OPN/CD44通路在缺氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用及其機(jī)制

吳樹全,王生蘭

(1青海省第五人民醫(yī)院急診科,西寧 810000;2青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一種彌漫性肺微血管重塑疾病,伴有肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)惡性增殖,導(dǎo)致持續(xù)的肺動(dòng)脈壓升高,右心室肥大和死亡[1,2]。血管重塑是PAH的關(guān)鍵病理特征,其中PASMCs異常增殖是肺動(dòng)脈血管重塑的主要機(jī)制,但目前針對(duì)肺血管重塑的療法在逆轉(zhuǎn)PAH方面效果仍不佳[3],因此,積極地探索調(diào)控PASMCs增殖的分子機(jī)制可能有助于改善PAH的臨床治療效果。骨橋蛋白(osteopontin,OPN)是一種多效性細(xì)胞因子,與細(xì)胞增殖密切相關(guān)[4]。另有研究證實(shí),OPN可能參與特發(fā)性和低氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制,其上調(diào)可能有助于PASMCs增殖,但其具體分子機(jī)制尚不清楚[5]。CD44是一種廣泛表達(dá)的選擇性剪接、翻譯后修飾的跨膜糖蛋白,在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、維持功能性血管屏障和血管生成中至關(guān)重要[6]。然而,OPN在低氧誘導(dǎo)下對(duì)人PASMCs(human PASMCs,HPASMCs)細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制是否與CD44相關(guān)未見報(bào)道。因此,本研究選擇體外培養(yǎng)HPASMCs細(xì)胞,模擬低氧環(huán)境,探討OPN/CD44通路對(duì)HPASMCs細(xì)胞增殖的影響,以期為臨床PAH治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1 主要材料 HPASMCs(3110)購自上海中喬新舟生物科技有限公司;SMCM培養(yǎng)基(1101)購自北京裕恒豐科技有限公司;OPN-siRNA及OPN-siRNA陰性對(duì)照(negative control-siRNA,NC-siRNA)序列由吉瑪基因公司構(gòu)建。DMEM培養(yǎng)基(11995)、PCR試劑盒(RP1100)、胰酶消化液(T1350)、Trizol試劑盒(R1100)、RIPA裂解液(R0020)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(T2210-200T)、ECL發(fā)光液(PE0010)購自北京Solarbio公司;OPN、CD44及β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)引物序列由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成;增殖細(xì)胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen,PCNA)(13-3900)、Cyclin D1(33-3500)、Cyclin E(MA5-14336)、p27(MA5-12835)、OPN(MA5-17180)、CD44小鼠抗人單克隆抗體(MA5-13887)、山羊抗小鼠IgG(H+L)二級(jí)抗體(A32723)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2 主要儀器 HF160W型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自上海Heal Force公司;cell+100型低氧細(xì)胞培養(yǎng)工作站購自廣州市華粵行儀器有限公司;T100型PCR儀、ELX-8081U型酶標(biāo)儀和Gel DocTMXR+型凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司;CytoFLEX型流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPASMCs細(xì)胞培養(yǎng) 采用SMCM完全培養(yǎng)基(89%SMCM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%生長(zhǎng)因子+100 U/ml雙抗),在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HPASMCs細(xì)胞,待細(xì)胞傳至3-4代消化收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 低氧處理HPASMCs細(xì)胞 將1.2.1培養(yǎng)的HPASMCs細(xì)胞,用DMEM培養(yǎng)基同化12 h,然后更換為SMCM培養(yǎng)基(平滑肌細(xì)胞專用培養(yǎng)基,其氨基酸、維生素和生長(zhǎng)因子等配比不同于DMEM),置于37 ℃、1% O2低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,建立低氧誘導(dǎo)模型。

