啤酒酵母-花生粕酶解制備鮮味肽的研究

胡美欣，楊志偉

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院廣西高校特色農(nóng)產(chǎn)品精深加工與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530004）

啤酒酵母中蛋白質(zhì)含量豐富，占整體干重的50%左右，具有較高的利用價(jià)值。由其制備的酵母抽提物在國外被譽(yù)為第三代味精。花生粕是以脫殼花生果為原料，經(jīng)提取油脂后的副產(chǎn)品?；ㄉ筛缓鞍踪|(zhì)[1]、維生素和礦物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，其蛋白含量高達(dá)40%～50%，氨基酸組成比較合理，且其氨基酸組成中鮮味氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）含量高達(dá)32%，是優(yōu)良的鮮味肽生產(chǎn)原料。花生粕因其含硫氨基酸蛋氨酸（methionine，Met）、半胱氨酸（cysteine，Cys）和賴氨酸（lysine，Lys）含量極低[2]，被認(rèn)為是花生中主要的限量氨基酸，但通過與其它蛋白原料如Lys含量可觀的啤酒酵母適當(dāng)搭配，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值[3-4]。利用農(nóng)產(chǎn)品加工的副產(chǎn)物花生粕和啤酒酵母結(jié)合[5-6]，不僅豐富了產(chǎn)品營養(yǎng)、充分利用了附加值低的農(nóng)副產(chǎn)品，也簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，為探索新鮮味呈味基料提供了重要的研究途徑。

本試驗(yàn)以啤酒酵母和花生粕混合組分為原料，通過超聲預(yù)處理后用商業(yè)蛋白酶進(jìn)行酶解，得到最優(yōu)酶解條件，以期為后續(xù)酶解制備鮮味產(chǎn)品的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒酵母：湖南仁恒生物科技有限公司；花生粕：市售。

氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、甲醛（均為分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；磺基水楊酸（優(yōu)級(jí)純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；堿性蛋白酶（20萬U/g）、胰蛋白酶（25萬 U/g）、復(fù)合蛋白酶（10萬 U/g）、風(fēng)味蛋白酶（3萬U/g）：北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、檸檬酸、亮氨酸、谷氨酸鈉、谷胱甘肽（均為食品級(jí)）：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

KDN-20C型消化爐、KD-2N型凱氏定氮儀：浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司；PHSJ-4F實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SHZ-88水浴恒溫振蕩器、HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋、HJ-3控溫磁力攪拌器：江蘇金怡儀器科技有限公司；JAC-300N型數(shù)控超聲波清洗機(jī)：山東省濟(jì)寧市奧波超聲電氣有限公司；L8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀：日本Hitachi公司；TLE204E分析天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Waters 1525高效液相色譜：美國沃特斯公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解工藝流程

將花生粕粉碎過60目篩，將啤酒酵母粉和花生粕按質(zhì)量比1∶1混合進(jìn)行試驗(yàn)。在風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶的最適溫度和pH值條件下，采用料液比 1∶12（g/mL），時(shí)間 8 h，加酶量 1%對(duì) 4種蛋白酶進(jìn)行篩選，用選出來的酶進(jìn)行下一步單因素試驗(yàn)。

單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：用去離子水將樣品分別按料液比 1∶6、1∶9、1∶12、1∶15、1∶18（g/mL） 對(duì)原料進(jìn)行溶解，加蒸餾水后進(jìn)行功率為300 W，時(shí)間為25 min的超聲預(yù)處理，結(jié)束后用NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值分別為 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 后加入蛋白酶，加酶量為0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%，酶解期間每2 h調(diào)節(jié)一次pH值。將樣品在振蕩水浴鍋溫度為45、50、55、60、65 ℃下將樣品反應(yīng) 4、8、12、16、20 h，反應(yīng)結(jié)束后于95℃下滅酶15 min，冷卻至室溫（25℃）后在8 000 r/min下離心15 min，取上清液待測(cè)。單因素以蛋白回收率、水解度和感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)進(jìn)行分析。

