溫浸法提取黑米中原花青素工藝的研究

◎ 閆高穎，張必榮，曹文娟，張 敏，熊悅清

（陜西天谷生物科技集團(tuán)有限公司，陜西 西安 710065）

黑米是稻米中的珍貴品種，營養(yǎng)豐富，具有一定的保健作用?！侗静菥V目》記載，黑米具有滋陰補(bǔ)腎、健脾暖肝、明目活血的功效，又有“補(bǔ)血米”“長壽米”“神仙米”的美稱。黑米含有人體所必需的氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素C及鈣、鐵、鋅等礦物營養(yǎng)元素，還含有具藥用價(jià)值的黑米原花青素[1-2]。

原花青素（Proanthocyanidind，PC）是植物界中廣泛存在的一大類多酚類化合物，是目前國際上公認(rèn)的清除人體內(nèi)自由基有效的天然抗氧化劑，具有清除人體內(nèi)自由基、抗氧化活性、抗致突變活性等生理作用。近年來，從植物中提取的原花青素作為功能性因子廣泛應(yīng)用于保健食品加工中，而原花青素基本結(jié)構(gòu)單元的組成模式是其保健功能發(fā)揮的物質(zhì)基礎(chǔ)。

近年來由于原料價(jià)格上漲使原花青素生產(chǎn)成本大幅增加，失去了市場競爭中的價(jià)格優(yōu)勢，本項(xiàng)目通過查閱大量文獻(xiàn)[3-7]，發(fā)現(xiàn)原花青素的含量對溫度以及酸度比較敏感，因此以原花青素的抗氧化研究為突破口，針對原有的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，考察了提取環(huán)境對原花青素提取率的影響，提出一套新的工藝，以降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米：市售；甲醇、乙醇、正丁醇、鹽酸和硫酸亞鐵銨溶液均為國產(chǎn)分析純；原花青素標(biāo)品購自天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SP22100UV型紫外-可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司生產(chǎn)；RE252AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；DK29821型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)；DF204電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京西城區(qū)醫(yī)療器械二廠生產(chǎn)；JAC-600超聲波中藥處理機(jī)，山東濟(jì)寧超聲電器有限公司生產(chǎn)。

1.3 黑米原花青素的提取

用粉碎機(jī)將干燥的黑米粉碎，精確稱取10.0 g黑米粉末于200 mL容量瓶中，加入所需的60%酸化乙醇溶劑，在60 ℃下經(jīng)水浴提取1 h。然后減壓過濾，得到原花青素類物質(zhì)提取液，提取液低溫烘干以備檢測。

1.4 黑米原花青素的測定

精密稱取樣品100 mg于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解定容。精密吸取2 mL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即為供試液。精密吸取該供試液1 mL于10 mL具塞試管中，加入2%NH4Fe（SO4）2·12H2O的2 mol·L-1鹽酸水溶液0.2 mL，酸性正丁醇溶液6 mL，擰緊密封蓋，搖勻，擰松密封蓋。置95 ℃水浴中加熱反應(yīng)60 min，取出，在冰水浴中快速冷卻，即得待測樣品溶液。以標(biāo)準(zhǔn)樣品代替樣品，按樣品溶液制備方法，處理即得標(biāo)準(zhǔn)品溶液。以甲醇代替樣品供試液，按樣品溶液處理，即得空白溶液。在546 nm處以樣品空白溶液作為空白，測定標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液吸收度。

樣品原花青素含量按式（1）計(jì)算。

式（1）中，C為原花青素含量（%）；As、A為標(biāo)準(zhǔn)樣品、樣品吸收值；Ws、W為標(biāo)準(zhǔn)樣品、樣品稱樣量（mg）；S為標(biāo)準(zhǔn)樣品含量（%）。

1.5 單因素實(shí)驗(yàn)

1.5.1 提取料液比的確定

用粉碎機(jī)將干燥的黑米粉碎。精確稱取10.0 g黑米粉末5份分別于200 mL圓底燒瓶中，加入料液比為1∶10、1∶12、1∶14、1∶16和1∶18的60%醇溶液，60 ℃溫浸提取2次，然后減壓過濾，得到原花青素類物質(zhì)提取液，低溫烘干以備檢測。計(jì)算原花青素的含量，確定最佳提取溶劑濃度。

