氯化鋰對苯并[a]芘暴露致大鼠胚胎海馬神經(jīng)元損傷的改善作用

張楠，張英英，王鶴霏，陳茜，白文琳，孫誼然，張文平

山西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院 a.衛(wèi)生毒理學教研室 b.流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學教研室 c.兒少衛(wèi)生與婦幼保健學教研室，山西 太原 030000

苯并[a]芘（benzo[a]pyrene，BaP）屬于典型的多環(huán)芳烴類物質(zhì)，廣泛存在于化石燃料燃燒，香煙煙霧及汽車尾氣中，是一種常見的環(huán)境致癌物，可通過呼吸道、消化道等途徑進入機體，引起呼吸系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，嚴重威脅人體健康［1］。研究表明BaP 具有較強的脂溶性，易透過胎盤屏障及血腦屏障，引起胎兒出生體重降低，兒童期智力下降及攻擊行為增加等問題［2-4］。此外，動物實驗研究也發(fā)現(xiàn)孕期暴露于BaP 可導致動物胚胎畸形，成年認知功能損傷或神經(jīng)行為缺陷等現(xiàn)象［5-7］。而目前關(guān)于外源化學物對孕期BaP 暴露所致胚胎神經(jīng)毒性的干預作用的研究鮮有報道。

近年來，隨著多哈理論（Developmental Origins of Health and Disease，DOHaD）即健康和疾病的發(fā)育起源的流行，越來越多的研究人員關(guān)注到孕期宮內(nèi)環(huán)境對胎兒生長及出生后長期發(fā)育的影響。目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，孕期暴露于BaP 可通過誘導神經(jīng)細胞過度氧化應激，線粒體損傷和神經(jīng)遞質(zhì)活性下降，細胞凋亡等途徑引起神經(jīng)細胞或突觸可塑性損傷，導致出生缺陷或出生后神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常［8-9］。Wnt/β-catenin是一條進化上保守的信號通路，對胚胎期和出生后個體生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用，具體地說，Wnt/β-catenin通路調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞的增殖、分化和遷移等關(guān)鍵過程，對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和動態(tài)平衡至關(guān)重要，它的失調(diào)與包括神經(jīng)退行性疾病在內(nèi)的各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)［10］。Marchetti等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，老年帕金森病患者大腦中的Wnt/β-catenin信號激活可以促進神經(jīng)再生，有助于恢復腦室下區(qū)微環(huán)境和增強神經(jīng)救援。

氯化鋰（lithium chloride，LiCl）是臨床上廣泛使用的情緒穩(wěn)定劑，已被證明具有神經(jīng)營養(yǎng)、促進神經(jīng)干細胞增殖和抑制神經(jīng)元凋亡的作用［12-13］。LiCl可抑制糖原合酶激酶-3β（glycogen synthasc kinase-3β，GSK-3β）的活性，主要通過GSK-3β 磷酸化失活，釋放其下游蛋白β-catenin，使其在細胞核內(nèi)蓄積，參與DNA 轉(zhuǎn)錄、翻譯，進而調(diào)節(jié)下游基因的表達，促進神經(jīng)元生長［14］。而目前，LiCl 對BaP 暴露所致的胚胎神經(jīng)毒性是否有改善作用未見報道。因此，本研究擬構(gòu)建孕期BaP 染毒模型，利用LiCl 進行干預，探討LiCl 對BaP 暴露所致胚胎神經(jīng)毒性的改善作用，為研究其具體作用機制提供實驗依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 主要試劑及器材

主要試劑：3，4-benzonpyrene（Sigma-Aldrich，美國），0.9%氯化鈉注射液（石家莊四藥有限公司，中國），LiCl（上海生工，中國），植物油（金龍魚公司，新加坡），蘇木素-伊紅試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、二抗-羊抗兔（博士德，中國），Anti-beta catenin、Anti-GSK-3β（Abcam，英國），Anti-pGSK-3β（Abclonal，中國）。主要儀器：-80℃超低溫冰箱（Thermo，美國），智能化組織脫水機、石蠟包埋機、全自動切片機（Leica，德國），超聲波震碎儀（新芝生物公司，中國），高速低溫離心機（Eppendorf，德國），酶標儀（Molecular Devices，美國），電泳儀、化學發(fā)光凝膠成像儀（Bio-Rad，美國）。

