高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定普洱茶生茶中116種農(nóng)藥殘留

◎ 伍旭東，毛靜春，羅正剛，彭 權(quán)，譚文涵

（普洱市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南 普洱 665000）

當(dāng)今世界，經(jīng)濟(jì)全球化、貿(mào)易自由化進(jìn)程日益加快，世界各國對農(nóng)產(chǎn)品和食品中要求檢測的農(nóng)藥、獸藥殘留項(xiàng)目越來越多[1]。我國是茶葉生產(chǎn)大國和貿(mào)易大國之一，但近幾年來，發(fā)達(dá)國家規(guī)定的茶葉的檢測項(xiàng)目不斷增加，歐盟2020年的新標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了486種農(nóng)藥項(xiàng)目，日本在2020年的新標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了208種農(nóng)藥項(xiàng)目。我國最新的國家標(biāo)準(zhǔn)也將茶葉農(nóng)殘項(xiàng)目檢測增加到了65項(xiàng)，另外，歐盟、德國、日本等國家和地區(qū)還對標(biāo)準(zhǔn)中未列出的其他農(nóng)藥作了相應(yīng)規(guī)定，這就大幅度擴(kuò)大了茶葉的檢測項(xiàng)目，而目前有關(guān)茶葉中農(nóng)殘的檢測已有報道[2-3]，但茶葉中農(nóng)藥多殘留檢測，涉及不同極性和溶解度的各類化合物，再加上茶葉基質(zhì)復(fù)雜，含有色素、生物堿等有機(jī)物質(zhì)和鐵、鈣、鋅等無機(jī)元素等成分[2]，進(jìn)一步增加了提取、凈化和檢測的難度。茶葉行業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需求及分析儀器的不斷改進(jìn)，促進(jìn)了茶葉農(nóng)藥殘留分析技術(shù)的發(fā)展，特別是色譜-質(zhì)譜技術(shù)在農(nóng)藥多殘留中的應(yīng)用已成為分析化學(xué)領(lǐng)域的研究方向和熱點(diǎn)[3-9]。多殘留檢測通常是指檢測多種的農(nóng)藥殘留，它能夠做到同時對單一樣品中可能存在的百種以上農(nóng)藥進(jìn)行檢測。采用多殘留檢測，可以獲得更有效和更準(zhǔn)確的農(nóng)藥監(jiān)控，同時也是一種節(jié)省人力的方法，并可節(jié)省樣品制備和儀器運(yùn)行成本。以往的檢測方法檢測的農(nóng)藥數(shù)量有限，而且只能針對某一類的農(nóng)藥，即便是有茶葉中多農(nóng)藥殘留檢測的，也是分別凈化、分別進(jìn)樣，并且不使用質(zhì)譜檢測器，無法對陽性樣品確證，無法滿足國外越來越多、越來越嚴(yán)格的茶葉檢測項(xiàng)目。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SCIEX ExionLC液相儀、Triple Quad 3500三重四級桿質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）；Kinetex Biphenyl C18色譜柱（100 mm×3.0 mm，2.6 μm，美國飛諾美公司）；PV-1型小型漩渦混勻器（德國IKA公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Diret-Q5型超純水機(jī)（法國Milipore公司）；AS3120A型超聲清洗儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；M27942B型移液槍（德國Eppendorf公司）；多通道氮吹儀（美國Organomation公司）。

本實(shí)驗(yàn)所用溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為混標(biāo)，見表1，購于天津阿爾塔科技有限公司，各類物質(zhì)濃度均為10 μg·mL-1。

乙腈（色譜純，美國J.T.Bake試劑公司）；甲酸、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉（色譜純，美國Sigma公司）；N-丙基乙二胺（PSA）、碳18（C18）、墨化炭黑（GCB）（天津博納艾杰爾科技有限公司）；硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）。

表1 116種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)表

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確移取1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，避光4 ℃保存。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品提取

（1）方法1。稱取2 g茶葉樣品（精確到0.01 g），至50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，混勻，超聲提取30 min，接著振搖提取30 min，4 200 r·min-1離心5 min，取10 mL上清液至25 mL試管中，45 ℃水浴中氮吹濃縮至2 mL，待凈化。

（2）方法2。稱取2 g茶葉樣品（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入10 mL水，放置30 min。加入10 mL乙腈，振蕩15 min。再加入4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉和1 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉，劇烈振蕩1 min，以3 000 r·min-1離心5 min，準(zhǔn)確移取上清層（乙腈層）6 mL至15 mL塑料離心管中，待凈化。

1.3.2 樣品凈化

（1）方法1?；罨疌leanert-TPT柱，5 mL乙腈+甲苯（3+1，V/V）溶液淋洗1次，棄去流出液，下接50 mL試管，放入試管架上待用；將濃縮提取液移至Cleanert-TPT柱中，2 mL乙腈+甲苯（3+1，V/V）溶液洗滌試管3次，15 mL乙腈+甲苯（3+1，V/V）洗脫；待所有液體收集完畢后，取下試管；45 ℃水浴中氮吹至干；加入1 mL乙腈+0.1%甲酸水（2+8，V/V）定容，超聲波溶解，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC/MS/MS）分析。

