替普瑞酮對亞慢性苯并［a］芘染毒大鼠神經(jīng)行為改變的保護作用

李玲，常珊珊，呂懿，蔣勇，王慧，鄭金平，2

1.山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)教研室，山西 太原 030001

2.長治醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)系，山西 長治 046000

苯并［a］芘（benzo［a］pyrene，BaP）是最常見的環(huán)境和職業(yè)污染物之一，其在體內(nèi)的活化代謝產(chǎn)物不僅具有致癌性，對生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)也具有一定毒性。由于BaP 的親脂性，其易在神經(jīng)組織集聚，可引起神經(jīng)毒作用［1］。BaP 的暴露可引起人神經(jīng)系統(tǒng)異常如認知功能障礙、學(xué)習(xí)困難、副交感神經(jīng)失調(diào)和短期記憶喪失，以及大鼠學(xué)習(xí)記憶能力損傷和行為改變［2-3］。本課題組前期流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果也顯示，BaP 職業(yè)暴露人群焦?fàn)t工人的神經(jīng)行為發(fā)生改變，主要表現(xiàn)在短期和空間學(xué)習(xí)記憶能力降低，與BaP 接觸水平之間存在劑量-效應(yīng)關(guān)系［4］。

替普瑞酮是一種萜烯類化合物，作為胃黏膜保護藥，臨床上主要用于治療胃潰瘍、急慢性胃炎。有研究顯示替普瑞酮可限制脊髓損傷后繼發(fā)性損傷、神經(jīng)元死亡以及進行性壞死和空化，具有神經(jīng)保護作用，是熱休克蛋白和其他神經(jīng)保護蛋白的誘導(dǎo)劑［5］，但其是否可以防治BaP 誘發(fā)的神經(jīng)毒作用尚不清楚。本研究旨在觀察替普瑞酮對亞慢性BaP 染毒大鼠神經(jīng)行為的影響，探討其防治BaP神經(jīng)毒作用的可行性。

1 對象與方法

1.1 試劑及儀器

橄欖油（中國成都科龍化工試劑廠），替普瑞酮（中國信陽萊耀生物科技有限公司），BaP（美國Sigma-Aldrich），Morris 水迷宮（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所），Annexin V-FITC/PI 試劑盒（中國南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），BCA 試劑盒（中國武漢博士德生物工程有限公司），PVDF 膜、鼠抗熱休克蛋白70（heat shock protein，Hsp70）單克隆抗體、GAPDH 抗體及羊抗鼠二抗（美國Epitomics）。

1.2 實驗動物與分組

選擇健康清潔級SD 雄性大鼠40 只，體重為180～200 g，活動能力相近，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（JIN）2015-0001。本實驗遵循動物實驗等有關(guān)規(guī)定，通過山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會的審批（編號：DW2020051）。將大鼠飼養(yǎng)在自然節(jié)律采光（采光約11 h，黑暗約13 h），溫度為18～23℃，相對濕度為40%～60%，清潔安靜的環(huán)境中。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機分為橄欖油溶劑對照組、替普瑞酮組、BaP染毒組和替普瑞酮+BaP染毒組，每組10只。每周稱1次大鼠體重，按800 mg·kg-1體重劑量灌胃替普瑞酮，腹腔注射6.25 mg·kg-1BaP，實驗中替普瑞酮及BaP 均由橄欖油溶解，隔日染毒，連續(xù)染毒90 d。

1.3 實驗方法

1.3.1 學(xué)習(xí)記憶能力檢測采用Morris 水迷宮法檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，水迷宮實驗分為定位航行實驗（實驗前4 d）和空間探索實驗（實驗第5 d），實驗具體操作參照文獻［6］。

1.3.2 海馬組織病理學(xué)檢查大鼠經(jīng)水迷宮行為訓(xùn)練結(jié)束后，斷頭處死，迅速分離雙側(cè)海馬，用10%中性福爾馬林溶液固定24 h后，常規(guī)脫水，透明，浸蠟，包埋制作石蠟切片（切片厚5 μm），貼附于多聚賴氨酸預(yù)處理過的載玻片上，常規(guī)HE 染色，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織的病理學(xué)變化。

1.3.3 TUNEL 法檢測大鼠海馬細胞凋亡大鼠經(jīng)水迷宮行為訓(xùn)練結(jié)束后，斷頭處死，迅速分離雙側(cè)海馬，石蠟切片按常規(guī)方法脫蠟至水，PBS 漂洗3 遍（每次5 min）；加入蛋白酶K工作液37℃反應(yīng)30 min左右，PBS漂洗3遍（每次5 min）；4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗3遍（每次5 min）；浸入封閉液中封閉10 min，PBS漂洗3遍（每次5 min），進行標(biāo)記反應(yīng)。

