對MKN45細胞作用的半數(shù)抑制濃度（IC50）為129.5 mg·L－1。為排除COE對細胞的毒性作用影響，后續(xù)實驗中COE質(zhì)量濃度設(shè)置為20 mg·L－1、40 mg·L－1、80 mg·L－1遠低于IC50的濃度，時間設(shè)置為24 h。見表1。

表1 CEO對MKN45細胞增殖的影響 （±s，n＝5）

表1 CEO對MKN45細胞增殖的影響 （±s，n＝5）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

組別濃度（ρ／mg·L－1）細胞增值率／%24 h 48 h 72 h對照組100 100 100 COE組 10 94.56±5.68 81.99±5.74 73.06±4.58 20 85.61±3.11* 73.41±3.87* 52.59±2.49*40 74.90±1.92* 65.13±9.66** 39.05±5.41**80 56.22±4.33** 55.94±6.54** 23.64±4.65**160 29.71±7.55***18.79±5.66** 15.80±5.36**320 20.41±4.39***12.42±8.41*** 9.86±7.29－**

3.2 CEO對MKN45細胞遷移能力經(jīng)不同濃度COE處理24 h后，觀察細胞往劃痕中心遷移的距離。與對照組相比，濃度越高的COE處理24 h后，遷移的距離越小，提示遷移速率變慢，表明CEO可顯著抑制MKN45細胞的遷移。見圖1，表2。

表2 各組細胞遷移距離 （±s，n＝3）

表2 各組細胞遷移距離 （±s，n＝3）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 濃度（ρ／mg·L－1）遷移距離對照組－0.53±0.11**COE組 20 0.31±0.05**40 0.18±0.03*80 0.05±0.02 5－fu組32 0.04±0.01

3.3 CEO對MKN45細胞侵襲與遷移能力的影響

與對照組相比，經(jīng)COE干預(yù)后，侵襲細胞數(shù)量和遷移細胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05），且與藥物濃度呈相關(guān)性。即COE可顯著抑制MKN45細胞的侵襲和遷移。見表3，圖2。

表3 各組Transwell小室穿膜細胞數(shù)目 （±s，n＝5）

表3 各組Transwell小室穿膜細胞數(shù)目 （±s，n＝5）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

組別 濃度（ρ／mg·L－1）侵襲細胞數(shù)目 遷移細胞數(shù)目對照組－ 183.4±24.6 204.8±18.6 COE組 20 165.9±22.8 185.2±21.7 40 104.8±15.2** 114.8±24.3*80 49.6±11.8*** 51.7±12.9***5－fu組 32 59.6±9.1*** 66.9±9.7***

3.4 CEO對MKN45細胞中MMP2、MMP9及EMT相關(guān)蛋白表達的影響與對照組比較，隨著CEO濃度的增加，細胞中MMP－2、MMP－9、Ncadherin、Vimentin蛋白表達降低（P＜0.05），Ecadherin蛋白表達升高（P＜0.05）。即COE可下調(diào)胃癌MKN45細胞中MMP－2、MMP－9、N－cadherin、Vimention蛋白表達，上調(diào)E－cadherin蛋白表達。見圖3。

圖1 CEO對MKN45細胞遷移能力的影響（×200）

圖2 CEO對MKN45細胞侵襲與遷移的影響（×200）

3.5 CEO對MKN45細胞中ERK／MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達的影響與對照組比較，隨著CEO濃度的增加，細胞中Ras、Raf、MEK及ERK1／2蛋白表達降低（P＜0.05）。即COE可通過抑制ERK／MAPK信號通路來抑制胃癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。見圖4。

圖3 CEO對MKN45細胞MMP2、MMP9及EMT蛋白表達的影響

圖4 CEO對MKN45細胞中ERK／MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

4 討論

胃癌是一種高度異質(zhì)性的疾病，即使在臨床和病理特征相似的患者中，其結(jié)果也可能存在較大差異。腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響生存率的主要因素之一。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［12］、相關(guān)信號通路激活［13］等已被公認為腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，中藥在防治癌前病變、抑制胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移、改善化療不良反應(yīng)等方面有良好的作用［14－17］。

惡性腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的重要原因之一是腫瘤微環(huán)境中的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的降解和基底膜（basement membrane，BM）的破壞［18］。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在許多生物過程中具有重要作用，包括細胞增殖、遷移和分化、血管生成及ECM重塑等。在腫瘤微環(huán)境中，MMPs以酶原形式分泌，在各種蛋白酶作用下裂解為活性形式，激活后形成的明膠酶類MMPs可降解腫瘤細胞ECM的主要成分，使腫瘤細胞沿缺失的BM向周圍組織浸潤［19－20］。MMP2、MMP9是MMPs家族中兩個重要組成因子，已有研究表明，其與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［21］。EMT是上皮細胞上皮樣特征減少并獲得間充質(zhì)細胞特性的生理過程，是腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移所必要的初始步驟［22－23］。E－cadherin是上皮細胞的標志分子，Ncadherin和Vimentin是間質(zhì)細胞的標志分子，它們共同作用下，可減少細胞間黏附、增加細胞的轉(zhuǎn)移［24］。MMPs與EMT的關(guān)系密切，MMPs是間質(zhì)細胞的標志性蛋白之一，是EMT發(fā)生的標志，當細胞微環(huán)境中MMPs表達異常時可誘導(dǎo)EMT的發(fā)生［25－26］。ERK／MAPK信號通路在控制細胞的生長、發(fā)育、分裂和死亡等各種生理過程中起重要的作用，是調(diào)控細胞生長、發(fā)育和分裂的信號網(wǎng)絡(luò)核心［27］。有研究表明，ERK在人多種腫瘤細胞中高表達，如乳腺癌、胃癌、腸癌等，說明ERK／MAPK信號通路在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用［28－29］。

本研究通過劃痕實驗及細胞遷移實驗驗證了COE可顯著抑制胃癌細胞侵襲與轉(zhuǎn)移的作用。Western Blot結(jié)果顯示，CEO可下調(diào)MMP2和MMP9蛋白表達，從而降低人胃癌MKN45細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，同時也可上調(diào)E－cadherin、下調(diào)N－cadherin、Vimentin蛋白表達，進而抑制胃癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。提示COE可抑制ERK／MAPK信號通路來抑制人胃癌細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。

綜上，本研究表明COE可抑制胃癌MKN45細胞侵襲與轉(zhuǎn)移，其作用機制可能與直接下調(diào)MMP2和MMP9蛋白，激活ERK／MAPK信號通路有關(guān)。本實驗揭示了COE抗胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的可能作用機制，為抗胃癌轉(zhuǎn)移的新中藥開發(fā)提供了理論依據(jù)。但是，目前還沒有充分的研究，故需要進行體內(nèi)實驗進一步論證。