蘑菇毒素分析研究進展

◎ 毛新武，劉 璐，陳 婷，易云婷

（廣州市食品檢驗所，廣東 廣州 510000）

1 蘑菇毒素種類概述

蘑菇安全事關人們的健康與生命，近100年來，各國科學家和菌物工作者對有毒蘑菇開展了大量的研究工作，最早可追溯到19世紀[1]。1891—1893年，德國人Kobert開始研究歐洲的鵝膏菌（A. phalloides）毒素。后來，德國Freiberg大學的Heinrich Wieland提取鵝膏毒素，獲得了鵝膏菌毒素的結晶體，并確定了鵝膏菌毒素的元素組成和分子量。

國內(nèi)對毒蘑菇的系統(tǒng)研究最早開始于20世紀七八十年代，包括毒蘑菇的種類調(diào)查、毒性及其中毒類型。據(jù)文獻[1]介紹，我國已報道的毒蘑菇約500種，主要的劇毒蘑菇有灰花紋鵝膏、致命鵝膏、黃蓋鵝膏白色變種、擬灰花紋鵝膏、淡紅鵝膏、裂皮鵝膏、黃蓋鵝膏、假褐云斑鵝膏近似種、條蓋盔孢傘、毒溝褶菌和亞稀褶紅菇等。目前已發(fā)現(xiàn)的鵝膏毒素有九大類，其中環(huán)肽類毒素22種，抗毒環(huán)肽酰胺1種，溶血活性蛋白1種。其中能確定結構的是鵝膏毒肽（Amatoxins）、鬼筆毒肽（Phallotoxins）及毒傘素（Virotoxins）等22種環(huán)肽類毒素，其典型化學結構式見圖1[2]。

2 蘑菇毒素儀器分析技術進展

α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽是最主要的致死毒素，因此蘑菇毒素的檢測多集中于鵝膏毒肽的檢測，國內(nèi)外都對此進行了大量研究，建立了顯色檢測法[3-4]、放射免疫檢測法[5-7]、酶聯(lián)免疫[8-9]、紫外吸收光譜法[10]、高效液相色譜[11-12]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[13-17]等多種分析方法。質(zhì)譜技術的發(fā)展為蘑菇毒素的檢測提供了更為快速、準確的技術支持，適用于蘑菇毒素中毒事件中毒素的確證分析。

圖1 鵝膏毒肽、鬼筆毒肽及毒傘素化學結構式圖

近年來，由于液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用，特別是串聯(lián)質(zhì)譜新技術的不斷出現(xiàn)，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）已成為現(xiàn)代分析化學中的重要部分。與高效液相色譜（HPLC）相比，LC-MS/MS所需樣本量少，選擇性好，特異性強，靈敏度高，可實現(xiàn)生物樣品和食品等復雜基質(zhì)中鵝膏肽類毒素的痕量分析，液相色譜-飛行時間-質(zhì)譜聯(lián)用技術（LC-TOF-MS）能對樣品中化合物進行質(zhì)譜全信息采集，更適合分析毒蘑菇中毒患者的體液，可同時檢測多種毒素。LC-MS/MS逐漸成為鵝膏肽類毒素分析的主流技術[18]。

以上方法都屬于標物依賴性定向分析（Targeted Analysis）技術，僅適用已知的毒素檢測，需依賴標準物質(zhì)進行定性。但是，在目前已知的22種鵝膏毒素中，僅有5種能夠獲得商業(yè)化標準物質(zhì)，且商業(yè)化標準物質(zhì)非常匱乏，需依賴進口，且購買周期長，導致檢測時效性和準確性差，篩查效率低，無法及時應對食物中毒突發(fā)事件，遠不能滿足食品安全應急監(jiān)管的需要。目前蘑菇中毒事件的定性仍然以形態(tài)學鑒定為主，90%以上的蘑菇中毒事件未能進行蘑菇鑒定和毒素檢測，給該類食品安全事故應急處置和臨床救治造成了較大困擾，目前研究的重點集中在高分辨質(zhì)譜的篩查方法研究[19]。