以上述單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，以溫度、時(shí)間和加酶量為三因素，蛋白回收率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1L9（34）Orthogonal experimental factors and horizontal design

1.3.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.2.1 蛋白回收率（protein recovery，PR）測(cè)定方法

取蛋白酶解上清液，參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量。具體計(jì)算公式如下。

蛋白質(zhì)回收率/%=酶解產(chǎn)物上清液中蛋白含量/原料蛋白含量×100

1.3.2.2 水解度（degree of hydrolysis，DH）測(cè)定

水解度采用甲醛電位滴定法測(cè)定[7]，水解度計(jì)算公式如下。

水解度（DH）/%=酶解產(chǎn)物上清液中氨態(tài)氮含量/原料總氮含量×100

1.3.2.3 感官評(píng)價(jià)

參照蘇國萬[8]的方法并稍做修改，感官評(píng)定小組由9人組成（4名男士，5名女士，年齡20歲～35歲之間），房間溫度為（25±2）℃，品評(píng)前已對(duì)品評(píng)人員進(jìn)行鮮、咸、苦、酸、厚重感5種味覺識(shí)別、排序的培訓(xùn)。品評(píng)結(jié)果采用評(píng)分法，分值分別為0～5分，分值0代表無，分?jǐn)?shù)5代表極強(qiáng)。標(biāo)準(zhǔn)品分別為味精（0.35%）、氯化鈉（0.35%）、亮氨酸（0.01%）、檸檬酸（0.08%）和谷胱甘肽（0.04%），最終結(jié)果取9人評(píng)定值的平均值。

1.3.2.4 肽分子量分布測(cè)定

稱取待測(cè)樣品100 mg左右置于10 mL容量瓶中[9]，用流動(dòng)相乙腈/水/三氟乙酸（40/60/0.1，體積比）稀釋定容，用濾膜過濾后待測(cè)，柱溫為30℃，流速為0.5 mL/min，在220 nm下測(cè)量樣品的肽分子量分布。分子量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品為：細(xì)胞色素C（分子量12 384 Da），抑肽酶（分子量 6 500 Da），桿菌酶（分子量1 422 Da），乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（分子量451 Da），乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（分子量 189 Da）。

1.3.2.5 游離氨基酸測(cè)定

準(zhǔn)確稱量凍干樣品，用磺基水楊酸定容至刻度，振蕩混合均勻后，4℃下靜置2 h，于10 000 r/min下離心15 min，取上清液過0.22 μm濾膜后于氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)數(shù)據(jù)均為3次試驗(yàn)的平均值，采用SPSS 25.0進(jìn)行方差分析，用origin 9.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響

酶種類對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響見圖1。

圖1 酶種類對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響Fig.1 Effects of enzyme types on enzymatic hydrolysis of brewer′s yeast and peanut meal

由1圖可知，在4種蛋白酶的處理組分中，堿性蛋白酶的蛋白回收率最高，達(dá)到（74.00±1.97）%，其次為胰蛋白酶，回收率為（69.81±0.78）%。4種蛋白酶的水解度相差不大，其中堿性蛋白酶的水解度最低，結(jié)果為11.06%。

用不同蛋白酶酶解原料是一種溫和且高效的提取蛋白風(fēng)味物質(zhì)的方法，內(nèi)切蛋白酶起到的作用是水解蛋白質(zhì)中疏水性氨基酸殘基，外切蛋白酶除去多肽首尾兩端的疏水性氨基酸，造成多肽所含的疏水氨基酸總量減少，并且降低疏水性氨基酸在多肽C-末端所占的比例，從而降低苦味[10]。

由圖1的感官評(píng)價(jià)圖可知，風(fēng)味蛋白酶處理組鮮味最為突出，其次是復(fù)合蛋白酶，最差的為堿性蛋白酶。風(fēng)味蛋白酶鮮味最佳可能因?yàn)槠浜瑑?nèi)切酶和端解酶，在酶解過程中內(nèi)切酶把大分子蛋白酶解成較大分子量的肽，端解酶則把大分子肽酶解成小分子肽或游離氨基酸。其中苦味最明顯的是堿性蛋白酶處理組，李學(xué)鵬等[11]研究發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶解物苦味最強(qiáng)，認(rèn)為堿性蛋白酶為內(nèi)切酶，水解后容易產(chǎn)生含亮氨酸、苯丙氨酸及纈氨酸等疏水性氨基酸。