1.2 動物染毒及處理

8 周齡SPF 級SD 大鼠［山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（晉）2019-0004］，飼養(yǎng)于自然節(jié)律采光、環(huán)境溫度（25±1）℃、濕度50%～60%的清潔級環(huán)境中，期間自由飲水和進食。適應性飼養(yǎng)2周后，雌雄（1∶1）于18:00合籠，次日8:00觀察到陰栓視為合籠成功，記為妊娠第0 天（GD0 ），35只雌鼠連續(xù)合籠兩晚，共合籠成功32只，受孕率為91.4%，從中隨機選取30只孕鼠分為5 組，每組6只，分別為對照組（Control）、LiCl組（40 mg·kg-1LiCl）［15］、植物油組（soybean oil）、BaP 組（20 mg·kg-1BaP）和LiCl 干預組（20 mg·kg-1BaP+40 mg·kg-1LiCl）。LiCl 溶于生理鹽水，BaP 溶于植物油，GD8 開始染毒，每天1 次，連續(xù)7 d，以每100 g 體重0.5 mL 體積灌胃的方式給藥。LiCl干預處理于BaP 染毒前2 h 給藥，對照組和植物油組給予相同體積的生理鹽水或植物油。本項實驗研究通過山西醫(yī)科大學動物福利和倫理委員會審查（批準號：2020GLL042）并嚴格遵循相關(guān)規(guī)定。

觀察孕鼠染毒期間的一般狀態(tài)、外觀體征、行為活動及攝食情況，記錄其體重變化。GD14染毒結(jié)束后繼續(xù)飼養(yǎng)，GD18 時對孕鼠麻醉，剖腹取出子宮連胚胎，測量并記錄胎鼠總數(shù)、體重、身長和尾長，組織保存于-80℃。

1.3 HE染色

取出胚胎后，冰上快速剝離大腦，4%多聚甲醛固定24 h后，脫水，石蠟包埋，冠狀切片厚度為5 μm；二甲苯常規(guī)脫蠟；梯度乙醇水化；37℃蘇木素染色5 min；1%的鹽酸酒精分化3 s；37℃伊紅染液染色20 s；沖洗、脫水、透明、封片；光學顯微鏡觀察并采圖。

1.4 Western blotting檢測

取出胚胎后，冰上快速剝離海馬，加入適量RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑，超聲30 s，冰上靜止15 min，低溫離心取上清，BCA 法進行蛋白定量，調(diào)整蛋白濃度到同一水平，4℃孵育一抗過夜（Anti-beta catenin，1∶5 000；Anti-GSK-3β，1∶1 000；Anti-pGSK-3β，1∶2 000），TBST 洗3 次，4℃孵育二抗（1∶5 000）45 min，TBST 洗3 次，Bio-Rad 顯影儀顯影，Image J 1.46 分析蛋白灰度值。

1.5 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 7軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，服從正態(tài)分布且滿足方差齊性時，多組間比較用單因素方差分析，多個均數(shù)之間兩兩比較采用Turkey’s 檢驗；孕鼠體重變化采用重復測量方差分析，多個均數(shù)之間兩兩比較采用q檢驗。雙側(cè)檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 孕鼠的一般情況及體重變化

染毒期間，各組孕鼠狀態(tài)良好，外觀未見明顯異常，被毛光澤。孕鼠體重采用重復測量方差分析，結(jié)果如圖1所示，各組間孕鼠體重增長不全相同（F時間=92.25，P＜0.001；F組間=3.933，P=0.005；F交互=0.477，P=0.924）。GD14 和GD18，組間主效應顯示，植物油組和LiCl組孕鼠體重增長與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；BaP組孕鼠體重［（323.34±5.71）g、（364.34±10.41）g］均較對照組［（339.17±7.10）g、（390.32±11.35）g］減少，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.026，P=0.045）；LiCl 干預組孕鼠體重［（345.05±7.72）g、（398.73±12.32）g］較BaP 組增加，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.034，P=0.029）。

圖1 BaP 暴露對孕鼠體重增長的影響（n=6）Figure 1 Body weight of pregnant rats after BaP exposure (n=6)

2.2 胎鼠發(fā)育情況

表1為GD18胎鼠發(fā)育指標測量結(jié)果。結(jié)果顯示，5組間胎鼠體重、身長、尾長不全相同，單因素方差分析差異均有統(tǒng)計學意義（F體重=17.60，P＜0.001；F身長=8.04，P＜0.001；F尾長=3.38，P=0.024）；兩兩比較，LiCl組和植物油組GD18 胎鼠體重、身長、尾長均與對照組差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），BaP 組胎鼠體重、身長、尾長均下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，P=0.008，P=0.024），LiCl 干預組胎鼠體重、身長、尾長較BaP 組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，P＜0.001，P=0.022）。

表1 BaP暴露對GD18胎鼠發(fā)育指標的影響（±s）Table 1 Development indexes of GD18 fetal rats after BaP exposure (±s)

表1 BaP暴露對GD18胎鼠發(fā)育指標的影響（±s）Table 1 Development indexes of GD18 fetal rats after BaP exposure (±s)

［注］與對照組相比，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001；與BaP組相比，# ：P＜0.05，###：P＜0.001。［Note］Compared with the control group,*:P＜0.05,**:P＜0.01,***:P＜0.001;Compared with the BaP group,#:P＜0.05,###:P＜0.001.

