腸道菌群失調(diào)對甲基汞染毒小鼠組織汞及糞汞含量的影響

黃紅茜，李鳳敏，張愛華，b，韓雪

貴州醫(yī)科大學(xué) a.公共衛(wèi)生學(xué)院 b.環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025

甲基汞是汞的甲基化產(chǎn)物，是一種具有神經(jīng)毒性的環(huán)境污染物。環(huán)境中任何形式的汞（金屬汞、無機(jī)汞等）均可在一定條件下轉(zhuǎn)化為甲基汞，并在動植物體內(nèi)蓄積［1］，攝入含甲基汞的食物是普通人群甲基汞暴露的主要途徑［2-3］。甲基汞主要經(jīng)由腸道吸收，約超過90%的甲基汞經(jīng)腸道吸收后分布于全身各處［4］。

人體腸道中存在600多種、約1013～1014個微生物，從輔助消化食物、提供特定營養(yǎng)物質(zhì)，到占據(jù)消化道表層、抵御病原體入侵，再到參與對免疫系統(tǒng)的訓(xùn)練等，腸道菌群在調(diào)節(jié)和維持正常的身體機(jī)能方面有著不可或缺的作用［5-6］。已有研究證實，腸道菌群是調(diào)節(jié)外源化學(xué)物（如藥物、重金屬等）生物利用度和毒性的重要因子［7-8］。

甲基汞主要經(jīng)口暴露，在人體內(nèi)需經(jīng)過廣泛的肝腸循環(huán)過程，其半衰期約為70 d，因此甲基汞與腸道菌群之間有著“親密而持久”的接觸，但腸道微生物在甲基汞轉(zhuǎn)運轉(zhuǎn)化中的具體作用及機(jī)制尚未明晰。本研究通過構(gòu)建抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂動物模型，探討腸道微生物在甲基汞吸收、分布、排泄中的作用，為甲基汞中毒的防治研究提供思路和資料。

1 對象與方法

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑：萬古霉素、硫酸新霉素、甲硝唑、氨芐青霉素（上海源葉，中國），糞便DNA 提取試劑盒（QIAGEN，德國），TRIzol 試劑（Invitrogen，美國），甲基氯化汞（Sigma，美國），熒光標(biāo)記的右旋糖酐（Sigma，美國）。

主要儀器：3020-426 多功能全波長酶標(biāo)儀（Thermo，美國），實時熒光定量PCR 儀（Eppendorf，美國），PHSJ-4F 精密pH 計（上海精科儀器廠，中國），AFS-8520 原子熒光光度計（北京海光儀器有限公司，中國），高壓密閉消解罐 （東臺市中凱亞科技有限公司，中國）。

1.2 實驗動物和暴露方法

1.2.1 實驗動物及分組20 只7 周齡SPF 級健康雌性BALB/c 小鼠購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司［合格證號：SCXK（遼）2015-0001］，飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心，12 h 亮/暗循環(huán)，自由攝水?dāng)z食，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后將小鼠隨機(jī)分為4 組（每組5 只）：空白組、菌群失調(diào)組（單獨抗生素干預(yù)組）、甲基汞組、菌群失調(diào)+甲基汞組。本動物實驗遵循貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會規(guī)定（編號：No.1900249）。

1.2.2 腸道菌群紊亂模型構(gòu)建及甲基汞染毒方案參照文獻(xiàn)［9-10］，使用四聯(lián)抗生素構(gòu)建腸道菌群紊亂模型，四聯(lián)抗生素混合液含萬古霉素100 mg·kg-1（以體重計，后同）、硫酸新霉素200 mg·kg-1、甲硝唑200 mg·kg-1、氨芐青霉素200 mg·kg-1。BALB/c 小鼠經(jīng)四聯(lián)抗生素混合液處理4 d，1 次·d-1，灌胃量10 mL·kg-1?？股亟o藥完畢后無菌收集小鼠糞便，提取糞便微生物DNA，通過PCR 驗證細(xì)菌16S rRNA 的V4 區(qū)基因水平［11］，設(shè)空白管為陰性對照。根據(jù)細(xì)菌16S rRNA 的V4 區(qū)基因水平判斷建模是否成功，抗生素干擾后小鼠糞便DNA無法擴(kuò)增出信號，則可表明大多數(shù)腸道細(xì)菌已被清除，菌群紊亂模型建立成功，造模成功后給予甲基汞染毒3 d（0.5 mg·kg-1，1 次·d-1，灌胃量10 mL·kg-1）。

1.3 主要實驗指標(biāo)

