漆姑草總黃酮大孔樹脂純化工藝研究

耿 亞 趙喜蘭 張 強(qiáng)

1.漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第二附屬醫(yī)院，河南 漯河 462300;2.漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 漯河 462002

漆姑草(SpergulajaponicaSw．)為石竹科植物漆姑草的全草，分布于東北、華北、華東、中南、西南及陜西、廣西等地，具有涼血解毒、殺蟲止癢之功效[1]。文獻(xiàn)顯示[2]，漆姑草總黃酮對(duì)腫瘤具有一定的抑制作用，其中已分離得到的主要黃酮衍生物有：6，8-二-C-葡萄糖基芹菜素、6-C-阿拉伯糖基-8-C-葡萄糖基芹菜素、8-C-葡萄糖基芹菜菜、x″-O-鼠李糖基-6-C-葡萄糖基芹菜素[3]。目前，漆姑草總黃酮多采用溶劑提取法，但該法溶劑用量比較大，所得黃酮含量不高[4]，還需要進(jìn)一步純化。大孔樹脂是一種重要的聚合物吸收劑，常用于自然資源中生物活性化合物的制備分離和純化。由于其高效，低污染和操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，大孔樹脂已被廣泛用于從天然植物中分離和純化活性成分，包括黃酮、生物堿、類萜和皂甙等[5]。本研究系統(tǒng)分析不同極性的大孔樹脂對(duì)漆姑草總黃酮的吸附和解吸能力，在最佳條件下，使用選定的樹脂純化漆姑草總黃酮。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)藥物 漆姑草采集于貴陽(yáng)花溪，經(jīng)漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校趙喜蘭副教授鑒定為石竹科植物漆姑草SpergulajaponicaSw．的全草；蘆丁對(duì)照品購(gòu)自南京景竹生物科技有限公司(批號(hào)：20180211)。

1.2 主要試劑與儀器 D101、NKA-9、ADS-5、ADS-17、AB-8及ADS-F8大孔樹脂均購(gòu)自天津南開和成科技有限公司；其余試劑均為分析純。R-220 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠；雙光束紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自上海譜元儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量的測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取蘆丁對(duì)照品12.38 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇5 mL，超聲輔助溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.495 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱定漆姑草(粉碎，過(guò)40目)1 g，加入75%甲醇50 mL，超聲輔助提取30 min，過(guò)濾，置于50 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，置10 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。分別吸取上述蘆丁溶液0.5 mL與2.5 mL蒸餾水混合，然后加入5%(m/v)的NaNO2溶液(150 μL)。 6 min后，加入250 μL10%(m/v)AlCl3·6H2O溶液，靜置5 min，加入1.0 mL 1.0 M NaOH。用蒸餾水將混合物調(diào)至5.0 mL，并充分混合。使用紫外可見分光光度計(jì)于510 nm處測(cè)量吸光度，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度(X)為為橫坐標(biāo)，建立回歸方程，Y=9.847X-0.0059，r=0.9998。線性范圍為0.025～0.198 mg/mL。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液，參照“2.1.3”分別于15、30、60、90、120 min測(cè)定吸光度，結(jié)果RSD為0.31%，表明樣品溶液在0～120 min呈色比較穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批漆姑草6份，每份1g，參照“2.1.2” 項(xiàng)制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液，參照“2.1.3” 測(cè)定吸光度，結(jié)果漆姑草中總黃酮的平均含量為2.164 mg/g，RSD為0.48%，表明樣品溶液重復(fù)性較好。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，參照“2.3”連續(xù)6次測(cè)定吸光度值，結(jié)果RSD為0.47%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 加樣回收試驗(yàn) 稱取已知含量的漆姑草(含量2.164 mg/g)粉末9份，每份0.5 g，分別按照已知含量的80%、100%、120%加入蘆丁對(duì)照品溶液(0.495 mg/mL)，參照“2.1.2”制備供試品溶液，測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn) (n=6)

2.2 上樣品溶液的制備 將漆姑草自然風(fēng)干至恒重，粉碎，過(guò)40目，稱取500 g，加20倍量的 80%乙醇浸泡1 h，然后加熱并在80 ℃回流提取3次，每次2 h。合并濾液，抽濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮到原體積的1/6，超聲輔助溶解20 min，過(guò)濾，定容到100 mL作為樣品溶液，漆姑草總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.82 mg/mL，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 樹脂的篩選

2.3.1 靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn) 將3 g(M)樹脂放入250 mL錐形瓶中，加入100 mL(V) 濃度為1.082 mg/mL(C0，樣品溶液稀釋10倍)樣品溶液，25 ℃ 100 rpm振蕩吸附24 h，通過(guò)UV分析吸附后總黃酮的總濃度(C1)，每種樹脂的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。振蕩吸附24 h后，用100 mL蒸餾水洗滌樹脂，然后用100 mL 70%乙醇解吸。將裝有解吸溶液的錐形瓶在25 ℃ 100 rpm連續(xù)振蕩24 h，分析解吸溶液中總黃酮的濃度(C2)。每種樹脂的靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。其中靜態(tài)吸附量Q(mg/g)=(C0-C1)×V/M，吸附率(%)=(C0-C1)/C0，靜態(tài)解析率(%)=(C2×V)×100%/(M×Q)。

