連翹歸尾煎對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和周期的影響

遆安航,陳 瑾,翟康欣,李思思,譚麗媛,張淑蓉

(山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室,晉中 030600;*通訊作者,E-mail:zhangsr62@163.com)

連翹歸尾煎由連翹、當(dāng)歸尾、甘草、大血藤、金銀花組成,始載于《景岳全書》,具清熱解毒、活血消腫之功,主治陽分癰毒,或在臟腑、肺膈、胸乳之間者[1]。《古今圖書集成醫(yī)部全錄》記載:“若郁熱在經(jīng),而為癱疽為瘡疹者,宜連翹歸尾煎[2]”?，F(xiàn)代文獻(xiàn)見有連翹歸尾煎治療乳癰、口疽、頰瘍、牙癰、豬丹毒等的報(bào)道[3]。文獻(xiàn)資料顯示方中各單味藥及有效成分均具有抗腫瘤作用,連翹不同濃度的乙醇提取物對人胃癌、肝癌、食管癌、前列腺癌細(xì)胞等都有不同程度的體內(nèi)外抑制作用[4,5];當(dāng)歸多糖、揮發(fā)油等主要活性成分能明顯抑制人乳腺癌、肝癌、肺癌細(xì)胞[6,7];大血藤次生代謝產(chǎn)物、縮合鞣質(zhì)等成分對乳腺癌細(xì)胞有明顯的抑制作用[8,9];金銀花及其有效成分綠原酸、多糖等可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化,抑制腫瘤生長[10-12];甘草中的異甘草素、甘草次酸可以顯著抑制乳腺癌、宮頸癌、肺癌及胰腺癌等癌細(xì)胞的生長,光甘草素、甘草查耳酮A等也具有抗腫瘤作用[13,14]。本實(shí)驗(yàn)探討了連翹歸尾煎20%乙醇提取物對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制作用以及對細(xì)胞凋亡、遷移和周期的影響,為其進(jìn)一步開發(fā)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與藥物

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株(CX0200購自山西博士德公司)。連翹2019年7月采于山西太原,蒸制烘干;金銀花(批號(hào)1909011)、甘草(批號(hào)1909039)、大血藤(批號(hào)1909013)均購于山西萬民藥房;歸尾(批號(hào)1909032)購于北京同仁堂,經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院裴香萍副教授鑒定以上品種均為《中國藥典》(2020版)收載品種。

1.2 儀器與試劑

流式細(xì)胞儀:美國BD公司(facxcalibur);超凈工作臺(tái):新加坡Esco公司(OPTI MAIR);酶標(biāo)儀:上海美谷分子儀器有限公司(Spectramax);CO2培養(yǎng)箱:上海聚萊實(shí)驗(yàn)儀器有限公司(ENCO2-1246);倒置顯微鏡:北京長恒榮創(chuàng)科技有限公司(Nikon-ECLIPSE-TS100);立式滅菌器:上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司(YXQ-LS-100A)。

磷酸鹽緩沖液(無菌PBS、批號(hào):PYG0021)、MEM(批號(hào):09I01A29)、CCK-8試劑盒(批號(hào):11K01A60)胰蛋白酶均購自山西博士德公司,胎牛血清(批號(hào):20190824)購自北京賽澳美細(xì)胞技術(shù)有限公司,FITC偶聯(lián)Annexin Ⅴ凋亡試劑盒(批號(hào)8128539)購自美國BD公司,鹽酸阿霉素(批號(hào)313A0219)購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 供試品的制備

連翹歸尾煎(LQGWJ)藥液:按照連翹歸尾煎原方稱取連翹48 g、金銀花30 g、大血藤30 g、歸尾18 g、甘草6 g,分別加入10倍量、8倍量的20%乙醇回流提取兩次,各3 h,采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將兩次提取液濃縮到500 ml后,于60 ℃烘干。實(shí)驗(yàn)前用L-15培養(yǎng)液將其配成1 mg/ml的藥液,放入4 ℃冰箱保存。

鹽酸阿霉素藥液:精密稱取鹽酸阿霉素0.1 g,加入1 000 ml蒸餾水,震搖充分溶解,使其濃度為0.10 mg/ml,實(shí)驗(yàn)時(shí)用對應(yīng)的完全培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.4 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)

將人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株從液氮容器取出,在37 ℃的溫水中輕搖使其融化;待細(xì)胞復(fù)蘇完全后,置于含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的L-15培養(yǎng)液中[15],吹散細(xì)胞,使其成為懸液,1 000 r/min離心5 min,棄上清,補(bǔ)足新的培養(yǎng)液,在標(biāo)準(zhǔn)條件下傳代培養(yǎng)。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率