組別Group胎鼠數(shù)Number of fetal rats體重/g Weight/g身長/cm Body length/cm尾長/cm Tail length/cm對照組（Control） 90 2.563±0.091 3.284±0.078 1.276±0.041 LiCl 組（LiCl ） 80 2.678±0.078 3.340±0.086 1.261±0.163植物油組（Soybean oil） 80 2.648±0.100 3.281±0.133 1.240±0.090 BaP組（BaP） 81 2.325±0.061*** 3.072±0.077** 1.135±0.068*LiCl 干預組LiCl intervention 83 2.669±0.096### 3.356±0.107### 1.206±0.041#― 17.60 8.04 3.38 P―＜0.001＜0.001 0.024 F

2.3 胎鼠海馬組織的形態(tài)學改變

光鏡下觀察，GD18 胎鼠海馬組織HE 染色結(jié)果如圖2所示，對照組、LiCl 組和植物油組海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）區(qū)神經(jīng)元細胞排列整齊，形態(tài)正常。BaP 暴露組出現(xiàn)不同程度神經(jīng)元胞體縮小，核固縮，細胞染色加深，胞核胞質(zhì)分界不清，數(shù)量減少，而LiCl 干預組上述情況有所減輕。

圖2 BaP暴露對GD18胎鼠海馬神經(jīng)元病理學形態(tài)的影響（HE染色）Figure 2 Morphology of neurons in hippocampus of GD18 fetal rats after BaP exposure (HE staining)

2.4 胎鼠海馬組織pGSK-3β、GSK-3β 及β-catenin表達水平

與對照組相比，BaP 暴露致pGSK-3β 表達水平降低（對照組和BaP 組的灰度值比值分別為0.87±0.04、0.50±0.04，F(xiàn)=19.64，P＜0.001），GSK-3β表達升高（對照組和BaP組的灰度值比值分別為1.53±0.14、2.09±0.11，F(xiàn)=5.90，P=0.011），β-catenin 表達降低（對照組和BaP組的灰度值比值分別為1.41±0.14、0.90±0.04，F(xiàn)=11.16，P=0.001）；LiCl干預可明顯逆轉(zhuǎn)由BaP暴露引起的pGSK-3β 表達降低、GSK-3β 表達升高及β-catenin表達降低的現(xiàn)象（其灰度值比值分別為：pGSK-3β，0.69±0.08，P=0.036；GSK-3β，1.59±0.15，P=0.042；β-catenin，1.33±0.08，P=0.006）。LiCl 組和植物油組的pGSK-3β、GSK-3β 及β-catenin 表達水平與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義。見圖3。

圖3 BaP暴露后GD18 胎鼠海馬組織β-catenin、pGSK-3β及GSK-3β 表達水平（n=6）Figure 3 Expressions of β-catenin,pGSK-3β,and GSK-3β protein in hippocampus of GD18 fetal rats after exposure to BaP (n=6)

3 討論

日常生活中，人們可以接觸到的多環(huán)芳烴類物質(zhì)多種多樣，主要來源于有機物的不完全燃燒，如汽車尾氣、主/被動吸煙、熏烤食物等［16］。BaP 作為典型的多環(huán)芳烴類物質(zhì)，其致癌性、致畸性和神經(jīng)毒性眾所周知［17-18］。由于BaP 具有較強的脂溶性，易透過胎盤屏障進入胎兒血液中，隨血液循環(huán)系統(tǒng)透過血腦屏障，影響胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育［19-20］。而目前關(guān)于外源化合物對BaP 孕期暴露所致胚胎毒性的干預作用的研究較少，尋找其預防藥物成為國內(nèi)外關(guān)注熱點。LiCl 是臨床上廣泛應用的情緒穩(wěn)定劑，在神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)元的保護及神經(jīng)干細胞增殖分化上具有很好的療效［14］。以往有研究表明雙向情感障礙患者過量或長期的鋰治療可能會存在鋰中毒的風險［21］，而細胞實驗發(fā)現(xiàn)LiCl 對大鼠胚胎中腦神經(jīng)細胞僅具有細胞毒性，而非致畸物［22］，在動物實驗中，一定劑量的LiCl 對神經(jīng)退行性疾病具有改善作用［23］。本研究選取了未對機體產(chǎn)生毒性作用的LiCl 劑量進行干預，探討其對孕期BaP暴露引起的胚胎毒性的保護作用及分子調(diào)控機制。