1.3.1 體重與臟器系數(shù)稱量并記錄小鼠染毒前及終末期體重。終末取血結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠并立即進(jìn)行解剖，稱量小鼠肝臟、腎臟、腦及整段盲腸，計算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=臟器濕重（mg）/總體重（g）。

1.3.2 汞含量檢測甲基汞組和菌群失調(diào)+甲基汞組進(jìn)行甲基汞染毒3 d，每天固定時間點灌胃。第一次甲基汞染毒后24、48、72 h 收集各組糞便，檢測糞便總汞含量；染毒結(jié)束采用5%水合氯醛麻醉小鼠，眼球取血，處死小鼠后收集肝臟、腎臟、腦、盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物樣本，液氮瓶中速凍，-80℃冰箱冷凍保存。參考GB 5009.17―2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總汞及有機(jī)汞的測定》中總汞的測定方法，采用壓力罐消解對樣本進(jìn)行預(yù)處理，原子熒光光譜分析法檢測糞便、血液、肝臟、腎臟及腦組織中總汞含量。方法檢出限為0.003 mg·kg-1，加標(biāo)回收率為83%～117%。

1.3.3 盲腸、結(jié)腸內(nèi)容物pH 的檢測實驗結(jié)束，處死小鼠后收集小鼠盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物，稱取盲腸內(nèi)容物60 mg，按1 mg 盲腸內(nèi)容物添加7 μL 預(yù)冷的去離子水配置混合液，利用組織研磨儀勻漿（45 Hz，150 s），在4°C、3 500×g的條件下離心10 min，取上清于新的EP管中，重復(fù)提取一次，將兩次提取液合并后用pH計檢測pH值。

1.3.4 腸組織病理形態(tài)學(xué)觀察體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛固定回腸組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋，組織切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，HE染色），光學(xué)顯微鏡下觀察腸組織病理學(xué)變化。

1.3.5 腸道緊密連接蛋白mRNA 水平檢測提取腸組織RNA鑒定其純度及完整性，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）檢測腸道緊密連接蛋白Zo-1、Claudin-1、Occludin基因mRNA 的水平。引物序列見表1。

表1 腸道緊密連接蛋白基因RT-PCR反應(yīng)引物Table 1 Primers for RT-PCR of intestinal tight junction protein genes

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD或Games-Howell檢驗法?？偣勘容^用獨立樣本t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 腸道菌群失調(diào)模型造模結(jié)果

空白組和甲基汞組都未給予抗生素處理，默認(rèn)空白組和甲基汞組腸道菌群的狀態(tài)一致，因此，選擇空白組為對照。如圖1，空白組小鼠糞便微生物DNA 含量為（51.07±31.65）μg·g-1，抗生素處理小鼠糞便未檢測到明顯DNA 含量。紫外光下細(xì)菌16S rRNA 通用引物PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，空白組小鼠具有良好的16S rRNA基因信號，抗生素處理的小鼠未檢測到明顯信號，表明抗生素處理清除了小鼠腸道內(nèi)的細(xì)菌，即腸道菌群失調(diào)建模成功。

圖1 小鼠16s rRNA V4通用引物PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Figure1 The gel electrophoresis diagram of the PCR product of 16s rRNA V4 of mice using universal primers

2.2 臟器系數(shù)

各組小鼠肝臟、盲腸臟器系數(shù)的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F肝=9.901，P=0.001；F盲腸=14.529，P＜0.001），腦及腎臟臟器系數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與空白組相比，菌群失調(diào)組肝臟臟器系數(shù)下降（P＜0.05），盲腸臟器系數(shù)升高（P＜0.05）；與甲基汞組相比，菌群失調(diào)+甲基汞組肝臟臟器系數(shù)下降（P＜0.05），盲腸臟器系數(shù)升高（P＜0.05）。見表2。

表2 小鼠腦、肝、腎、盲腸的臟器系數(shù)（mg·g-1，±s，n=5）Table 2 Organ coefficients of brain,liver,kidney,and cecum of mice(mg·g-1,±s,n=5）

［注］a：與空白組比較，P＜0.05；b：與甲基汞組比較，P＜0.05。

盲腸臟器系數(shù)空白組 21.64±0.83 44.15±2.85 11.28±0.98 16.03±5.57甲基汞組 22.35±0.26 45.62±3.09 11.28±0.80 15.04±4.45菌群失調(diào)組 22.90±0.25 39.29±0.95a 11.12±0.86 33.31±8.21a菌群失調(diào)+甲基汞組 23.25±2.77 39.09±2.03b 11.67±0.54 32.78±4.76b分組 腦臟器系數(shù)肝臟臟器系數(shù)腎臟臟器系數(shù)