將生長適宜的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)盒放置在超凈工作臺(tái),加入胰蛋白酶消化2 min,終止消化后進(jìn)行離心,棄上清加L-15培養(yǎng)液,吹散細(xì)胞,在96孔板中接種細(xì)胞(100 μl/孔),每孔細(xì)胞約4 500個(gè)在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞分別標(biāo)記為無細(xì)胞空白組、陰性對照組、0.01 mg/ml鹽酸阿霉素的陽性對照組以及0.1,0.3,0.5 mg/ml連翹歸尾煎藥物的待測樣品組,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μl的CCK-8溶液,在450 nm處測定吸光度,隨后培養(yǎng)48,72 h,按上述實(shí)驗(yàn)方法操作。按下式計(jì)算抑制率:

細(xì)胞生長抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對照組OD值)]/(對照組OD值-空白組OD值)×100%

1.6 細(xì)胞劃痕法檢測細(xì)胞遷移能力

預(yù)先用記號(hào)筆在6孔板背后均勻劃一條橫線,每孔接種MCF-7細(xì)胞大約5 000個(gè),待細(xì)胞接種培養(yǎng)完全后(細(xì)胞貼壁程度符合實(shí)驗(yàn)需求),用移液槍頭與底面橫線保持垂直進(jìn)行劃痕;用PBS清洗并添加血清,將培養(yǎng)好的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞分別標(biāo)記為陰性對照組,0.01 mg/ml鹽酸阿霉素的陽性對照組,0.1,0.3,0.5 mg/ml連翹歸尾煎藥物的待測樣品組,放入標(biāo)準(zhǔn)條件培養(yǎng),按照0,6,12,24 h拍照。實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,按下式計(jì)算遷移率:

遷移率=(T0時(shí)劃痕寬度值-Tt時(shí)劃痕寬度值)/T0時(shí)劃痕寬度值×100%

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

將培養(yǎng)好的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞分別標(biāo)記為陰性對照組,0.01 mg/ml鹽酸阿霉素的陽性對照組,0.3,0.5,0.7 mg/ml連翹歸尾煎藥物的待測樣品組,繼續(xù)在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)12,24,48 h,收集細(xì)胞懸液,控制恒溫4 ℃,此條件下添加適量PI染液和Annexin Ⅴ試劑,避光孵育20 min后,使用流式緩沖液洗滌后,通過BD Facxcalibur流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

1.8 PI避光染色檢測細(xì)胞周期的變化

實(shí)驗(yàn)取流式管,將培養(yǎng)好的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞分別標(biāo)記為陰性對照組,0.01 mg/ml鹽酸阿霉素的陽性對照組,0.3,0.5,0.7 mg/ml連翹歸尾煎藥物的待測樣品組,繼續(xù)在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)24,48,72 h,收集細(xì)胞懸液,加入1.2 ml的乙醇(濃度70%)固定細(xì)胞2 h;離心收集固定的細(xì)胞,用PBS液清洗;控制恒溫4 ℃,此條件下將細(xì)胞沉淀加50 μl的RNA裂解液和200 μl的PI避光染色20 min,采用流式細(xì)胞儀檢測。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測細(xì)胞抑制率

由表1可知,不同濃度的連翹歸尾煎(LQGWJ)20%乙醇提取物,均能抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖。在LQGWJ濃度為0.5 mg/ml,并且作用72 h時(shí),對MCF-7細(xì)胞抑制作用最強(qiáng),為46.73%。與陰性對照組比較,LQGWJ低、中、高劑量組對MCF-7細(xì)胞抑制率顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 連翹歸尾煎對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞抑制率的影響

2.2 細(xì)胞劃痕法檢測細(xì)胞遷移能力

由表2可知,在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中連翹歸尾煎(LQGWJ)的陰性對照組中,人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的遷移率最高。而加入LQGWJ后,隨著濃度增大,人乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移能力降低,說明LQGWJ 20%乙醇提取物可以抑制細(xì)胞遷移,當(dāng)藥物濃度為0.5 mg/ml時(shí),遷移率最低,為(1.65±0.09)%。與陰性對照組比較,LQGWJ低、中、高劑量組的MCF-7細(xì)胞遷移率顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 連翹歸尾煎對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移率的影響

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率

由圖1可知,當(dāng)藥物作用12 h,連翹歸尾煎(LQGWJ)低、中、高劑量組早凋細(xì)胞比例大于晚凋細(xì)胞比例,鹽酸阿霉素組晚凋細(xì)胞比例大于早凋細(xì)胞比例,且均具有壞死細(xì)胞。隨著藥物作用時(shí)間延長,LQGWJ各劑量組早凋細(xì)胞比例降低,晚凋細(xì)胞比例增大,且活細(xì)胞比例降低,鹽酸阿霉素組在作用細(xì)胞48 h后,壞死細(xì)胞和晚凋細(xì)胞所占比例最大(見圖2,3)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)藥物作用48 h時(shí),各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率最大,鹽酸阿霉素組細(xì)胞凋亡率為65.31%,LQGWJ低、中、高劑量組的細(xì)胞凋亡率分別為29.31%,36.52%和42.73%。與陰性對照組比較,LQGWJ 低、中、高劑量組中MCF-7細(xì)胞凋亡率顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