本研究發(fā)現(xiàn)，染毒結(jié)束后GD14 和GD18，BaP 組孕鼠體重增長明顯下降，表明BaP 暴露能夠引起胚胎宮內(nèi)發(fā)育遲緩，GD18 時BaP 組胎兒體重、身長及尾長較對照組減小，證實BaP 暴露能夠通過慢性毒性蓄積過程對胚胎后期生長發(fā)育產(chǎn)生持續(xù)影響。劉維春等［24］在大鼠孕期皮下注射尼古丁GD21 取出胎鼠，其身長和尾長均較對照組減小；倫宗姬等［25］的實驗設計了大鼠孕前吸入香煙煙霧3 個月，GD20 麻醉取出胎鼠，發(fā)現(xiàn)胎鼠體重、身長、尾長也均較對照組降低。本研究中LiCl 干預能夠明顯改善BaP 暴露引起的宮內(nèi)發(fā)育遲緩和胎鼠生長受限，說明LiCl 能夠緩解BaP 暴露導致的胚胎發(fā)育遲緩。

腦組織神經(jīng)元的正常生長是胚胎神經(jīng)發(fā)育的基礎(chǔ)。梁婧等［26］于孕前15 d經(jīng)口給予大鼠BaP（2 mg·kg-1·d-1），GD9 時取出胚胎觀察胚胎形態(tài)，發(fā)現(xiàn)胚胎內(nèi)細胞出現(xiàn)異常凋亡結(jié)構(gòu)等胚胎損傷。本實驗利用HE 染色技術(shù)對海馬組織神經(jīng)元細胞形態(tài)進行觀察，BaP 組胎鼠海馬組織神經(jīng)元細胞呈現(xiàn)部分胞體縮小，核固縮，細胞染色加深，胞核胞質(zhì)分界不清，LiCl 干預能明顯減少海馬組織神經(jīng)元固縮，表明孕期BaP 暴露可能導致胚胎神經(jīng)元細胞損傷，而LiCl 干預能發(fā)揮一定的保護作用。

研究表明LiCl 能夠通過抑制GSK-3β 的活性，進而調(diào)控神經(jīng)干細胞增殖、分化和遷移，增加DG區(qū)新生神經(jīng)元數(shù)量［27-28］。為了闡明LiCl 改善BaP 暴露導致胚胎神經(jīng)毒性的分子調(diào)控過程，本實驗檢測了GD18 胎鼠海馬組織中pGSK-3β、GSK-3β 和β-catenin 的蛋白表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，LiCl 組pGSK-3β、GSK-3β 及β-catenin 表達水平差異無統(tǒng)計學意義，LiCl 干預組較BaP 組pGSK-3β 蛋白表達升高，GSK-3β 蛋白表達降低及β-catenin 蛋白表達升高，提示40 mg·kg-1LiCl 單獨作用對GSK-3β 的磷酸化作用不大，但其與BaP 聯(lián)合作用時，可顯著改善BaP 所致的pGSK-3β 表達下降。苗利萍等［29］在LiCl 對異氟醚誘導發(fā)育期幼鼠海馬毒性的研究中也發(fā)現(xiàn)單獨LiCl 干預對GSK-3β 的磷酸化作用不大，但其可改善異氟醚誘導的幼鼠海馬毒性作用。以上結(jié)果提示LiCl 可通過調(diào)控GSK-3β/β-catenin 蛋白水平改善BaP 暴露所致胚胎毒性及海馬組織神經(jīng)元損傷。本研究通過構(gòu)建大鼠孕期BaP 暴露模型，探討氯化鋰對BaP 所致的胚胎神經(jīng)毒性的改善作用。結(jié)果表明，孕期BaP 暴露能夠引起胚胎生長發(fā)育遲緩及海馬神經(jīng)元病理學改變，LiCl 對上述形態(tài)學損傷有一定改善作用，其機制可能與LiCl 抑制GSK-3β 活性進而提高β-catenin 的表達相關(guān)。值得深思的是，作為GSK的抑制劑，本研究并沒有發(fā)現(xiàn)單獨LiCl 作用能夠引起pGSK-3β 表達的升高，這也正是我們需要進一步通過不同干預劑量孕鼠給藥或者胎鼠直接給藥，從而進行機制方面的深入研究和探討的關(guān)鍵所在，以期為尋求適宜的LiCl 作用劑量提供科學依據(jù)。