綜合3個(gè)指標(biāo)，堿性蛋白酶雖然蛋白回收率最高，但苦味最重，對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味有著極大不良影響，胰蛋白酶蛋白回收率為第二，且鮮味突出，其中風(fēng)味蛋白酶感官評(píng)價(jià)中綜合風(fēng)味最佳，采用風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶解進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2 雙酶復(fù)配對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響

雙酶復(fù)配對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響見圖2。

圖2 雙酶復(fù)配對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響Fig.2 Effects of double enzyme on enzymatic hydrolysis of brewer′s yeast and peanut meal

單一蛋白酶的酶切位點(diǎn)有限，難以達(dá)到想要的結(jié)果，風(fēng)味蛋白酶雖風(fēng)味可觀但酶解效率差，胰蛋白酶解效率高，兩者結(jié)合作用以期達(dá)到協(xié)同增效的效果[12]。

由圖2可知，隨著胰蛋白比例的增加，蛋白回收率逐漸增加，但水解度變化不明顯。在風(fēng)味蛋白酶占比高時(shí)有著較高的水解度，可能是因?yàn)轱L(fēng)味蛋白酶占比高時(shí)對(duì)水解度起到積極作用，當(dāng)胰蛋白酶比例高時(shí)對(duì)蛋白回收率影響更大，當(dāng)風(fēng)味蛋白酶∶胰蛋白酶=1∶3（質(zhì)量比）時(shí)，蛋白回收率為（63.28±0.45）%，水解度為（13.65±0.78）%。

從感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖可得，鮮味最明顯的組為風(fēng)味蛋白酶∶胰蛋白酶=1∶3（質(zhì)量比）。所以綜合3個(gè)指標(biāo)，最后選擇風(fēng)味蛋白酶∶胰蛋白酶=1∶3（質(zhì)量比）進(jìn)行下一步試驗(yàn)

2.3 復(fù)合酶添加量對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響

復(fù)合酶添加量對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響見圖3。

圖3 復(fù)合酶添加量對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響Fig.3 Effect of enzyme amount on enzymatic hydrolysis of brewer′s yeast and peanut meal

由圖3可知，隨著反應(yīng)體系中加酶量的增加，蛋白回收率和水解度都呈上升趨勢(shì)，特別是加酶量從0.2%～0.6%時(shí)，兩指標(biāo)都有明顯的提升，說明當(dāng)加酶量為0.2%時(shí)，對(duì)于反應(yīng)體系來說酶量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。在加酶量為1.0%時(shí)回收率達(dá)到最大值（65.36±0.34）%，水解度為（13.94±0.50）%，這與王虹等研究加酶量對(duì)鮮味肽的酶解效果相似[13]。當(dāng)加酶量大于1.0%之后，酶量雖然在增加，但蛋白回收率和水解度趨于平穩(wěn)，因此可得，加酶量到達(dá)一定量后酶量的增加對(duì)蛋白回收率和水解度的促進(jìn)是有限的[14]。

從感官圖可得，苦味值最大的組為加酶量1.8%，酶量增加到一定程度會(huì)使得苦味增加。鮮味最強(qiáng)的組為0.6%和1.0%組，其次為1.8%組。綜合考慮到酶解效果和經(jīng)濟(jì)效益，以加復(fù)合酶量為1.0%進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.4 酶解pH值對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響

pH值對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響見圖4。

圖4 pH值對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響Fig.4 Effect of pH on enzymatic hydrolysis of brewer′s yeast and peanut meal