與陰性對照組比較,**P<0.01圖1 連翹歸尾煎作用12 h對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響Figure 1 Effect of Lianqiao Guiwei decoction for 12 h on cell apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells

與陰性對照組比較,**P<0.01圖2 連翹歸尾煎作用24 h對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Effect of Lianqiao Guiwei decoction for 24 h on cell apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells

與陰性對照組比較,**P<0.01圖3 連翹歸尾煎作用48 h對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 Effect of Lianqiao Guiwei decoction for 48 h on cell apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells

2.4 PI避光染色檢測細(xì)胞周期的變化

當(dāng)藥物作用24 h,LQGWJ低、中、高劑量組G0/G1期細(xì)胞比例均大于鹽酸阿霉素組,S期和G2/M期細(xì)胞比例均小于鹽酸阿霉素組(見圖4)。與陰性對照組比較,LQGWJ低、中、高劑量組G0/G1期細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05),LQGWJ低、中劑量組G2/M期細(xì)胞比例無明顯差異,LQGWJ高劑量組G2/M期細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05,見圖4)。

與陰性對照組比較,*P<0.05圖4 連翹歸尾煎作用24 h對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期的影響Figure 4 Effect of Lianqiao Guiwei decoction for 24 h on cell cycle of human breast cancer MCF-7 cells

當(dāng)藥物作用48 h和72 h,LQGWJ低、中、高劑量組G0/G1期和S期細(xì)胞比例均大于鹽酸阿霉素組,G2/M期細(xì)胞比例均小于鹽酸阿霉素組(見圖5,6)。與陰性對照組比較,LQGWJ低、中、高劑量組G0/G1期細(xì)胞比例明顯升高,G2/M期細(xì)胞比例明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

與陰性對照組比較,*P<0.05圖5 連翹歸尾煎作用48 h對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期的影響Figure 5 Effect of Lianqiao Guiwei decoction for 48 h on cell cycle of human breast cancer MCF-7 cells

與陰性對照組比較,*P<0.05圖6 連翹歸尾煎作用72 h對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期的影響Figure 6 Effect of Lianqiao Guiwei decoction for 72 h on cell cycle of human breast cancer MCF-7 cells

3 討論

根據(jù)《景岳全書》的記述:“連翹歸尾煎用好酒二碗,煎至一碗服”,課題組前期[16]通過CCK-8法實(shí)驗(yàn)和HPLC法測定,以細(xì)胞抑制率和有效成分轉(zhuǎn)移率為指標(biāo),對乙醇濃度進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示以20%乙醇提取物對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞抑制作用最強(qiáng),有效成分轉(zhuǎn)移率最高,此點(diǎn)與古代米酒、果酒的濃度契合。

本實(shí)驗(yàn)研究了連翹歸尾煎20%乙醇提取物對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞抑制作用及對細(xì)胞凋亡和周期影響。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中,通過CCK-8法證明連翹歸尾煎對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞具有顯著的抑制作用,并且抑制作用與藥物濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)現(xiàn)象,實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)藥物濃度0.5 mg/ml,作用時(shí)間72 h時(shí),細(xì)胞抑制率達(dá)到46.73%。細(xì)胞劃痕法證明連翹歸尾煎20%乙醇提取物可以顯著抑制細(xì)胞遷移,通過不同濃度的藥物試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)隨著給藥濃度增大,抑制作用增強(qiáng),細(xì)胞遷移率降低。

在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)中,通過Annexin Ⅴ/PI雙染色法實(shí)驗(yàn)證明,鹽酸阿霉素通過增大G0/G1期和G2/M期細(xì)胞所占的比例,降低S期細(xì)胞的比例,從而抑制MCF-7細(xì)胞的增殖。而連翹歸尾煎通過增大G0/G1期細(xì)胞所占比例,降低S期和G2/M期細(xì)胞的比例,從而抑制MCF-7細(xì)胞的增殖,同時(shí)發(fā)現(xiàn)連翹歸尾煎隨著濃度增大,作用時(shí)間延長,細(xì)胞的凋亡率增大,將連翹歸尾煎提取物配成0.7 mg/ml的藥液,給藥48 h,細(xì)胞凋亡率為42.73%,此時(shí)藥效最佳。

綜上所述,連翹歸尾煎20%乙醇提取物可以明顯抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增值,同時(shí)抑制細(xì)胞遷移,通過調(diào)控細(xì)胞周期,延長DNA復(fù)制時(shí)間,促進(jìn)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡。