間斷性PTHrP對成牙骨質(zhì)細(xì)胞凋亡及礦化的影響

李盛楠 李 釩 管修晨 白玉興

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院正畸科 口腔醫(yī)學(xué)研究所，北京 100050)

甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(parathyroid hormone related protein, PTHrP)是在研究惡性腫瘤引起高鈣血癥機(jī)制的過程中分離出的一種多肽類物質(zhì)，因其氨基酸末端與甲狀旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)相似而得名，兩者具有共同受體甲狀旁腺激素I型受體(parathyroid hormone type I receptor, PTH1R)，并認(rèn)為PTHrP是PTH調(diào)節(jié)骨形成和骨重建過程中針對局部區(qū)域起效的關(guān)鍵作用物[1]。

PTHrP主要以自分泌、內(nèi)分泌或旁分泌方式調(diào)節(jié)細(xì)胞增生和分化，在骨骼發(fā)育、軟骨生成、成骨及破骨等生理過程中起著重要的作用[2]。研究[3-4]顯示PTHrP可以促進(jìn)成骨細(xì)胞或未成熟的成骨細(xì)胞增生、分化，有效地增加骨質(zhì)疏松患者的骨密度，加快骨折的愈合，甚至在促進(jìn)骨形成效能方面已經(jīng)超越PTH。與甲狀旁腺激素相類似，PTHrP對骨組織的代謝也具有雙向調(diào)節(jié)作用[5]。研究[6]顯示，持續(xù)性PTHrP刺激能夠通過激活Notch信號通路促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的破牙骨質(zhì)向表達(dá) ，或通過核因子κb受體活化劑配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL) /降低骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)信號通路抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞的礦化及成牙骨質(zhì)向功能活性[7]。但以往研究[5-7]都關(guān)注于PTHrP的分解代謝作用，而間斷性PTHrP對牙周組織影響的研究尚未見報道。

牙骨質(zhì)是覆蓋于牙根表面的一層礦化組織，成牙骨質(zhì)細(xì)胞貼在牙骨質(zhì)表面，是牙骨質(zhì)的功能細(xì)胞，促進(jìn)基質(zhì)沉積，刺激新牙骨質(zhì)生成，在牙齒移動過程中發(fā)揮重要作用，同時直接參與牙根吸收后的修復(fù)。本研究擬通過體外培養(yǎng)成牙骨質(zhì)細(xì)胞OCCM-30，利用甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白PTHrP(1-36)及PTH1R阻斷劑PTHrP(7-34)，探索間斷性PTHrP在調(diào)節(jié)牙骨質(zhì)生成過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

OC-Tag轉(zhuǎn)基因小鼠磨牙牙周組織細(xì)胞分離純化的永生化成牙骨質(zhì)細(xì)胞株OCCM-30細(xì)胞，來自于美國國家衛(wèi)生研究院的Somerman教授贈送。將細(xì)胞生長于含10% (體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和雙抗[1%(體積分?jǐn)?shù))青霉素100 U/mL、鏈霉素 100 μg/mL]的DMEM中，于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：恒溫培養(yǎng)箱 (德國賀利氏公司)、Real-Time分析儀(美國Applied Biosystems公司)、紫外可見分光光度計(美國NanoDrop公司)。

試劑：Annexin: FITC 凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)；BCA蛋白定量分析試劑盒(中國碧云天公司)；real-time PCR引物(日本Takara公司)；COL-1抗體 (美國Abcam公司)；OPN抗體、IGF-1抗體 (美國Santa Cruz Biotechnology公司)。

主要試劑配制：將PTHrP(1-36) 或PTHrP(7-34)粉劑(美國Bachem公司)以1 mg/mL溶于乙酸中保存于-70 ℃，使用時加入含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，使得PTHrP(1-36)、PTHrP(7-34)終濃度為2.5 nmol/L ，配制含相同體積比例乙酸的DMEM培養(yǎng)基作為對照組。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞分組與處理

當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到80%～90%時，對細(xì)胞進(jìn)行分組處理：對照組、PTHrP(1-36)組或 PTH1R阻斷劑組。間歇性給藥模式包含3個周期，48 h/周期，每個周期前6 h使用含PTHrP(1-36) 或PTH1R阻斷劑PTHrP(7-34)的培養(yǎng)基，余下42 h換為普通培養(yǎng)基。3個周期結(jié)束后，消化、收集細(xì)胞并進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測PTHrP對成牙骨質(zhì)細(xì)胞OCCM-30細(xì)胞凋亡的影響

對成牙骨質(zhì)細(xì)胞給予PTHrP(1-36)、PTH1R阻斷劑PTHrP(7-34)刺激3個周期后，PBS清洗3次，收集細(xì)胞。預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次后，加入500 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再加入5 μL 熒光標(biāo)記的Annexin V，混勻后，加入5 μL 碘化丙啶，混勻后避光室溫下孵育5 min，再加入500 μL結(jié)合緩沖液，轉(zhuǎn)至流式檢測管，立即上流式細(xì)胞儀分析。通過相應(yīng)的配套軟件，計算分析各樣本凋亡細(xì)胞的百分比。

1.3.3 茜素紅染色觀察PTHrP對成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化功能的影響

在對照組、PTHrP(1-36)組和PTHrP(7-34)組培養(yǎng)基中分別添加礦化誘導(dǎo)液(50 μmol 抗壞血酸磷酸鹽和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉)進(jìn)行誘導(dǎo)，成牙骨質(zhì)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)10 d后,經(jīng)95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇固定細(xì)胞10 min，雙蒸水洗3次后，0.1%(體積分?jǐn)?shù))茜素紅溶液(pH值為8.3)染色30 min，干燥，鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況。

1.3.4 Real-time PCR檢測

收集細(xì)胞后進(jìn)行RNA提取以及反轉(zhuǎn)錄，real-time PCR反應(yīng)體系包含10 μL SYBR混合物，7.2 μL 滅菌蒸餾水，2 μL cDNA和0.8 μL 引物。進(jìn)行3次獨(dú)立實驗。PCR引物詳見表1。

表1 PCR引物序列

1.3.5 Western blotting法檢測

細(xì)胞經(jīng)過3個周期處理后，使用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞。加入細(xì)胞裂解液對細(xì)胞進(jìn)行裂解。在4 ℃，14 000 r/min離心20 min，取少量上清至新的EP管中，用于BCA蛋白定量檢測。將等量的蛋白質(zhì)加入到10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS-聚丙烯酰胺凝膠上通過電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉室溫封閉1 h后，將待測抗體和內(nèi)參按照一定比例用封閉液封閉，4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次后，加入羊抗兔、羊抗小鼠的二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。二抗孵育結(jié)束后，用TBST洗滌3次。將配好的等體積增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescent, ECL)的兩種液體混合后，顯色，于暗室中進(jìn)行曝光。應(yīng)用Image-Pro Plus軟件分析灰度值，進(jìn)行3次獨(dú)立實驗。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 間歇性PTHrP刺激對成牙骨質(zhì)細(xì)胞OCCM-30凋亡的影響

給藥前，對照組、PTHrP組、PTH1R阻斷組凋亡細(xì)胞百分比分別為12.6%±1.0%、13.4%±0.6%和12.4%±0.9%，各組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在間斷性PTHrP(1-36)刺激3個周期后，流式結(jié)果顯示PTHrP組早期和晚期凋亡細(xì)胞比例明顯下降，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。相反，在PTH1R阻斷劑PTHrP(7-34)刺激下，成牙骨質(zhì)細(xì)胞早期和晚期凋亡的百分比明顯增加，明顯大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

圖1 間斷性PTHrP(1-36)和PTHrP(7-34)刺激3個周期后成牙骨質(zhì)細(xì)胞OCCM-30凋亡細(xì)胞百分比

2.2 間歇性PTHrP刺激對成牙骨質(zhì)細(xì)胞OCCM-30礦化功能的影響

成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)OCCM-30細(xì)胞的同時分別加入PTHrP(1-36)、PTH1R阻斷劑，間歇性刺激后茜素紅染色結(jié)果顯示PTHrP組礦化結(jié)節(jié)形成增多，更加明顯，茜素紅染色更深。相較于對照組，PTH1R阻斷劑PTHrP(7-34)刺激下礦化結(jié)節(jié)形成數(shù)目更少，茜素紅著色更淺(圖2)。

圖2 間斷性PTHrP(1-36)和PTHrP(7-34)刺激3個周期后成牙骨質(zhì)細(xì)胞OCCM-30茜素紅染色

2.3 間歇性PTHrP刺激對成牙骨質(zhì)相關(guān)蛋白OPN、COL-1和IGF-1的mRNA表達(dá)的影響

與對照組相比，間歇性PTHrP(1-36)給藥刺激后，成牙骨質(zhì)相關(guān)蛋白OPN、COL-1和IGF-1基因表達(dá)均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。相反，PTH1R阻斷劑組中成牙骨質(zhì)相關(guān)蛋白OPN、COL-1和IGF-1基因表達(dá)明顯下調(diào)，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖3 間斷性PTHrP(1-36)和PTHrP(7-34)刺激3個周期后成牙骨質(zhì)細(xì)胞OCCM-30中COL-1、OPN和IGF-1 mRNA表達(dá)變化

2.4 間歇性PTHrP刺激對成牙骨質(zhì)相關(guān)蛋白OPN、COL-1和IGF-1的蛋白表達(dá)的影響

在3個間歇性PTHrP(1-36)給藥循環(huán)后，Western blotting法檢測結(jié)果顯示成牙骨質(zhì)相關(guān)蛋白OPN、COL-1和IGF-1蛋白表達(dá)均明顯增加(圖4A)，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在PTH1R阻斷組，OPN、COL-1和IGF-1蛋白表達(dá)水平均受到不同程度的抑制，明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4B)。

圖4 間斷性PTHrP(1-36)和PTHrP(7-34)刺激3個周期后成牙骨質(zhì)細(xì)胞OCCM-30中COL-1、OPN和IGF-1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平變化

3 討論

PTHrP在人類及其他多種物種中廣泛表達(dá)，通過自分泌、旁分泌及內(nèi)分泌的形式作用于各個組織中，參與調(diào)控牙齒、乳腺及心臟血管的發(fā)育[1]。近年來研究[4, 8]顯示甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白能夠有效地促進(jìn)骨組織的合成，加速骨愈合，表現(xiàn)更優(yōu)于其他促骨組織修復(fù)的藥物 。臨床研究[3-4]發(fā)現(xiàn)對絕經(jīng)后的婦女注射甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白PTHrP(1-36)，其骨形成標(biāo)志物骨鈣素和堿性磷酸酶的表達(dá)明顯增高，骨密度明顯增加。通過體外研究[9]發(fā)現(xiàn)，間歇性PTHrP能夠刺激成骨樣細(xì)胞中COL-1及OCN等成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)，同時抑制細(xì)胞凋亡[10]，進(jìn)一步促進(jìn)礦化沉積。此外，以往研究[11]證實牙胚發(fā)育時，成釉器星網(wǎng)狀層細(xì)胞和上皮細(xì)胞高度表達(dá)PTHrP，PTHrP作為一種程序性細(xì)胞分化的基因，與牙乳頭細(xì)胞表面PTH1R相互作用，調(diào)控牙本質(zhì)及牙釉質(zhì)的形成，但PTHrP在成牙骨質(zhì)中的作用尚未見報道。