蛋白酶對(duì)pH值較為敏感，當(dāng)在其適合的pH值范圍下其酶活力最高，酶解原料更充分。由圖4可知，蛋白回收率隨著pH值的增加先增大后減少，當(dāng)pH值達(dá)到7.0后緩慢減少，pH值為7.0時(shí)蛋白回收率為（65.93±1.59）%，梁蓉等[15]研究復(fù)合酶對(duì)高溫花生粕的最適酶解pH值為7.0，與本結(jié)果一致。水解度在pH值為6.0～7.0之間變化不大，當(dāng)pH值大于7.0時(shí)水解度呈下降趨勢(shì)，pH值為7.0時(shí)水解度為（13.82±0.83）%。

由感官圖可知，苦味最明顯的組為pH 8.0，可能因?yàn)樵趬A性環(huán)境下酶解反應(yīng)物呈苦味。鮮味最明顯的組為pH6.5和pH 7.0，其次為pH 6.0組。綜上采用pH 7.0進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.5 時(shí)間對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響

時(shí)間對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響見圖5。

圖5 時(shí)間對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響Fig.5 Effects of time on enzymatic hydrolysis of brewer′s yeast and peanut meal

由圖5可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，蛋白回收率和水解度都呈上升趨勢(shì)，當(dāng)時(shí)間達(dá)到12 h后，蛋白回收率的上升趨勢(shì)較小，這與Chae等[16]研究結(jié)果一致。可能是因?yàn)槊附獾搅艘欢〞r(shí)間，酶活力開始減弱甚至失活，酶解效率減小。

由感官雷達(dá)圖可知，鮮味分值最高的組為8 h和12 h，4 h組分值最低，可能是因?yàn)槊附獠怀浞郑r味物質(zhì)釋放量不多，20 h組則是反應(yīng)時(shí)間過長，已產(chǎn)生明顯的酸臭味，其酸度值最高，酸味掩蓋了鮮味滋味。綜合3個(gè)指標(biāo)和時(shí)間經(jīng)濟(jì)效益考慮，采用酶解12 h進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.6 料液比對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響

料液比對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響見圖6。

圖6 料液比對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響Fig.6 Effects of the ratio of material to liquid on the enzymatic hydrolysis of brewer′s yeast and peanut meal

由圖 6 可知，當(dāng)料液比為 1∶6（g/mL）時(shí)，不管是蛋白回收率和水解度都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它組，這與趙龍[17]的研究結(jié)果相似，可能因?yàn)?∶6（g/mL）組的樣品溶液偏濃，黏度較大，原料與酶接觸不完全，導(dǎo)致回收率和水解度效果差。料液比從 1∶9（g/mL）到 1∶12（g/mL），蛋白回收率和水解度逐漸趨于平穩(wěn)，1∶12（g/mL）之后稍有減少，潘風(fēng)光等[5]研究表明當(dāng)反應(yīng)體系中底物比列減少，酶與原料的接觸機(jī)會(huì)少，導(dǎo)致蛋白提取率和水解度都呈緩慢減少。

由感官評(píng)價(jià)可知，鮮味值最高的組為料液比為1∶9（g/mL）和 1∶12（g/mL），其次是 1∶15（g/mL）。其中1∶6（g/mL）酸味值最高為3。因此采用料液比為1∶12（g/mL）進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.7 溫度對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響

溫度對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響見圖7。

由圖7可知，蛋白回收率隨著溫度的增高呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為55℃時(shí)達(dá)到最高值（66.31±2.61）%，王倩等[18]認(rèn)為溫度過低時(shí)酶未達(dá)到最大活力，當(dāng)溫度過高時(shí)會(huì)導(dǎo)致酶活力逐漸降低，當(dāng)達(dá)到一定高溫時(shí)甚至失活，所以溫度過高過低都不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行。水解度隨著溫度的升高呈下降趨勢(shì)可能是因?yàn)槊富盍ο陆?，不利于水解反?yīng)

圖7 溫度對(duì)啤酒酵母-花生粕酶解效果的影響Fig.7 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis of brewer′s yeast and peanut meal

由感官雷達(dá)圖得溫度為65℃時(shí)酸味明顯，其中鮮味最強(qiáng)的組為55℃，其次為50℃?？辔吨蹈鹘M相差不大。綜合上述分析，取55℃時(shí)為最適反應(yīng)溫度，蛋白回收率為（66.31±2.61）%，水解度為（19.77±0.55）%。