1.2.3 細(xì)胞分組及OPN-siRNA沉默實(shí)驗(yàn) 收集1.2.1對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HPASMCs細(xì)胞,鋪于6孔板,隨機(jī)分為常氧組、低氧組、OPN-siRNA+低氧組和NC-siRNA+低氧組。常氧組按照1.2.1方法培養(yǎng)24 h,低氧組、OPN-siRNA+低氧組和NC-siRNA+低氧組根據(jù)1.2.2低氧培養(yǎng)方法,使用不含雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后,按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染步驟分別進(jìn)行不轉(zhuǎn)染、OPN-siRNA轉(zhuǎn)染和NC-siRNA轉(zhuǎn)染6 h,更換為SMCM培養(yǎng)基低氧培養(yǎng)24 h。收集以上各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OPN和CD44 mRNA表達(dá) 使用Trizol試劑盒提取1.2.3各組細(xì)胞RNA,并測(cè)定RNA濃度,取2 μl RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,完全按照PCR試劑盒說明書配置反應(yīng)體系,反應(yīng)程序設(shè)置如下:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算OPN mRNA及CD44 mRNA相對(duì)表達(dá)量,引物序列見表1。

表1 OPN mRNA、CD44 mRNA及β-actin引物序列

1.2.5 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組HPASMCs細(xì)胞活性 將1.2.1對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HPASMCs細(xì)胞,按照密度為4.5×104個(gè)/孔,接種于96孔板,參照1.2.3方法分組并處理后,棄去上清液,每孔加入10 μl CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)3 h,充分混勻后酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔吸光值(OD值),以上每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔,計(jì)算各組OD均值,計(jì)算細(xì)胞活性,細(xì)胞活性=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-調(diào)零孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-調(diào)零孔OD值)。

1.2.6 凋亡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組HPASMCs細(xì)胞凋亡率 根據(jù)凋亡試劑盒說明步驟,收集1.2.3各組HPASMCs細(xì)胞,依次加入10 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI,室溫孵育20 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組HPASMCs細(xì)胞周期變化 根據(jù)細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說明書步驟,收集1.2.3各組HPASMCs細(xì)胞,PBS清洗后,加入預(yù)冷的70%乙醇固定過夜,收集細(xì)胞加入RNA酶,室溫孵育30 min后,進(jìn)行PI單染,避光反應(yīng)30 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化情況。

1.2.8 蛋白免疫印跡分析檢測(cè)OPN、CD44、PCNA、Cyclin D1、Cyclin E和P27蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解1.2.3各組HPASMCs細(xì)胞,提取總蛋白,采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取等量蛋白樣品,經(jīng)凝膠電泳分離后,轉(zhuǎn)膜、封閉,加入稀釋后的一抗OPN、CD44、PCNA、Cyclin D1、Cyclin E、P27和β-actin(1 ∶1 000)及二抗(1 ∶5 000),發(fā)光檢測(cè),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上,利用Image J分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組HPASMCs細(xì)胞增殖變化情況

與常氧組相比,低氧組HPASMCs細(xì)胞存活率顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與低氧組和NC-siRNA+低氧組相比,OPN-siRNA+低氧組HPASMCs細(xì)胞存活率顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

表2 各組HPASMCs細(xì)胞存活率變化

2.2 各組HPASMCs細(xì)胞凋亡變化情況

與常氧組HPASMCs細(xì)胞凋亡率相比,低氧組HPASMCs細(xì)胞凋亡率顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與低氧組和NC-siRNA+低氧組相比,OPN-siRNA+低氧組HPASMCs細(xì)胞凋亡率顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表3、圖1)。

表3 各組HPASMCs細(xì)胞凋亡率比較

圖1 各組HPASMCs細(xì)胞凋亡變化Figure 1 Apoptosis of HPASMCs in each group

2.3 各組HPASMCs細(xì)胞周期變化情況

與常氧組相比,低氧組HPASMCs細(xì)胞SubG1期、G0/G1期比例顯著降低(P<0.05),G2/M期比例顯著升高(P<0.05);與低氧組和NC-siRNA+低氧組相比,OPN-siRNA+低氧組HPASMCs細(xì)胞SubG1期、G0/G1期比例顯著升高(P<0.05),G2/M期比例顯著降低(P<0.05,見圖2,表4)。

圖2 各組HPASMCs細(xì)胞周期變化Figure 2 Changes of cell cycle of HPASMCs in each group

表4 各組間HPASMCs細(xì)胞SubG1期、G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞百分比比較