1.3.4 Annexin V-FITC/PI法檢測大鼠海馬細胞凋亡率取大鼠海馬組織剪碎、過濾后，用預(yù)冷PBS 洗兩遍，加入不含EDTA 的胰酶消化，消化后加入預(yù)冷PBS重懸，1 000 r·min-1離心5 min（離心半徑13.5 cm），棄上清，收集細胞，預(yù)冷PBS 重懸細胞并計數(shù)。取1×105～5×105個重懸細胞，1 000 r·min-1離心5 min（離心半徑13.5 cm），棄上清，加入500 μL結(jié)合液輕輕重懸細胞。加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻后，加入5 μL碘化丙啶，輕輕混勻。室溫避光孵育10 min 后采用流式細胞儀進行檢測。

1.3.5 Western blotting 法檢測Hsp70 蛋白表達水平海馬組織提取蛋白后，用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，預(yù)冷PBS 將各組蛋白調(diào)至同一濃度，加入5×上樣緩沖液，95℃加熱20 min，1 000 r·min-1離心5 min（離心半徑13.5 cm），取上清，即得海馬組織提取蛋白。制膠（7.5%分離膠）、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜（PVDF 膜）后，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入鼠抗Hsp70 單克隆抗體（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000），4℃搖床過夜?；厥找豢?，洗膜液洗膜3 次，加入羊抗鼠二抗孵育1 h，洗膜3 次后顯影。結(jié)果用圖像處理掃描儀掃描膠片，采用捷達801 系列凝膠電泳圖像分析軟件對蛋白電泳帶的密度進行半定量分析，以Hsp70/GAPDH值表示蛋白的表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用±s表示，多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。Morris 水迷宮測試結(jié)果，經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 動物基本情況

大鼠給藥后，替普瑞酮組與對照組大鼠均無明顯行為異常改變；BaP染毒組出現(xiàn)煩躁易驚、活動減少、進食減少、昏睡、眼屎增多；替普瑞酮+BaP 染毒組僅表現(xiàn)為活動減少，無其他明顯異常行為改變。

2.2 動物染毒過程中體重變化情況

各處理組大鼠實驗前對照組、替普瑞酮組、BaP 染毒組和替普瑞酮+BaP 染毒組體重分別為（188.00±4.63）、（186.14±3.42）、（183.20±9.60）、（184.16±6.26）g，各處理組體重差別無統(tǒng)計學(xué)意義。染毒結(jié)束后對照組、替普瑞酮組、BaP 染毒組和替普瑞酮+BaP 染毒組體重分別為（335.71±25.90）、（333.19±27.36）、（283.42±33.95）、（311.10± 22.38）g，替普瑞酮+BaP 染毒組體重增長大于BaP 染毒組（P＜0.05）。

2.3 大鼠Morris水迷宮結(jié)果

如表1、2 顯示，BaP 染毒組第1～4 天尋找平臺的逃避潛伏期時間及尋找平臺總路程高于對照組、替普瑞酮組（P＜0.05）；BaP 染毒組尋找平臺的平均逃避潛伏期、平臺象限停滯時間和平均總路程高于對照組、替普瑞酮組（P＜0.05）。替普瑞酮+BaP 染毒組第1、4 天尋找平臺的逃避潛伏期時間［（47.27±1.92）、（29.32±1.91）s］短于BaP染毒組［（63.10±1.70）、（45.71±2.04）s］（P＜0.05），替普瑞酮+BaP染毒組第2～4天尋找平臺總路程［（189.17±1.28）、（143.88±1.25）、（120.72±1.81）cm］高于替普瑞酮組［（124.12±1.94）、（109.11±1.34）、（89.61±1.46）cm］（P＜0.05）。替普瑞酮+BaP染毒組尋找平臺的平均逃避潛伏期［（29.17± 1.90）s］和平均總路程［（132.51±1.96）cm］低于BaP 染毒組［（46.77± 2.14）s、（181.97±2.09）cm］（P＜0.05）。

表1 大鼠尋找平臺潛伏期和平臺象限滯留時間結(jié)果（±s，n=10）Table 1 Escape latency and quadrant retention time of rats (±s,n=10)單位（Unit）：s

表1 大鼠尋找平臺潛伏期和平臺象限滯留時間結(jié)果（±s，n=10）Table 1 Escape latency and quadrant retention time of rats (±s,n=10)單位（Unit）：s

