分散固相萃取-超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定櫻桃中的苯丁錫和三苯錫的方法研究

◎ 陳佩佩，陳琳珊，何雯倩，陳 茹

（1.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 511442;2.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東 廣州 511442;3.廣東省質(zhì)量監(jiān)督食品檢驗(yàn)站，廣東 廣州 511442）

苯丁錫和三苯錫是一類感溫型抑制神經(jīng)組織的有機(jī)錫殺螨劑，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1，其特點(diǎn)為高效、毒性低、效果持續(xù)時(shí)間長，對(duì)防治果樹、茶樹、柑橘、葡萄和櫻桃等作物蟲害有顯著效果，因此，近年來在農(nóng)作物中應(yīng)用廣泛，同時(shí)在木材防腐方面也有較大的作用[1-2]。目前，對(duì)于苯丁錫和三苯錫的相關(guān)毒理性研究尚不充分，有研究表明，苯丁錫和三苯基錫具有一定的毒性，對(duì)牡蠣和其他貝類的生長有一定的影響[3]，而三苯基錫毒性比較大，低濃度就能引發(fā)生物體的內(nèi)分泌紊亂[4]。因此，對(duì)消費(fèi)者也產(chǎn)生了一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)。美國、日本、歐盟等國家也制定了相關(guān)的限量標(biāo)準(zhǔn)。GB 2763—2019中明確規(guī)定，苯丁錫在柑橘中的限量為1 mg·kg-1，而在蘋果、梨、葡萄等水果中，限量為5 mg·kg-1，櫻桃、香蕉、草莓則是10 mg·kg-1，同時(shí)也增加了動(dòng)物肉類的限量[5]。因此，建立高效快捷的測(cè)定方法具有重要的意義。

近年來，研究者對(duì)有機(jī)錫的測(cè)定方法進(jìn)行了大量的研究。目前檢測(cè)有機(jī)錫的方法主要有高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法[6-7]、氣相色譜法[8]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-10]、高效液相色譜法[11-12]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13]。高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法操作煩瑣，所需試劑多，氣相色譜及質(zhì)譜法需對(duì)樣品進(jìn)行衍生，同樣操作煩瑣，且重復(fù)性差，液相色譜法則存在靈敏度低，目標(biāo)物受雜質(zhì)干擾嚴(yán)重等缺點(diǎn)。本文建立了分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定櫻桃中的苯丁錫和三苯錫，前處理簡(jiǎn)單高效，且峰型好，靈敏度高，分析時(shí)間短，可進(jìn)行日常實(shí)驗(yàn)室大批量的測(cè)定。

圖1 苯丁錫和三苯錫的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

API4000Q質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）；島津LC-20AD液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司）；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)（法國Merck Millipore公司）；4k-15離心機(jī)（北京卓明貿(mào)易有限公司）；IKA Vortex4渦旋混勻器（廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司）。

1.2 試劑及耗材

櫻桃樣品購自廣州市市場(chǎng)；苯丁錫和三苯錫（純度≥98.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；無水硫酸鎂和氯化鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；甲酸、乙腈（HPLC級(jí)，美國Thermo Fisher公司）；C18、PSA、GCB、NH2粉和中性氧化鋁（分析純，上海安譜公司）；實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)過濾的超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm-1）。

1.3 樣品前處理

櫻桃樣品均質(zhì)后稱取2 g樣品于50 mL離心管中，加入5 mL 水和10 mL乙腈，渦旋混勻后加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉粉末，渦旋提取10 min后，置于離心機(jī)中以10 000 r·min-1離心5 min-1，轉(zhuǎn)移上清液1 mL至2 mL離心管中，加入30 mg C18粉末，渦旋2 min，10 000 r·min-1離心5 min，上清液過0.22 μm有機(jī)相濾膜上機(jī)。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量的苯丁錫和三苯錫標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，再分別吸取一定量體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液于同一10 mL容量瓶中，用乙腈定容，折算后混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度均為10 mg·L-1。