表2顯示，所選的樹脂中，AB-8樹脂的吸附量明顯高于D101、NKA-9、ADS-5、ADS-F8，吸附率和解吸率明顯高于D101、NKA-9、ADS-5、ADS-17、ADS-F8樹脂(P<0.05)，因此，選擇AB-8樹脂作為漆姑草總黃酮純化的最佳樹脂。

表2 靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=3)

2.3.2 吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 將3 g AB-8樹脂置入錐形燒瓶中，加入濃度為1.082 mg/mL樣品溶液100 mL，25 ℃ 100 rpm振蕩吸附，分別在30、60、90、120、180、240、300、360 min不同的時(shí)間間隔內(nèi)，監(jiān)測(cè)溶液中總黃酮的濃度，計(jì)算吸附率。

圖1顯示，AB-8樹脂在0～90 min內(nèi)吸附率呈現(xiàn)明顯的增加趨勢(shì)，120 min時(shí)吸附率最高。然后，伴隨時(shí)間的推移，吸附率變化不大，故AB-8樹脂吸附時(shí)間選擇120 min。

2.3.3 解吸動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn) 將3 g AB-8樹脂置入錐形燒瓶中，加入濃度為1.082 mg/mL樣品溶液100 mL，25 ℃ 100 rpm振蕩吸附120 min，100 mL蒸餾水洗滌， 100 mL(V) 70%乙醇解吸，分別在30、60、90、120、180、240、300 min不同的時(shí)間間隔內(nèi)，監(jiān)測(cè)解吸液中總黃酮的濃度，計(jì)算解吸率。

圖2顯示，0～120 min黃酮的解吸率呈現(xiàn)明顯的增加趨勢(shì)，120 min解吸率達(dá)到最高。然后伴隨時(shí)間的推移，解吸率無(wú)明顯的變化。故黃酮解吸時(shí)間選擇120 min。

2.4 純化漆姑草總黃酮工藝

2.4.1 樣品溶液濃度對(duì)吸附率的影響 AB-8樹脂濕法裝柱，將濃度分別為8.608、4.304、2.152、1.076、0.586、0.293 mg/mL漆姑草總黃酮樣品液70 mL上樣至預(yù)處理的層析柱(2.6 cm × 40 cm)頂部，室溫(25 ℃)下保持40 min，以達(dá)到黃酮充分吸附。吸附后，用2 BV蒸餾水以2 BV/h體積流量淋洗AB-8樹脂，收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中總黃酮的濃度，計(jì)算吸附率。

圖3顯示，總黃酮濃度在0.293～1.076 mg/mL時(shí)，吸附率較好，并呈現(xiàn)明顯的上升的趨勢(shì)。而總黃酮濃度在1.076～8.608 mg/mL時(shí)，吸附率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)?？赡苁屈S酮濃度較低時(shí)，便于樹脂吸附，而高濃度的黃酮易堵塞樹脂微孔，吸附率下降。故上樣液濃度選擇1.076 mg/mL。

2.4.2 樣品溶液體積對(duì)吸附率的影響 AB-8樹脂濕法裝柱，將濃度為1.076 mg/mL漆姑草總黃酮樣品液上樣至層析柱(2.6 cm × 40 cm)，上樣體積流量為2 BV/h，收集流出液，每管10 mL，檢測(cè)總黃酮濃度，繪制吸附泄露曲線。

圖4顯示，上樣體積1～6 BV時(shí)，泄漏液中總黃酮濃度較低，且變化不大，而7 BV時(shí)，AB-8樹脂基本達(dá)到飽和狀態(tài)，泄漏明顯。故上樣液體積選擇6 BV。

2.4.3 pH對(duì)吸附率的影響 AB-8樹脂濕法裝柱，將70 mL pH分別為3、4、5.7、6、7、8的樣液(總黃酮質(zhì)量濃度1.076 mg/mL)上樣至層析柱(2.6 cm × 40 cm)，上樣體積流量為2 BV/h，并在室溫(25 ℃)下保持40 min，以達(dá)到黃酮充分吸附。用2 BV蒸餾水以2 BV/h體積流量淋洗AB-8樹脂，收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中總黃酮的濃度，計(jì)算吸附率。

圖5顯示，pH從3～5.7，總黃酮的解吸率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，然后伴隨pH的增加，解吸率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。其原因可能是酸性過(guò)大，容易形成烊鹽，而pH過(guò)大會(huì)破壞黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)。故pH選擇5.7，即原液的pH。