2.8 正交試驗(yàn)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以溫度、時(shí)間和加酶量為因素，取風(fēng)味蛋白酶∶胰蛋白酶=1∶3（質(zhì)量比），料液比為 1∶12（g/mL），pH 7.0進(jìn)行正交試驗(yàn)。因水解度過高則會(huì)產(chǎn)生一定苦味[10]，對(duì)感官產(chǎn)生一定影響，所以最終以蛋白回收率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果分析如表2。

由表2中R值可得各因素對(duì)蛋白回收率的影響程度為A>C>B，既溫度>加酶量>時(shí)間。蛋白回收率的最佳提取條件為A2B2C3，既溫度為55℃，時(shí)間為12 h，加酶量為1.2%，但該組不在試驗(yàn)范圍內(nèi)，則對(duì)A2B2C3進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果表明，其蛋白提取率為（67.78±1.06）%，水解度為（20.05±0.49）%。所以溫度55℃，時(shí)間12 h，加酶量1.2%為最優(yōu)條件。

表2 啤酒酵母-花生粕酶解L9（34）正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果Table 2L9（34）Orthogonal experiment poor analysis of enzymatic hydrolysis of brewer′s yeast and peanut meal

2.9 肽分子量分布

肽分子量分布見圖8。

圖8 肽分子量分布Fig.8 Molecular weight distribution of peptide

由圖8可知，肽分子量主要分布在<1 000 Da范圍內(nèi)，占比為79.64%，證明樣品酶解的比較充分，蛋白大分子被酶切成小分子肽或氨基酸。研究表明，當(dāng)分子量>5 000 Da時(shí)肽分子很難進(jìn)入味蕾孔口，刺激味蕾細(xì)胞，因此其對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)非常小[9]。分子量在200 Da～5 000 Da的肽均具有參加美拉德反應(yīng)的活性，其占比68.71%，含量可觀，有利于下一步美拉德反應(yīng)[19]。

2.10 氨基酸分析

游離氨基酸含量及味道特征見表3。

氨基酸的組成及含量對(duì)滋味有著重要影響。由表3可知，酶解后的游離氨基酸總量為169.98 mg/g，其中含量最高的是谷氨酸，其占比為15.45%，且谷氨酸是對(duì)鮮味滋味的主要貢獻(xiàn)者。在各大氨基酸分類中，鮮味氨基酸主要為谷氨酸和天冬氨酸，其占比18.54%。疏水性氨基酸占比為43.42%，主要有丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸和亮氨酸。親水性氨基酸占比為18.01%，必需氨基酸占比為38.24%，與張佳男[20]的研究結(jié)果相近。

表3 游離氨基酸含量及味道特征Table 3 Content of free amino acids and flavor characteristics

花生粕的主要限制氨基酸有Cys、Met和Lys，經(jīng)啤酒酵母-花生粕酶解后的3種限制氨基酸均比前人研究[8]的單獨(dú)酶解花生粕時(shí)的含量更高，這是因?yàn)榛ㄉ珊推【平湍附Y(jié)合起到了氨基酸互補(bǔ)作用，這為得到營養(yǎng)價(jià)值高的鮮味基料提供了新思路。

3 結(jié)論

研究采用不同蛋白酶酶解啤酒酵母和花生粕混合原料，確定用風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶雙酶復(fù)配酶解。在單因素確定了料液比、pH值等條件下，進(jìn)一步采用溫度、時(shí)間和加酶量做正交試驗(yàn)優(yōu)化，得到優(yōu)水平組合，此條件下的蛋白回收率為（67.78±1.06）%，水解度為（20.05±0.49）%，經(jīng)優(yōu)化后的樣品游離氨基酸中的必需氨基酸占比38.24%，較啤酒酵母和花生粕有著更高營養(yǎng)價(jià)值。肽分子量主要分布在1 000 Da以下，水解效果良好。所得樣品鮮味獨(dú)特，苦味值較低，為開發(fā)新的鮮味基料提供實(shí)踐參考。