2.4 各組HPASMCs細(xì)胞PCNA、Cyclin D1、Cyclin E和P27蛋白表達(dá)變化

與常氧組相比,低氧組HPASMCs細(xì)胞PCNA、Cyclin D1和Cyclin E蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05),P27蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與低氧組和NC-siRNA+低氧組相比,OPN-siRNA+低氧組HPASMCs細(xì)胞PCNA、Cyclin D1和Cyclin E蛋白表達(dá)均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),P27蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05,見圖3,表5)。

圖3 各組HPASMCs細(xì)胞中PCNA、Cyclin D1、Cyclin E和P27蛋白的表達(dá)Figure 3 Expression of PCNA, Cyclin D1, Cyclin E and P27 proteins in HPASMCs in each group

表5 各組間HPASMCs細(xì)胞中PCNA、Cyclin D1、Cyclin E和P27蛋白表達(dá)比較

2.5 各組HPASMCs細(xì)胞OPN和CD44 mRNA表達(dá)情況

與常氧組相比,低氧組HPASMCs細(xì)胞OPN和CD44 mRNA表達(dá)均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與低氧組和NC-siRNA+低氧組相比,OPN-siRNA+低氧組HPASMCs細(xì)胞OPN和CD44 mRNA相對(duì)水平均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表6)。

表6 各組間HPASMCs細(xì)胞OPN和CD44 mRNA相對(duì)水平比較

2.6 各組HPASMCs細(xì)胞OPN和CD44蛋白表達(dá)變化

與常氧組相比,低氧組HPASMCs細(xì)胞OPN和CD44蛋白表達(dá)均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與低氧組和NC-siRNA+低氧組相比,OPN-siRNA+低氧組HPASMCs細(xì)胞OPN和CD44蛋白表達(dá)均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖4,表7)。

圖4 各組HPASMCs細(xì)胞中OPN、CD44、β-actin蛋白的表達(dá)Figure 4 Expression of OPN, CD44, β-actin proteins in HPASMCs

表7 各組間HPASMCs細(xì)胞中OPN、CD44蛋白表達(dá)比較

3 討論

PAH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,具有較高的致殘率和病死率,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[7]。隨著對(duì)PAH病理機(jī)制的深入研究,臨床上出現(xiàn)的PAH靶向治療藥物改善了PAH的治療效果,但PAH預(yù)后仍較差[8]。PAH作為一種快速進(jìn)展的疾病,不斷完善其分子機(jī)制,可能有益于改善PAH臨床治療。此外,在機(jī)體低氧刺激下,肺血管會(huì)發(fā)生過度收縮和結(jié)構(gòu)重塑異常,從而增加肺循環(huán)阻力和肺動(dòng)脈壓力,導(dǎo)致不可逆PAH發(fā)生[9]。研究顯示,體外低氧持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)HPASMCs細(xì)胞是體外模擬肺動(dòng)脈高壓模型的經(jīng)典模型,能夠引起HPASMCs細(xì)胞的惡性增殖[10,11],因此本實(shí)驗(yàn)選擇該模型進(jìn)行初步探索。

Zhu等[12]發(fā)現(xiàn),缺氧不僅誘導(dǎo)HPASMCs異常增殖,而且抑制凋亡發(fā)生。本研究結(jié)果顯示,持續(xù)低氧誘導(dǎo)相較于常氧培養(yǎng)能夠增強(qiáng)HPASMCs細(xì)胞增殖活性、抑制凋亡發(fā)生,提示模型建立成功。另有研究顯示,抑制HPASMCs細(xì)胞增殖和DNA合成,阻斷細(xì)胞周期從G0/G1到S期進(jìn)程,提高凋亡率可能有助于對(duì)PAH發(fā)揮保護(hù)作用[13]。進(jìn)一步周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn),低氧組HPASMCs細(xì)胞SubG1期比例相較于常氧組顯著降低,這與凋亡結(jié)果一致,而G0/G1期比例顯著降低,G2/M期比例顯著升高,提示低氧誘導(dǎo)促進(jìn)HPASMCs細(xì)胞中DNA分裂。增殖細(xì)胞核抗原是DNA代謝的細(xì)胞中心,能夠在DNA復(fù)制過程中采用環(huán)形結(jié)構(gòu)促進(jìn)DNA合成[14]。此外,周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、Cyclin E參與調(diào)控細(xì)胞周期,而細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶p27能夠抑制細(xì)胞進(jìn)入S期,抑制增殖發(fā)生[15]。本研究發(fā)現(xiàn),低氧誘導(dǎo)使HPASMCs細(xì)胞中PCNA、Cyclin D1和Cyclin E蛋白表達(dá)顯著升高,P27蛋白表達(dá)顯著降低,進(jìn)一步驗(yàn)證低氧條件下HPASMCs細(xì)胞異常增殖可能與干預(yù)細(xì)胞周期、DNA合成異常增加有關(guān),但具體機(jī)制尚待明確。