（2）方法2。向待凈化的離心管里加入450 mg PSA、450 mg C18、200 mg GCB、900 mg硫酸鎂，振蕩混勻30 s，以3 000 r·min-1離心5 min，取3 mL上清液于試管中，氮?dú)饩従彺蹈桑? mL乙腈+0.1%甲酸水（2+8，V/V）復(fù)溶，過0.45 μm的濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC/MS/MS）分析。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Kinetex Biphenyl（100 mm×3.0 mm，2.6 μm）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流動相：A相為水（5 m mol·L-1甲酸銨），B相為乙腈（5 mmol·L-1甲酸銨）；流速：0.4 mL·min-1；梯度洗脫程序：0～0.5 min，5%B；0.5～3 min，5%B→60%B；3～7 min，60%B→80%B；7～15 min，80%B→90%B；15～16 min，90%B→95%B；16～17 min，95%B→97%B；17～17.1 min，97%B→5%B；17.1～20 min，5%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：ESI源，正離子模式。檢測方式：多反應(yīng)檢測（MRM）。離子源溫度：300 ℃。噴霧電壓：5 500 V。氣簾氣：30 psi。霧化氣：50 psi。輔助氣：60 psi。碰撞氣：Medium。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化效果比較

通過SPE法和QuEChERS法凈化后濃縮定容后的樣品溶液，QuEChERS法共提物較多，SPE法得到的樣品溶液是無色透明溶液，QuEChERS法得到的樣品溶液是淺黃色透明溶液。這些現(xiàn)象說明SPE法的凈化液中雜質(zhì)含量較少。對比分析了SPE和QuEChERS法處理茶葉空白樣品的總離子流圖（TIC），兩種方法的TIC圖總體比較一致，但由于QuEChERS法在處理過程中提取液與試劑接觸時間較短，很多雜質(zhì)在凈化過程中沒有處理干凈，導(dǎo)致TIC圖基線較高。而在SPE柱在凈化過程中，提取液以較低的流速通過SPE柱，這使得提取液與吸附劑充分接觸，從而能有效去除大量的茶葉中水溶性和脂溶性的雜質(zhì)（如多酚類、有機(jī)酸、咖啡堿和色素等）。

在茶葉樣品中添加116種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平0.02～0.1 mg·kg-1，添加靜置30 min后，SPE和QuEChERS兩種凈化方法制備兩個添加樣品，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。由表2可見，對于平均回收率在70%～80%的農(nóng)藥，SPE法占11%，QuEChERS法占17.2%；平均回收率在80%～100%范圍內(nèi)的農(nóng)藥，SPE法占80%，QuEChERS法占63.8%，同時，SPE法和QuEChERS法RSD小于10%的農(nóng)藥數(shù)量分別占95.2%和87%，表明兩種方法的重復(fù)性和再現(xiàn)性均良好。

表2 兩種提取方法普洱茶中116種農(nóng)藥平均回收率和RSD表

對于兩種方法所需的時間和成本進(jìn)行評估，以完成一個樣品為例，SPE耗時70 min左右，其中以洗脫和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)步驟最為耗時。此外，SPE法還耗費(fèi)了約45 mL的乙腈和10 mL的甲苯。而QuEChERS只耗時20 min左右，耗費(fèi)約20 mL的乙腈。相比之下，QuEChERS法的操作更為簡單快捷，且有機(jī)溶劑用量少，實(shí)驗(yàn)成本低，在處理大批量樣品時具有明顯的優(yōu)勢。QuEChERS雖然省時省力，但凈化效果不如SPE，對儀器會造成一定的污染，儀器設(shè)備需要經(jīng)常維護(hù)

2.2 濃縮方式的比較

通過116種農(nóng)藥的添加回收率實(shí)驗(yàn)，對比了旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮和氮吹濃縮對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮條件：水浴45 ℃；轉(zhuǎn)速：4 000 r·min-1；真空-220 psi。氮吹濃縮條件：水浴50 ℃；氮?dú)鈮?0 psi。

表3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和氮吹濃縮效率對比表

從表3可以看出，兩種濃縮方式均可達(dá)到回收率在70%～120%和RSD＜15%的要求，在濃縮環(huán)節(jié)兩種方法得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并無太大差異。單個樣品30 mL洗脫液濃縮時間，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)需要4 min，而氮吹濃縮需要10 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)比氮吹濃縮速度快，但氮吹同時可對42個樣品進(jìn)行濃縮，而旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)要逐個濃縮，并且需要有人持續(xù)操作設(shè)備，濃縮樣品要不斷輪換，樣品多的情況下效率比較低，所以氮吹濃縮在同時處理多樣品的情況下有比較大的優(yōu)勢。

2.3 線性范圍與檢出限

如表4所示，利用外標(biāo)法116種農(nóng)藥進(jìn)行定量，將116種目標(biāo)化合物用甲醇配制成系列質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，以目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg·L-1）、定量離子對的峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，目標(biāo)化合物在0.004～0.100 μg·L-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.099 8。在空白樣品中添加116種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，以S/N=3確定方法的檢出限（LOD），以S/N=10確定方法的定量限（LOQ），結(jié)果如表3所示，樣品中116種目標(biāo)化合物的LOD為0.000 3～0.1 mg·kg-1，LOQ為0.000 9～0.1 mg·kg-1。

表4 116種農(nóng)藥線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限表

續(xù)表4

續(xù)表4

續(xù)表4

2.4 方法的回收率和精密度

在空白樣品中添加116種農(nóng)藥進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，對方法的回收率及精密度進(jìn)行考察。在空白基質(zhì)中添加0.05 mg·kg-1、0.1 mg·kg-1、0.5 mg·kg-13個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，得到的平均回收率和精密度（n=6）。結(jié)果表明116種目標(biāo)化合物的平均回收率為71%～118.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.5%～9.8%，可以滿足農(nóng)藥殘留分析的要求。

3 結(jié)論

本方法采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，結(jié)合QuEChERS凈化技術(shù)，建立了一次前處理，同時可測普洱茶中116種農(nóng)藥殘留的系列高通量方法，該方法具有提取時間短、溶劑用量少、萃取效率高的特點(diǎn)，提高了檢測速度和檢測通量