2.3 血及糞便總汞含量

隨著甲基汞的暴露時間延長，小鼠糞汞的排泄量增加。第一次甲基汞暴露后24、48、72 h，甲基汞組的糞汞含量分別為（259.87±90.94）、（616.83±197.90）、（1 322.50±377.77）ng·g-1；菌群失調(diào)+甲基汞組分別為（90.39±27.56）、（366.75±81.82）、（641.33±354.24）ng·g-1。與甲基汞組相比，菌群失調(diào)+甲基汞組小鼠糞便總汞含量降低（t24h=3.650，P=0.011；t48h=2.828，P=0.022；t72h=3.015，P=0.024）。菌群失調(diào)+甲基汞組與甲基汞組血汞含量分別為（40 290.00±5 515.11）、（28 392.00±5 813.25）ng·g-1，血汞含量升高（t=-2.623，P=0.031）；空白組及菌群失調(diào)組總汞含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，詳見圖2。

圖2 甲基汞暴露期間小鼠糞便總汞（A）和血液總汞（B）含量（n=5）Figure 2 Total mercury level in feces (A) and blood (B) of mice during methylmercury exposure (n=5)

2.4 肝、腎、腦總汞含量

甲基汞組肝、腎、腦總汞含量分別為（2752.86±566.09）、（4 502.08±105.76）、（827.54±106.50）ng·g-1，菌群失調(diào)+甲基汞組分別為（4 090.38±929.44）、（8 539.97±1 242.64）、（1 348.24±336.69）ng·g-1。與甲基汞組相比，菌群失調(diào)+甲基汞組小鼠肝、腎、腦總汞含量均升高（t肝=-2.748，P=0.025；t腎=-6.476，P=0.001；t腦=-3.297，P=0.011）?？瞻捉M及菌群失調(diào)組總汞含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物pH

各組小鼠盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物pH 值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F盲腸=11.295，P＜0.001，F(xiàn)結(jié)腸=54.081，P＜0.001）。與空白組相比，菌群失調(diào)組盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物pH值升高（均P＜0.05）；與甲基汞組相比，菌群失調(diào)+甲基汞組盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物pH值升高（均P＜0.05）。見表3。

表3 小鼠盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物pH值（±s，n=5）Table 3 pH values of cecum and colon of mice (±s,n=5)

表3 小鼠盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物pH值（±s，n=5）Table 3 pH values of cecum and colon of mice (±s,n=5)

［注］a：與空白組比較，P＜0.05；b：與甲基汞組比較，P＜0.05。

分組 盲腸 結(jié)腸空白組 7.98±0.06 7.49±0.10甲基汞組 7.94±0.14 7.47±0.06菌群失調(diào)組 8.24±0.04a 7.95±0.07a菌群失調(diào)+甲基汞組 8.08±0.11bb 8.11±0.13b

2.6 腸組織病理形態(tài)學(xué)觀察

如圖3所示，空白組回腸組織結(jié)構(gòu)完整，腸絨毛較長且較為整齊，腸絨毛被覆單層柱狀上皮，黏膜下層、肌層和外膜連接緊密，未見明顯病理變化；菌群失調(diào)組腸絨毛壞死溶解，上皮細(xì)胞脫落，固有層輕微水腫等改變。

圖3 各組小鼠腸組織病理學(xué)變化（HE染色）Figure 3 Pathological changes of intestine of mice in each group (HE staining)

2.7 腸道緊密連接蛋白mRNA的表達(dá)

各組小鼠腸組織腸道緊密連接蛋白mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（FOccludin=8.855，P=0.006；FZo-1=7.748，P=0.009；FClaudin-1=13.753，P=0.002）。與空白組相比，菌群失調(diào)組腸組織Occludin、Zo-1、Claudin-1mRNA 表達(dá)水平下降（均P＜0.05）；與甲基汞組相比，菌群失調(diào)+甲基汞組腸組織Occludin、Zo-1、Claudin-1mRNA表達(dá)水平下降（均P＜0.05）。見圖4。

圖4 小鼠Claudin-1（A）、Occludin（B）和Zo-1（C） mRNA表達(dá)水平Figure 4 The expression levels of Claudin-1 (A),Occludin (B),and Zo-1 (C) mRNA of mice