取陰性櫻桃樣品進(jìn)行前處理，得到空白基質(zhì)液，用所得基質(zhì)液配制基質(zhì)曲線，濃度分別為5.0 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1和500 μg·L-1。

1.5 色譜及質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：Xbridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流 動(dòng) 相A（甲 醇）-B（0.3%甲 酸 含10 mmol·L-1甲酸銨）；流速：0.30 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；梯度洗脫程序：0.0～2.0 min，40%→95%A；2.0～8.0 min，95%A；8.0～9.0 min，95%→40%A；9.0～13.0 min，40%A。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源；掃描方式：正離子模式；氣簾氣：25 psi；電離電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度（TEM）：550 ℃；霧化氣（GAS1）：50 psi；加熱輔助氣（GAS2）：50 psi；碰撞氣（CAD）：medium；采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)嘗試使用乙腈和甲醇作為有機(jī)相，0.3%甲酸溶液和0.3%甲酸含10 mmol·L-1甲酸銨溶液作為水相進(jìn)行了對(duì)比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲酸銨的加入對(duì)峰型影響較大，當(dāng)水相中沒有甲酸銨作為緩沖鹽時(shí)，苯丁錫在流動(dòng)相中擴(kuò)散嚴(yán)重，峰型影響尤其明顯，峰寬較寬，拖尾嚴(yán)重。而乙腈和甲醇相比，峰型影響不是很大，苯丁錫和三苯錫均能有較好的峰型，但考慮到乙腈洗脫能力較強(qiáng)，可能造成的基質(zhì)效應(yīng)相比甲醇更嚴(yán)重，所以綜合考慮，選擇甲醇-0.3%甲酸含10 mmol·L-1甲酸銨體系作為流動(dòng)相。苯丁錫和三苯錫的MRM色譜圖見圖2。

圖2 苯丁錫與三苯錫的MRM色譜圖

2.2 質(zhì)譜條件的確定

實(shí)驗(yàn)初期發(fā)現(xiàn)，苯丁錫和三苯錫的母離子均是由O-Sn鍵斷裂，產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的脫電子正離子，同時(shí)因?yàn)镾n的同位素較多，所以得到的母離子也較多，最終選擇響應(yīng)較高的作為母離子。進(jìn)一步采用流動(dòng)注射方式，優(yōu)化去簇電壓DP，使母離子響應(yīng)達(dá)到最優(yōu)，確定DP后，進(jìn)一步優(yōu)化各碎片離子的碰撞電壓CE，選擇響應(yīng)較高的兩個(gè)離子對(duì)作為定性定量依據(jù)，響應(yīng)最高的為定量離子，另外的為定性離子。詳細(xì)的質(zhì)譜參數(shù)見表1，質(zhì)譜圖見圖3。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)測(cè)定二級(jí)碎片的質(zhì)譜參數(shù)表

圖3 苯丁錫和三苯錫的二級(jí)質(zhì)譜圖

2.3 固相萃取劑種類的選擇

為了降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響，同時(shí)保證回收率，實(shí)驗(yàn)前期對(duì)固相萃取劑的種類對(duì)回收率的影響進(jìn)行了探究，選取了C18、PSA、GCB、NH2和中性氧化鋁作為固相萃取劑，使用量均為25 mg。結(jié)果顯示，在兩次平行實(shí)驗(yàn)中，C18和PSA的回收率最高，其次是NH2，對(duì)苯丁錫和三苯錫的吸附也相對(duì)較小。而GCB和中性氧化鋁對(duì)苯丁錫和三苯錫吸附嚴(yán)重，導(dǎo)致回收率低。雖然C18和PSA吸附的雜質(zhì)類型不同，但由于兩者回收率均較高，且C18的回收率要略高于PSA，因此為了簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)，最終選擇只使用C18作為固相萃取劑?；厥章式Y(jié)果見圖4。