2.4.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響 AB-8樹脂濕法裝柱，將70 mL的樣液(總黃酮質(zhì)量濃度1.076 mg/mL)上樣至預(yù)處理的層析柱(2.6 cm × 40 cm)，上樣體積流量為2 BV/h，流出液重復(fù)上樣一次，2 BV蒸餾水沖洗，3 BV不同濃度的乙醇(30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%)以2 BV/h體積流量進(jìn)行解吸，收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中總黃酮的濃度，計(jì)算解吸率。

圖6顯示，伴隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，解吸率呈現(xiàn)明顯的增加趨勢(shì)，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，解吸率最佳，故乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇70%。

2.4.5 洗脫液體積對(duì)解吸率的影響 AB-8樹脂濕法裝柱，將70 mL的樣液(總黃酮質(zhì)量濃度1.076 mg/mL)上樣至預(yù)處理的層析柱(2.6 cm × 40 cm)，上樣體積流量為2 BV/h，流出液重復(fù)上樣一次，2 BV蒸餾水沖洗，然后采用1、2、3、4、5 BV體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇以2 BV/h體積流量進(jìn)行解吸，收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中總黃酮的濃度，計(jì)算解吸率。

圖7顯示，伴隨洗脫體積的增加，解吸率呈現(xiàn)明顯的增加趨勢(shì)，當(dāng)洗脫體積達(dá)到3 BV時(shí)，解吸率最佳，繼續(xù)增加洗脫體積，解吸率變化不大。故洗脫體積選擇3 BV。

2.4.6 洗脫流速對(duì)解吸率的影響 AB-8樹脂濕法裝柱，將70 mL的樣液(總黃酮質(zhì)量濃度1.076 mg/mL)上樣至預(yù)處理的層析柱(2.6 cm × 40 cm)，上樣體積流量為2 BV/h，流出液重復(fù)上樣一次，2 BV蒸餾水沖洗，然后采用70%的乙醇分別以1、2、3、4 BV/h體積流量進(jìn)行解吸，收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中總黃酮的濃度，計(jì)算解吸率。

圖8顯示，流速為1～2 BV/h時(shí)，解吸率較高。伴隨流速的增加，解吸率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。但流速過(guò)低，洗脫時(shí)間將明顯延長(zhǎng)，故流速選擇2 BV/h。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 選擇三份樣品，每份500 g，在最佳純化工藝條件下，分別進(jìn)行吸附-解吸實(shí)驗(yàn)，計(jì)算純化后漆姑草總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果平均總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75.50%，RSD 為 1.21%，表明本研究所建立的 AB-8 樹脂純化漆姑草總黃酮的方法穩(wěn)定、可靠。見表2。

表2 中試試驗(yàn)

3 討論

紫外分光光度法是測(cè)定總黃酮含量比較常用的方法，具有操作簡(jiǎn)便、高效、快速的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于黃酮的定量分析。本研究中，通過(guò)方法學(xué)考察發(fā)現(xiàn)，該法穩(wěn)定性較好，溶液在0～120 min呈色比較穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和儀器精密度良好，加樣回收率達(dá)到95.48%～101.25%，可作為測(cè)定漆姑草總黃酮的有效方法。

目前，黃酮類化合物的純化主要應(yīng)用大孔吸附樹脂和聚酰胺樹脂。與聚酰胺樹脂相比，大孔吸附樹脂具有吸附容量大、選擇性好、再生簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，在黃酮類化合物的分離純化中得到廣泛應(yīng)用[6]。本研究選擇非極性(D101、ADS-5型)、弱極性(AB-8、ADS-17型)以及極性(NKA-9、ADS-F8型)大孔樹脂，系統(tǒng)地研究和比較6種樹脂的吸附和解吸能力，初步考察不同類型樹脂對(duì)草果總黃酮的富集效果。結(jié)果顯示，AB-8樹脂因其出色的吸附和解吸能力而被選擇為最佳吸附劑，與漆姑草總黃酮極性特征對(duì)應(yīng)。本研究在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)上樣液濃度、上樣液體積、上樣液pH、洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)、洗脫液體積、洗脫流速進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，結(jié)果漆姑草總黃酮純化的最佳工藝條件為：進(jìn)料溶液在pH值為5.7、上樣液體積6 BV，在25 ℃原始總黃酮濃度為1.076 mg/mL的條件下進(jìn)行。靜態(tài)洗脫和動(dòng)態(tài)洗脫溶液選擇為體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇、洗脫液體積3 BV、洗脫流速2 BV/h以提高漆姑草總黃酮的解吸率。通過(guò)AB-8樹脂進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附和解吸后，最終產(chǎn)品中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75.50%。

總之，本研究以漆姑草總黃酮含量為指標(biāo)，以分光光度法作為定量分析手段，利用AB-8樹脂開發(fā)了一種從漆姑草中分離純化黃酮類化合物的可行而有效的方法。