1.5.2 提取時(shí)間的確定

取10.0 g黑米粉末10份，加入60%醇溶液中，提取在料液比為1∶16條件下，溫浸提取的時(shí)間為1 h、1.5 h、2 h、2.5 h和3 h，60 ℃提取2次，計(jì)算原花青素的含量，確定最佳提取時(shí)間。

1.5.3 提取溫度的確定

取10.0 g黑米粉末各5份，加入60%醇溶液，料液比為1∶10，每次溫浸提取1 h，提取2次，在提取溫度為50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃條件下，計(jì)算原花青素的含量，確定最佳提取溫度。

1.5.4 提取溶劑加酸量的確定

取10.0 g黑米粉末5份，加入60%酸化乙醇溶液，料液比為1∶16，每次溫浸提取1 h，提取2次，在鹽酸體積分?jǐn)?shù)為0、0.1%、0.2%、0.3%和0.4%條件下，計(jì)算原花青素的含量，確定最佳鹽酸加量。

1.6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)溫浸提取單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度（A）、鹽酸體積分?jǐn)?shù)（B）、提取時(shí)間（C）為主要因素，每個(gè)因素各選取3個(gè)水平，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，確定最佳提取工藝。溫浸提取正交實(shí)驗(yàn)水平因素見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)水平因素表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 提取料液比對原花青素含量的影響

從圖1可知，料液比為1∶16時(shí)，提取液中的原花青素含量最高，為25.36 mg·g-1，因此選擇1∶16作為溫浸提取的最佳料液比。

2.1.2 提取時(shí)間對原花青素含量的影響

從圖2可知，提取2 h的醇提取液中原花青素的含量最高，為40.69 mg·g-1，選擇提取時(shí)間為2 h作為提取的最佳提取時(shí)間。

2.1.3 提取溫度對原花青素含量的影響

從圖3可知，提取溫度為70 ℃時(shí)，提取液中原花青素的含量最高，為39.82 mg·g-1，因此選擇提取溫度為70 ℃作為溫浸提取的最佳提取溫度。

圖1 提取料液比對原花青素含量的影響圖

圖2 提取時(shí)間對原花青素含量的影響圖

圖3 提取溫度對原花青素含量的影響圖

2.1.4 提取溶劑加酸量對原花青素含量的影響

從圖4可知，鹽酸體積分?jǐn)?shù)為0.2%的提取液中原花青素的含量最高，為34.26 mg·g-1，選擇鹽酸加量為0.2%的提取條件作為最佳提取加酸量。

圖4 提取溶劑加酸量對原花青素含量的影響圖

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

按照表1的正交實(shí)驗(yàn)水平因素安排，進(jìn)行溫浸提取實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，方差分析如表3所示。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表3 方差分析結(jié)果表

由表3可知，采用溫浸提取法提取黑米原花青素，以原花青素含量為主要考察指標(biāo)，各因素對原花青素提取工藝影響的大小為A＞C＞B，即提取溫度＞提取時(shí)間＞鹽酸體積分?jǐn)?shù)，其中提取溫度對原花青素的提取率影響最大。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，最佳的溫浸提取條件是提取時(shí)間為2 h，料液比為1∶16，0.1%鹽酸-60%醇，溫度60 ℃，故需要對正交結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，選擇最佳提取工藝，并在此條件下進(jìn)行兩組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)條件：①提取時(shí)間2 h，料液比為1∶16，0.1%鹽酸-60%醇，提取溫度為60 ℃。②提取溫度60 ℃、料液比為1∶16鹽酸體積分?jǐn)?shù)0、提取時(shí)間2 h。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

3 結(jié)論

溫浸提取的最佳工藝為：提取溶劑為0.1%鹽酸-60%醇，提取料液比1∶16，提取溫度為60℃，提取2次，每次2 h。按此工藝進(jìn)行中試放大實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該工藝下的平均產(chǎn)品回收率為149.3%，提取物的平均含量為32.1mg·g-1，相比于傳統(tǒng)工藝，新工藝提取法所得結(jié)果比老工藝提取法所得產(chǎn)品收率更高，該提取工藝穩(wěn)定，可用于大批量生產(chǎn)。