圖4 固相萃取劑對(duì)回收率的影響圖

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的探討

櫻桃中含有大量的糖和色素，在提取過程中易被提取到乙腈層引起較大的基質(zhì)效應(yīng)，從而增強(qiáng)或抑制苯丁錫和三苯錫的離子化程度，因此，需要對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行研究和定量結(jié)果校正。實(shí)驗(yàn)分別用乙腈和空白基質(zhì)液配制100 μg·L-1的單點(diǎn)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化后的方法測(cè)定，以基質(zhì)單點(diǎn)和溶劑單點(diǎn)的峰面積比值K為判斷依據(jù)。當(dāng)K值小于80%，則說明基質(zhì)抑制效應(yīng)明顯，大于120%則說明基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)明顯。測(cè)定結(jié)果為苯丁錫38.5%，三苯錫39.8%，基質(zhì)抑制效應(yīng)較為嚴(yán)重，因此，最終使用基質(zhì)曲線進(jìn)行定量。

2.5 定量分析依據(jù)

用空白基質(zhì)溶液配制線性范圍為5.0～500 μg·L-1的基質(zhì)曲線對(duì)苯丁錫和三苯錫進(jìn)行定量。將基質(zhì)曲線按前處理方法上機(jī)測(cè)定后，以濃度為橫坐標(biāo)（X）和定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪圖，所得方程為苯丁錫：Y=38.86X+2 304，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 1；三苯錫：Y=40.21X+2 553，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 2。結(jié)果表明苯丁錫和三苯錫的基質(zhì)曲線在5.0～500 μg·L-1的濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。同時(shí)以低濃度加標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，按照信噪比RS/N=3和RS/N=10分別計(jì)算出方法檢出限和方法定量限，苯丁錫和三苯錫的檢出限均為25 μg·kg-1，定量限均為100 μg·kg-1，方法靈敏度達(dá)到分析測(cè)定要求，滿足樣品一般含量的測(cè)定。

2.6 回收試驗(yàn)及精密度

選用苯丁錫和三苯錫呈陰性的櫻桃樣品，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。根據(jù)方法定量限的1、2、5倍進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加，每個(gè)水平平行測(cè)定6次，并計(jì)算出相應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。結(jié)果得出，苯丁錫和三苯錫在櫻桃中的平均回收率范圍在80.7%～94.5%，RSD在1.26%～4.52%。表明方法回收率好，精密度高，能夠準(zhǔn)確定量櫻桃中的苯丁錫和三苯錫含量，具體結(jié)果見表2。

表2 櫻桃中苯丁錫和三苯錫的回收率和精密度（n=6）表

2.7 方法的實(shí)際應(yīng)用測(cè)定

隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)室日常樣品30個(gè)，用建立的方法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果為三苯錫均低于檢出限，而有一個(gè)樣品檢出了苯丁錫，含量為1.51 mg·kg-1，高于定限量，但符合GB 2763—2019中櫻桃樣品苯丁錫的檢出限量10 mg·kg-1規(guī)定。同時(shí)，說明目前市面上的櫻桃存在一定的苯丁錫殘留風(fēng)險(xiǎn)，需要加大監(jiān)管力度。

3 結(jié)論

本研究以分散固相萃取為前處理基礎(chǔ)，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定櫻桃中的苯丁錫和三苯錫。乙腈-水體系提取，過程快速高效，提取率高，結(jié)合C18固相萃取劑進(jìn)行凈化，回收率高；使用超高效液相色譜柱，梯度洗脫分離，在優(yōu)化后的流動(dòng)相和洗脫程序下，苯丁錫和三苯錫在9 min內(nèi)出峰，且拖尾現(xiàn)象不嚴(yán)重，峰型較好；利用基質(zhì)曲線對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行校正，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，方法回收率好、重現(xiàn)性好，可用于實(shí)際測(cè)定櫻桃中的苯丁錫和三苯錫。