［注］*：與對照組相比，P＜0.05；&：與替普瑞酮組相比，P＜0.05；#：與BaP組相比，P＜0.05。

逃避潛伏期組別平均逃避潛伏期 平均象限滯留時間第1天 第2 天 第3 天 第4 天對照組 32.36±1.86 26.92±1.82 25.70±2.00 21.38±2.40 25.12±1.95 41.49±11.44替普瑞酮組 35.41±1.76 25.91±1.61 24.48±1.58 19.98±2.01 24.31±1.76 41.65±12.14 BaP 染毒組 63.10±1.70*& 50.12±2.09*& 42.66±2.29*& 45.71±2.04*& 46.77±2.14*& 24.68±15.33*&替普瑞酮+BaP 染毒組 47.27±1.92# 43.29±1.82 38.41±1.89 29.32±1.91# 29.17±1.90# 40.72±11.31#

表2 大鼠尋找平臺總路程結(jié)果（±s，n=10）Table 2 Total distance of rats spent on maze searching (±s,n=10)單位（Unit）：cm

表2 大鼠尋找平臺總路程結(jié)果（±s，n=10）Table 2 Total distance of rats spent on maze searching (±s,n=10)單位（Unit）：cm

［注］*：與對照組相比，P＜0.05；&：與替普瑞酮組相比，P＜0.05；#：與BaP組相比，P＜0.05。

組別 總路程 平均總路程第1 天 第2天 第3天 第4 天對照組 173.78±1.86 128.82±1.58 117.49±1.95 97.72±2.19 117.49±1.91替普瑞酮組 169.83±1.72 124.12±1.94 109.11±1.34 89.61±1.46 113.52±184 BaP染毒組 288.40±1.70*& 199.53±1.95*& 169.82±2.24*& 151.36±2.09*& 181.97±2.09*&替普瑞酮+BaP 染毒組 211.09±1.62 189.17±1.28& 143.88±1.25& 120.72±1.81& 132.51±1.96#

2.4 海馬組織病理學(xué)結(jié)果

圖1顯示，對照組、替普瑞酮組大鼠海馬區(qū)未見明顯病理改變。BaP 染毒組大鼠海馬出現(xiàn)嚴(yán)重細胞損傷，細胞結(jié)構(gòu)破壞，輪廓模糊，海馬區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)量減少、排列凌亂，出現(xiàn)明顯凋亡特征性改變，如細胞連接松解、細胞核固縮、細胞周圍出現(xiàn)環(huán)狀帶等，部分細胞出現(xiàn)壞死表現(xiàn)，胞核聚集、濃縮、溶解等；而替普瑞酮+BaP 染毒組僅見個別細胞松解，海馬區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)量多于BaP染毒組，替普瑞酮+BaP染毒組比BaP染毒組損傷明顯減輕。

圖 1 大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)變化 （HE染色）Figure 1 Morphological changes of rat hippocampus (HE staining)

2.5 大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡結(jié)果

TUNEL 法檢測結(jié)果顯示，BaP 染毒組可誘發(fā)大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡率升高。見圖2。與對照組［（3.64±2.86）%］相比，替普瑞酮組［（5.41±0.58）%］、替普瑞酮+BaP 染毒組［（11.63±2.58）%］大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡率無明顯差異（P＞0.05），替普瑞酮組及替普瑞酮+BaP 染毒組海馬細胞凋亡率低于BaP 染毒組［（31.11±5.54）%］（P＜0.001）。

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，與對照組［（0.27±0.12）%］相比，替普瑞酮組［（0.40±0.28）%］大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡率無明顯差異，BaP染毒組［（53.10±7.34）%］海馬神經(jīng)細胞的凋亡率升高，替普瑞酮+BaP 染毒組海馬細胞凋亡率［（7.73±5.16）%］低于BaP 染毒組。BaP 染毒組海馬神經(jīng)細胞凋亡率高于對照組、替普瑞酮組（P＜0.05）。

2.6 大鼠海馬組織Hsp70蛋白表達

圖3顯示，替普瑞酮+BaP 染毒組Hsp70 蛋白表達水平（0.89±0.09）高于BaP 染毒組（0.49±0.10），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。BaP 染毒組大鼠海馬組織Hsp70 蛋白表達水平最低，且與對照組（1.07±0.30）、替普瑞酮組（1.12±0.28）相比有明顯差異（P＜0.05）。

圖 2 大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡Figure 2 Apoptosis of rat hippocampal neurons

