中藥材小血藤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張靜雅 劉春花 馬 雪 王愛(ài)民 李勇軍 王永林 孫 佳*

1.貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心/省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004;3.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004

小血藤為茜草科植物金劍茜草(RubiaalataRoxb.)、大葉茜草(RubiaschumannianaPritzel)或鉤毛茜草(RubiaoncotrichaHand.-Mazz.)的干燥根及根莖，為我國(guó)傳統(tǒng)常用中藥[1]，亦為貴州省少數(shù)民族用藥，小血藤為三種茜草的總稱。其最早記載于秦漢時(shí)期的《神農(nóng)本草經(jīng)》，原名“茜根”，書中記載“茜根主寒濕，風(fēng)痹，黃疽，補(bǔ)中，生山谷[2]，關(guān)于茜草的藥用歷史在《名醫(yī)別錄》、《新修本草》《本草綱目》《中華本草》等歷代本草中均有描述[2]，其功效與作用是涼血止血、清熱退黃、止癢止痛、消炎殺菌[3]。小血藤主要在西南地區(qū)如云南、四川、貴州等地分布，其中金劍茜草在貴州分布較為廣泛[4]。雖然三種茜草在植物形態(tài)、生態(tài)環(huán)境及分布上略有差異，但是在民間均采集其根及根莖，用于治療吐血，衄血，崩漏，經(jīng)閉，黃疸，支氣管炎，跌撲損傷等疾病[5]，具有良好的藥用價(jià)值。

研究顯示，茜草及同屬植物的主要化學(xué)成分是蒽醌及其苷類[6]，此外還含有萘醌類、萜類、環(huán)己肽類及多糖等成分[7-11]。目前關(guān)于小血藤的質(zhì)量控制尚不完善，在《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003版)中沒(méi)有建立小血藤的定性鑒別和檢查項(xiàng)等，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)簡(jiǎn)單，限制了其應(yīng)用和開發(fā)。因此，本研究通過(guò)收集不同批次的小血藤藥材(包括三種不同的茜草)，通過(guò)開展三種不同茜草的性狀研究，鑒別研究(顯微、薄層)，有關(guān)檢查項(xiàng)目研究(水分、總灰分、浸出物)，建立共性的小血藤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為完善小血藤的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器 超聲波清洗儀(上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠)，XTP-A500多功能粉碎機(jī)(永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司)，EL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，WP-MP-II-20實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)，青島海洋硅膠G板(青島海洋化工廠分廠)，煙臺(tái)黃海江友硅膠G板(煙臺(tái)黃海江友化工廠)，青島鼎康硅膠G板(青島鼎康化工廠)，REPROSTAR3薄層數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士CAMAG公司)，DK-98-Ⅱ型水浴鍋和DH600BII恒溫箱(天津泰斯特儀器有限公司)，Pro'skitPD-153游標(biāo)卡尺購(gòu)自上海寶工工具有限公司，微量滴定管3 mL(分度值0.01 mL)、擴(kuò)散皿(標(biāo)準(zhǔn))、鑷子、載玻片、蓋玻片、酒精燈等。

1.1 試劑 無(wú)水乙醇、95%乙醇、甲醇、水合氯醛、硼酸、碳酸鉀、甘油及溴甲酚綠指示劑(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，三氯甲烷、冰醋酸、丙酮、正丁醇(上海試四赫維化工公司)，茚三酮、甲基紅指示劑(上海馨晟試化工科技有限公司)，丙三醇購(gòu)(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)，阿拉伯樹膠(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，鹽酸(重慶川東化工(集團(tuán))有限公司)，無(wú)水碳酸鈉基準(zhǔn)試劑(天津市化學(xué)試劑研究所有限公司)，以上試劑均為分析純。

1.2 試藥 本品橫切面和粉末性狀的顯微鑒別所用樣本來(lái)至于貴州不同地區(qū)收集的6批小血藤藥材樣品，樣品均由貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥民族藥標(biāo)本館龍慶德副教授鑒定為茜草科植物金劍茜草RubiaalataRoxb.、大葉茜草RubiaschumannianaPritzel或鉤毛茜草RubiaoncotrichaHand.-Mazz.的干燥根及根莖，憑證標(biāo)本存放于貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。來(lái)源見表1。(其中20170819作為對(duì)照藥材)