3 討論

作為接觸外源化學(xué)物的第一批“細(xì)胞”，腸道某些益生菌可與外源化學(xué)物螯合使其隨著菌株通過糞便排泄，或?qū)⑼庠椿瘜W(xué)物進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化，改變其溶解性進(jìn)而將其清除。甲基汞向無機(jī)汞的生物轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是甲基汞消除的必要中間步驟，來自甲基汞的“汞”轉(zhuǎn)化為不易吸收的無機(jī)汞后主要經(jīng)糞便排泄。Caito等［12］觀察到人類在服用抗生素后，體內(nèi)甲基汞的消除速度明顯降低。Bisanz 等［13］則發(fā)現(xiàn)與對照組相比，每天食用益生菌（即酸奶）的坦桑尼亞孕婦血汞濃度顯著降低。Jadán-Piedra 等［10］的研究也發(fā)現(xiàn)益生菌即嗜酸乳桿菌BL17 和干酪乳桿菌BL23 可促進(jìn)甲基汞暴露小鼠糞汞的排出，減少體內(nèi)汞水平。與以往研究相似，在本研究中，相對于正常小鼠，菌群紊亂小鼠體內(nèi)血、肝、腎、腦組織的汞含量升高，而排出的糞汞含量降低，提示腸道菌群可能是甲基汞代謝和汞循環(huán)的重要參與者。

腸黏膜屏障由腸道上皮細(xì)胞連接復(fù)合體及其分泌物、腸相關(guān)免疫細(xì)胞及腸內(nèi)正常菌群組成，主要包括生物屏障、化學(xué)屏障、機(jī)械屏障和免疫屏障。腸黏膜屏障作為控制有毒化學(xué)物進(jìn)入機(jī)體的第一道防線，能限制腸腔內(nèi)有害物質(zhì)如毒素或細(xì)菌穿過腸黏膜進(jìn)入血液循環(huán)和體內(nèi)其他組織器官，其完整性依賴于微生物與宿主的相互作用。腸道微生物可通過影響腸道上皮通透性和緊密連接，調(diào)控腸道上皮細(xì)胞凋亡等多種作用影響腸道機(jī)械屏障。體外研究結(jié)果顯示，腸道菌群可通過改善腸道機(jī)械屏障功能阻止腸上皮細(xì)胞對糞便中濃縮甲基汞的再吸收［14］。緊密連接蛋白Zo-1、Occludin表達(dá)量及分布的變化可以代表腸屏障功能的變化［15］。本研究發(fā)現(xiàn)相對于空白組，菌群紊亂小鼠的腸道出現(xiàn)了腸絨毛壞死溶解、上皮細(xì)胞脫落等病理改變；同時，菌群紊亂小鼠的緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin、Zo-1mRNA表達(dá)水平下降，提示腸黏膜機(jī)械屏障可能受損，通過增加腸道通透性可使甲基汞更易通過腸屏障或直接從腸細(xì)胞間滲漏，增加甲基汞的吸收。

腸道微生物除構(gòu)成腸道的生物屏障外，還可通過促進(jìn)黏液的分泌和產(chǎn)生特殊代謝產(chǎn)物影響腸內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)腸道化學(xué)屏障［16］。腸道菌群產(chǎn)生的水解酶催化底物生成的有機(jī)酸及短鏈脂肪酸可降低腸腔pH 值，而腸道pH 值則可影響金屬離子的溶解性和細(xì)胞表面基團(tuán)的電離狀態(tài)，進(jìn)而干擾其轉(zhuǎn)運。本研究發(fā)現(xiàn)菌群紊亂小鼠盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物pH值高于空白組，提示腸道菌群通過參與維持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)影響甲基汞的吸收。

盲腸是汞吸收的主要部位之一，本研究發(fā)現(xiàn)菌群紊亂小鼠盲腸的重量大約是空白組的兩倍。已有研究發(fā)現(xiàn)，無菌鼠的盲腸比普通鼠大5～7 倍［17］，因此推測盲腸的重量及體積受到腸道微生物的影響。盲腸內(nèi)容物的增多、變稀可使小鼠腸動力下降［18］，使腸內(nèi)容物在盲腸內(nèi)的停留時間延長，從而增加小鼠體內(nèi)甲基汞的吸收，這也是本研究觀察到血汞及組織汞濃度增加的可能原因之一。

本研究結(jié)果表明，腸道菌群直接參與或間接影響著甲基汞的吸收、分布與排泄，腸道菌群紊亂可促進(jìn)甲基汞的吸收，減少其排泄，增加其在組織中的分布。腸道菌群是一個復(fù)雜而龐大的系統(tǒng)，不同的菌群在物質(zhì)轉(zhuǎn)運轉(zhuǎn)化中扮演著不同的角色，因此，腸道菌群在甲基汞體內(nèi)動力學(xué)過程中的具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究與探索。