本研究以體外培養(yǎng)成牙骨質(zhì)細(xì)胞OCCM-30細(xì)胞為對象，發(fā)現(xiàn)間斷性PTHrP刺激能降低成牙骨質(zhì)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的百分比，凋亡早期和中晚期細(xì)胞比例均有減少，其中凋亡中晚期細(xì)胞的減少更加明顯。另外，阻斷PTH1R能誘導(dǎo)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的凋亡，說明PTHrP/PTH1R在成牙骨質(zhì)細(xì)胞中起到了抑制細(xì)胞凋亡的作用。研究[2, 12-13]顯示，間歇性PTH/PTHrP刺激可以抑制骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活，并發(fā)現(xiàn)PTH和PTHrP的抗凋亡作用一部分依賴于PTH1R，這些結(jié)果與本研究得到的結(jié)果一致。研究[14]顯示，在成骨細(xì)胞中PTH1R可以通過與間隙連接蛋白connexin43及磷脂酰肌醇三激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)相互作用，從而抑制成骨細(xì)胞凋亡。但PTHrP/PTH1R在成牙骨質(zhì)細(xì)胞中抗凋亡的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

OPN和COL-1是牙骨質(zhì)基質(zhì)初始沉積過程中表達(dá)的礦化蛋白，與IGF-1相互作用，能夠促進(jìn)細(xì)胞后續(xù)的黏附、增生及分化，從而有助于形成牙骨質(zhì)[15-16]。研究[17]顯示,在牙骨質(zhì)修復(fù)早期，在陷窩內(nèi)及周圍牙周組織細(xì)胞內(nèi)均有OPN及COL-1表達(dá)，且OPN在新形成的牙骨質(zhì)層的高表達(dá)優(yōu)先于牙周膜細(xì)胞，能夠促進(jìn)成牙骨質(zhì)前體細(xì)胞分化及牙骨質(zhì)基質(zhì)礦化。IGF-1通過促進(jìn)牙周細(xì)胞增生、分化等細(xì)胞進(jìn)程，能夠促進(jìn)牙周組織重建[18-19]。本研究結(jié)果顯示，間歇性PTHrP可促進(jìn)成牙骨質(zhì)礦化相關(guān)蛋白OPN、COL-1和細(xì)胞因子IGF-1基因及蛋白的表達(dá)，同時發(fā)現(xiàn)阻斷PTH1R可導(dǎo)致OPN、COL-1和IGF-1基因及蛋白水平下降，說明間歇性PTHrP能夠促進(jìn)成牙骨質(zhì)礦化相關(guān)蛋白及生長因子表達(dá)增加，且這一過程是通過與PTH1R相互作用來完成的，這提示PTHrP/PTH1R信號系統(tǒng)能夠抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞凋亡，刺激成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化過程，從而加快牙骨質(zhì)的形成及修復(fù)。

與本研究結(jié)果不同的是，既往研究[20-22]顯示，PTHrP促進(jìn)牙周膜細(xì)胞中RANKL及OPG的表達(dá)，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞增加，這種差異可能是由于PTHrP的給藥方式不同導(dǎo)致的。早期研究[23]中PTHrP刺激均為持續(xù)性的給藥方式，并且給藥劑量較大，激活的是PTHrP的促進(jìn)骨分解代謝的作用，而本研究采用間斷式給藥模式，發(fā)揮PTHrP/PTH1R抗凋亡，促進(jìn)成牙骨質(zhì)向合成代謝的作用。此外，有研究[24]證實體內(nèi)間斷性注射PTHrP能夠有效抑制糖尿病大鼠牙槽骨的喪失及白細(xì)胞介素-1(interleukin-1, IL-1)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)炎性反應(yīng)因子的表達(dá)，從而促進(jìn)骨組織合成，但PTHrP作用于牙骨質(zhì)的體內(nèi)研究尚未見報道，后續(xù)仍需要相應(yīng)動物實驗進(jìn)行驗證。

綜上，間斷性PTHrP可通過與成牙骨質(zhì)細(xì)胞上PTH1R相互作用抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)成牙骨質(zhì)礦化相關(guān)蛋白及細(xì)胞因子的表達(dá)，發(fā)揮其促成牙骨質(zhì)礦化沉積的合成代謝作用，促進(jìn)牙根吸收的修復(fù)，從而為正畸引起的牙根吸收的預(yù)防和治療提供新的思路。但關(guān)于PTHrP/PTH1R對成牙骨質(zhì)細(xì)胞中抑制凋亡和促成牙骨質(zhì)礦化的作用機(jī)制，還需進(jìn)一步的研究。