表1 供試品樣品來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 原植物形態(tài) 小血藤為三種不同茜草的根及根莖，植物形態(tài)中葉片材質(zhì)、葉基部形狀、花序、果實(shí)顏色、大小等存在一定差異，根據(jù)中國(guó)植物志記載[12]，總結(jié)其原植物的特征差異，見表2。

表2 小血藤三種不同來(lái)源的植物形態(tài)

2.2 性狀鑒定 參照2003版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，對(duì)采集來(lái)的6批藥材樣品除去雜質(zhì)、曬干后，采用標(biāo)尺對(duì)小血藤的大小進(jìn)行測(cè)量，用看、摸、聞、嘗等方法對(duì)樣品進(jìn)行顏色、形狀、表面、質(zhì)地、氣味、斷面的外觀鑒定。

其藥材在形狀上相似，如圖2所示。根莖結(jié)節(jié)狀，叢生多條細(xì)根。根長(zhǎng)圓柱形，略彎曲，長(zhǎng)10～30 cm，直徑0.2～1 cm；表面紅棕色或暗棕色，具細(xì)縱皺及少數(shù)細(xì)根痕；皮部脫落處黃紅色。質(zhì)脆，易折斷，斷面平坦，皮部狹窄，紫紅色，木部寬廣，淺黃紅色，可見多數(shù)小孔。氣微，味微苦，久嚼刺舌。

2.3 顯微鑒別 采用直接切片法，將根切到一層細(xì)胞的厚度，置于載玻片上，滴加水合氯醛透化，再滴加稀甘油。蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察，拍照記錄。篩選小血藤粉末少許在載玻片上，滴加水合氯醛加熱透化，再滴加稀甘油。蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察，拍照記錄。通過(guò)觀察多批小血藤根的橫切面，選擇其中有代表性的結(jié)果，如圖3～4所示，但三種來(lái)源間的橫切面的木栓層、木栓內(nèi)層、韌皮部、木質(zhì)部均存在差異，見表3。

表3 小血藤三種來(lái)源間根橫切面的特征

根據(jù)對(duì)小血藤三種來(lái)源的粉末進(jìn)行觀察后，發(fā)現(xiàn)三者的粉末顏色都呈灰褐色，進(jìn)行顯微觀察后，能明顯的觀察到草酸鈣針晶、導(dǎo)管、木栓細(xì)胞等，如圖4～5所示。但針晶、導(dǎo)管、木栓細(xì)胞等均存在差異，根據(jù)顯微鑒別后總結(jié)出其異同點(diǎn)，見表4。

表4 小血藤三種來(lái)源的粉末特征

通過(guò)對(duì)多批樣品的粉末進(jìn)行觀察和測(cè)量，其粉末的顯微鑒別特征總結(jié)如下：本品粉末棕褐色。木栓細(xì)胞呈類方形或多角形，壁增厚。草酸鈣針晶散在或成束，長(zhǎng)20～250 μm。具緣紋孔導(dǎo)管多見，直徑20～300 μm，如圖5所示。

2.4 薄層色譜鑒別 取本品粉末0.5 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取小血藤對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以石油醚-丙酮(8∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。按照擬定的的薄層色譜鑒別方法，對(duì)6批樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果圖6所示，來(lái)源于金劍茜草、大葉茜草和鉤毛茜草的小血藤的薄層色譜主斑點(diǎn)幾乎一致，但也存在一定的差異，尤其是大葉茜草，提示其所含成分種類及含量存在差異，還有待進(jìn)一步深入研究。

2.5 水分、總灰分及浸出物檢查 取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)2 g，水分照《中國(guó)藥典》2015年版通則0832水分測(cè)定法(第二法烘干法)測(cè)定。6批小血藤中含水量分為8.90%～10.08%，平均值9.52%，故暫定本品水分不得過(guò)12.0%。見表5。取本品粉末2 g，照《中國(guó)藥典》2015年版通則2302灰分測(cè)定法測(cè)定。6批小血藤中總灰分為11.1%～12.7%，平均值11.8%，暫定本品總灰分不得過(guò)15.0%。見表5。