OPN是一種具有酸性特征且富含天冬氨酸的高度磷酸化的多功能糖磷酸蛋白,在心血管疾病、癌癥、糖尿病和腎結(jié)石疾病以及炎癥、生物礦化、細(xì)胞增殖和傷口愈合過程中具有重要功能[16,17]。在大鼠成骨細(xì)胞中,促進(jìn)OPN mRNA和蛋白表達(dá)可能有利于增強(qiáng)成骨細(xì)胞增殖活性[18]。OPN表達(dá)于各種細(xì)胞中,可以通過抑制細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)細(xì)胞存活[19]。CD44是常見的細(xì)胞黏附分子,已被公認(rèn)可作為癌癥干細(xì)胞標(biāo)記物,并能夠與細(xì)胞外基質(zhì)成分OPN結(jié)合在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[20]。本研究結(jié)果顯示,低氧狀態(tài)下HPASMCs細(xì)胞OPN和CD44 mRNA和蛋白表達(dá)相較于常氧組顯著升高,提示低氧狀態(tài)下HPASMCs細(xì)胞活性增強(qiáng)可能與促進(jìn)OPN和CD44表達(dá)相關(guān)。

近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),OPN可通過整聯(lián)蛋白和CD44發(fā)出信號(hào),在疾病或慢性炎癥中高度上調(diào)參與病理生理過程,并與新血管生成密切相關(guān)[21]。Cao等[22]研究發(fā)現(xiàn),大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(rat aortic smooth muscle cells,RASMCs)增殖可能與OPN高表達(dá)相關(guān),通過siRNA敲低OPN表達(dá),能夠?qū)ASMCs細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。本研究通過siRNA介導(dǎo)敲低OPN表達(dá),結(jié)果顯示,與低氧組和NC-siRNA+低氧組HPASMCs細(xì)胞相比,OPN-siRNA+低氧組HPASMCs細(xì)胞OPN、CD44 mRNA和蛋白表達(dá)、存活率、G2/M期比例、PCNA、Cyclin D1、Cyclin E蛋白表達(dá)顯著降低,凋亡率、SubG1期、G0/G1期比例、P27蛋白表達(dá)顯著升高,提示敲低OPN表達(dá)水平,能夠抑制低氧誘導(dǎo)下HPASMCs細(xì)胞中CD44表達(dá)及細(xì)胞增殖,抑制周期相關(guān)蛋白表達(dá),將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,表明抑制OPN表達(dá),能夠抑制低氧誘導(dǎo)下HPASMCs細(xì)胞中CD44表達(dá),逆轉(zhuǎn)低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞異常增殖,推測(cè)OPN可能是PAH治療的潛在分子靶標(biāo)。

綜上所述,敲低OPN表達(dá)可能通過抑制CD44表達(dá),將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期,抑制低氧誘導(dǎo)的HPASMCs細(xì)胞惡性增殖,促進(jìn)其凋亡,這些發(fā)現(xiàn)可能為揭示PAH分子基礎(chǔ)及PAH臨床治療干預(yù)提供新思路。然而,PAH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,僅憑體外研究,證據(jù)尚不充分,還需要進(jìn)一步聯(lián)合動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)進(jìn)行更深入的探索。