3 非標物依賴篩查技術

蘑菇中毒素眾多，迄今已有超過100種毒素被鑒定[20]，且不斷有新的毒素被發(fā)現(xiàn)[21]，如魏佳會[22]等采用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術對12種劇毒鵝膏菌的肽類毒素成分及其相對含量進行了比較研究。共檢測出19種化合物，其中13種屬于已知鵝膏肽類毒素，5種為未知鵝膏肽類毒素，1種為未知小分子化合物組分；ZHOU等[23]從引起云南不明原因猝死的毒溝褶菌（Trogiavenenata）中分離獲得了2個新的毒素成分，即2R-氨基-4S-羥基-5-己炔酸（2R-amino-4S-hydroxy-5-hexynoic acid） 和 2R-氨基-5-己炔酸（2R-amino-5-hexynoic acid），其對小鼠的半致死劑量分別為71 mg·kg-1和84 mg·kg-1。張爍[24]利用高分辨質(zhì)譜離子軌道阱平行反應監(jiān)測（PRM）與全離子裂解（AIF）相結合的模式，建立了基于特征碎片的毒素篩查方法，在6個劇毒鵝膏樣品中發(fā)現(xiàn)了11個環(huán)肽類毒素，其中4個鑒定為amaninamide、phallisacin、Alal-viroidin和viroidin，其他為新化合物。這是首次在鱗柄鵝膏以外的種屬中發(fā)現(xiàn)了virotoxin類化合物，且含量很高，這一新發(fā)現(xiàn)打破了對virotoxin的傳統(tǒng)認知。這些新毒素的出現(xiàn)為蘑菇毒素的檢測和中毒早期臨床診斷提出了新的挑戰(zhàn)。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法屬于定向分析，無法檢測這些新發(fā)現(xiàn)的蘑菇毒素和17種缺少標準物質(zhì)的已知毒素，存在潛在風險。

非定向篩查分析（Non-Targeted Analysis）是由代謝組學發(fā)展而來的一種新型分析方法，運用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術，采集一級、二級質(zhì)譜的原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過峰匹配以及濾噪處理后，利用目標化合物特征離子的精確質(zhì)量數(shù)、同位素匹配、二級碎片信息進行數(shù)據(jù)庫匹配，在無標準品情況下非定向篩查小分子化合物，具有未知物鑒定能力強的優(yōu)點。本方法已經(jīng)廣泛應用在食品中農(nóng)獸藥殘留、非法添加物、植物毒素生物活性物質(zhì)和新型污染物的篩查檢測中，是目前最前沿的分析方法。

但是，高分辨質(zhì)譜在非定向分析時數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性、重復性以及定量的線性范圍等方面仍存在一定的缺陷。以三重四極桿質(zhì)譜多反應監(jiān)測（MRM）或離子軌道阱平行反應監(jiān)測（PRM）為代表的定向分析技術，具有穩(wěn)定性好，定量準確的優(yōu)點。因此，本文擬將非定向分析的高通量、無偏的分析信息獲取和定向方法的高特異性檢測和準確定量相結合，在非定向篩查方法建立時用高分辨質(zhì)譜獲取代謝物的離子對信息，而在轉(zhuǎn)換為實際樣品分析時定向多反應檢測（MRM）方式或平行反應監(jiān)測（PRM）的目標化合物物豐度定性比和質(zhì)譜參數(shù)，從而實現(xiàn)定向/非定向分析方法的整合，建立覆蓋度高、線性和重復性良好，且不需要標樣來限定檢測的蘑菇毒素整體檢測方法。

同時，質(zhì)譜分析易受樣品基質(zhì)干擾，傳統(tǒng)的蘑菇毒素樣品前處理方法包括固相萃取（SPE）和溶劑提取，前處理時間長，成本較高，而且不可避免會提取到樣品中的磷脂和脂肪，造成嚴重基質(zhì)效應，不適合非定向分析。QuEChERS是近年來最新發(fā)展起來的一種用于農(nóng)產(chǎn)品檢測的快速樣品前處理樣品的技術，通過提取、凈化等步驟，達到快速提取待測組分、同時除去多余的水及其他雜質(zhì)的目的。

目前該類研究在疾病特征肽的研究中有所發(fā)展，其中決策樹分類器，給予顯著性測試的特征選取，基于模擬退火算法組合優(yōu)化模型的蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)特征選取等均有相關的研究報告，考慮參考其對應的數(shù)理統(tǒng)計方法與模型進行食品領域數(shù)據(jù)的拓展與探索。

4 結語

筆者認為，蘑菇毒素檢驗的發(fā)展方向應為：①整合定向/非定向分析策略，立全組分蘑菇毒素分析方法和技術平臺，揭示毒素裂解特征反應和特征離子，構建的分子特征峰提取和分子結構智能解析方法，提升未知毒素篩查鑒定效率和準確度。②設計特異性凈化毒素的QuEChERS試劑包和非標物依賴定向/非定向篩檢方法包，提高檢驗效率和分析靈敏度，實現(xiàn)快速篩查。③應用多肽組學研究分析與挖掘方法，探索毒蘑菇特征肽信息與其分類情況，為可疑蘑菇鑒定、蘑菇毒素確證和中毒早期臨床診斷提供技術支持。