取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)2 g，精密稱定，置100 mL的錐形瓶中，照《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2201浸出物測(cè)定法中,水溶性浸出物測(cè)定法-熱浸法，采用水為溶劑進(jìn)行浸出物測(cè)定，以浸出物作為本品質(zhì)量控制指標(biāo)之一。6批干小血藤水溶性浸出物為12.83%～16.55%，平均值14.93%，暫定本品水溶性浸出物不得少于12.0%。見表5。

表5 小血藤的水分、總灰分、水溶性浸出物測(cè)定結(jié)果 (%)

3 討論

中藥顯微鑒定是通過(guò)顯微技術(shù)確定中藥品種和質(zhì)量的一種鑒定方法，是目前中藥材鑒別的主要方法之一[12]。本研究通過(guò)對(duì)小血藤三種不同來(lái)源的根的橫切面進(jìn)行顯微鑒定，發(fā)現(xiàn)其木栓層、木栓內(nèi)層、韌皮部、木質(zhì)部及薄壁細(xì)胞中的草酸鈣針晶均有不同，粉末中的導(dǎo)管的大小也有明顯的區(qū)別。上述差異有助于對(duì)三種茜草加以區(qū)別，進(jìn)一步完善了小血藤藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

從性狀研究來(lái)看，三種茜草根及根莖的性狀無(wú)顯著差異。為了方便小血藤藥材的采集并對(duì)三種茜草加以區(qū)分，研究發(fā)現(xiàn)三種茜草在植物形態(tài)和顯微鑒別上存在一定的差異。從植物形態(tài)上看，大葉茜草葉片較寬，呈厚紙質(zhì)至革質(zhì)；金劍茜草葉片呈薄革質(zhì)，線形或披針狀線形；鉤毛茜草葉片近紙質(zhì)，其主要特征是全株均密被灰色硬毛，毛的末端作彎鉤狀。

在薄層色譜研究中，還考察專屬性和耐用性。分別考察青島海洋硅膠G板、青島鼎康硅膠G板和煙臺(tái)黃海硅膠HSG板的展開效果，三個(gè)品牌的硅膠G板中，青島海洋與青島鼎康硅膠G板的分離度基本一致，說(shuō)明其耐用性較好，煙臺(tái)江友黃海硅膠HSG板是高效板，其分離開的斑點(diǎn)較其它兩種普通硅膠G板多，從經(jīng)濟(jì)適用的角度選擇普通硅膠G板。同時(shí)，分別以不同濃度硫酸調(diào)節(jié)的展開環(huán)境相對(duì)濕度為32%、52%、72%，在25℃溫度下分別考察不同相對(duì)濕度展開的效果。結(jié)果顯示，雖不同濕度下色譜圖的條帶清晰，Rf值有一定差異，但仍能較好鑒別藥材，說(shuō)明該濕度范圍耐用性較好。分別在相對(duì)濕度58%的條件下，考察10 ℃、25 ℃、35 ℃不同溫度對(duì)薄層展開的影響，結(jié)果顯示，不同溫度下色譜圖的條帶清晰，Rf值差異不明顯，說(shuō)明該藥材受溫度的影響不大。進(jìn)一步對(duì)供試品的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，將同一批次的本品粉末于3天前、2天前、1天前、當(dāng)天按擬定的方法制備供試品溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，展開，顯色。結(jié)果顯示，放置1～3天的供試品溶液展開后的色譜圖基本一致，各斑點(diǎn)無(wú)差異。可見所建立的薄層色譜鑒別方法色譜斑點(diǎn)清晰、無(wú)干擾、專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、耐用性強(qiáng)。

在對(duì)水分、總灰分、浸出物和含量測(cè)定的限量測(cè)定中，6批小血藤的含水量平均值為9.52%，初步擬定本品水分不超過(guò)12.0%；總灰分的平均值為11.8%，初步擬定本品總灰分不超過(guò)15.0%；水溶性浸出物的平均值為14.93%，初步擬定本品水溶性浸出物不得少于12.0%。

綜上，本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)地研究了小血藤性狀特征、顯微特征、薄層色譜特征、水分、總灰分和浸出物含量，為小血藤的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。