圖 3 大鼠海馬組織Hsp70 蛋白表達Figure 3 Hsp70 protein expression in rat hippocampus

3 討論

BaP 作為一種常見環(huán)境污染物，具有明顯的神經(jīng)毒性，可導(dǎo)致神經(jīng)行為和認知功能障礙，長期暴露于BaP 的大鼠和人表現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)困難和記憶障礙。亞慢性BaP 暴露同樣可以導(dǎo)致大鼠行為學(xué)改變。大鼠早期暴露于BaP 會導(dǎo)致持續(xù)性的神經(jīng)損傷，并持續(xù)到青春期和成年期［7］。經(jīng)母乳攝入BaP 可引起子代大鼠發(fā)育早期運動能力及記憶認知功能的下降［8］。本次研究結(jié)果顯示，大鼠經(jīng)BaP 染毒后出現(xiàn)煩躁、易激惹、活動減少、昏睡、眼屎增多、進食減少、體重明顯降低等現(xiàn)象。Morris 水迷宮結(jié)果顯示，BaP 染毒組有明顯的神經(jīng)行為改變。組織病理學(xué)結(jié)果顯示，BaP 染毒大鼠海馬出現(xiàn)嚴(yán)重細胞損傷。此外，BaP 染毒組海馬細胞的凋亡率明顯升高。表明BaP 染毒可導(dǎo)致大鼠神經(jīng)行為改變和神經(jīng)組織損傷。

替普瑞酮是一種萜烯類化合物，因其具有組織修復(fù)和較強的抗?jié)冏饔枚恢庇糜谥委熛罎儭Ｄ壳把芯空J為替普瑞酮是一種有效的、低毒副作用的熱休克蛋白和其他神經(jīng)保護蛋白的誘導(dǎo)劑，可在多種器官、組織中發(fā)揮保護作用［5］。單次口服替普瑞酮后，大鼠腦星形膠質(zhì)細胞激活并可減輕大鼠海馬區(qū)由海藻酸引起對的癲癇發(fā)作和神經(jīng)元細胞死亡［9-10］，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究結(jié)果顯示，替普瑞酮組和對照組大鼠相比，行為無明顯變化，替普瑞酮+BaP 染毒組只見輕微的行為異常改變。替普瑞酮+BaP 染毒組大鼠尋找平臺的平均逃避潛伏期、平均總路程明顯低于BaP 染毒組，且該組大鼠神經(jīng)行為損傷并不明顯。組織病理學(xué)結(jié)果顯示，替普瑞酮+BaP染毒組較BaP 染毒組細胞損傷減輕，僅有部分出現(xiàn)細胞核固縮，細胞周圍出現(xiàn)環(huán)狀帶。而且BaP 染毒大鼠經(jīng)替普瑞酮處理后海馬細胞凋亡率明顯低于BaP 染毒組。以上結(jié)果表明，替普瑞酮可以拮抗BaP引起的神經(jīng)毒性。

Hsp70可經(jīng)多種刺激誘導(dǎo)大量生成，其可以通過發(fā)揮分子伴侶作用、抗細胞凋亡及抗氧化作用提高細胞的應(yīng)激能力，對各類損傷具有抵抗能力。而且Hsp70在應(yīng)激和非應(yīng)激情況下均能在腦組織中表達，當(dāng)腦組織應(yīng)激損傷時，能發(fā)揮其保護作用。同時，以往的研究中發(fā)現(xiàn)替普瑞酮可以誘導(dǎo)大鼠胃黏膜、肝臟、心臟以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Hsp70的表達，而目前的研究認為替普瑞酮是Hsp70 有效的誘導(dǎo)劑。在此基礎(chǔ)上，進一步測定了Hsp70 蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)BaP可導(dǎo)致Hsp70的表達水平顯著下調(diào)，而替普瑞酮+BaP染毒組可明顯提升Hsp70 表達水平。Hsp70 具有抗氧化和抗凋亡的作用，Hsp70基因遺傳多態(tài)性與神經(jīng)毒性及其他多種疾病相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)焦?fàn)t工人的Hsp70-1 CC和Hsp70-2 AA基因型可能增加注意力、學(xué)習(xí)和記憶等的神經(jīng)行為損傷的風(fēng)險［11］。而Hsp70的激活又可通過促進聚谷氨酰胺蛋白降解來降低神經(jīng)毒性［12］。同時BaP染毒引起的神經(jīng)毒性中Hsp70表達減少可能與線粒體凋亡途徑的激活有關(guān)，可以引起細胞凋亡。研究表明，口服替普瑞酮的大鼠可抵抗熱應(yīng)激，其作用與誘導(dǎo)產(chǎn)生的熱休克蛋白成正比，此外，Hsp70 還與替普瑞酮的抗胃黏膜凋亡作用有關(guān)［13-14］。BaP染毒大鼠經(jīng)替普瑞酮處理后Hsp70蛋白表達上調(diào)，也減少了細胞凋亡，減輕了神經(jīng)元的損害，增加神經(jīng)元的存活，改善因BaP染毒引起的神經(jīng)行為改變。因此推測，替普瑞酮可能通過提升Hsp70表達，減少細胞凋亡，從而改善BaP神經(jīng)毒性。

綜上，替普瑞酮可以改善經(jīng)BaP 暴露引起的神經(jīng)行為改變，上調(diào)Hsp70 蛋白表達，減少細胞凋亡，減輕神經(jīng)元的損害，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。