鎘誘導小鼠原代神經(jīng)細胞程序性壞死的機制

何邵波，蔣傳命

邵陽學院醫(yī)學檢驗學院，湖南 邵陽 422000

鎘作為常見的具有高毒性的重金屬污染物，通常以二價化合物的形式存在于水體和土壤中［1］。鎘目前已被國際癌癥研究機構(gòu)列為強致癌物質(zhì)，由于其分布廣、半衰期長以及易攝取等特點，容易在動物體內(nèi)積累，從而導致慢性中毒，如腎中毒［2］。長時間鎘暴露也可引起器官纖維化或衰竭［3］，甚至癌癥［4］。鎘導致上述疾病的機制可能與細胞所受的外界刺激密切相關(guān)：當刺激較大時，細胞死亡途徑被激活從而介導細胞死亡；而當刺激不足以導致細胞死亡時，細胞可能失控而出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化［5］。鎘暴露導致的細胞死亡可分為細胞凋亡和細胞壞死，現(xiàn)階段關(guān)于凋亡的研究較多，主要有凋亡樣、Caspase 依賴或非依賴的細胞凋亡途徑。

細胞壞死包括程序性壞死和非程序性壞死［6］。其中，細胞程序性壞死通常與活性氧（reactive oxygen species，ROS）導致的膜脂過氧化，ATP 產(chǎn)生不足導致的質(zhì)膜離子泵功能紊亂，以及有毒物質(zhì)的直接化學攻擊有關(guān)［6］。以往的研究大多關(guān)注鎘誘導細胞凋亡的機制，而其導致細胞程序性壞死的機制目前僅有少量報道。研究表明腸外急性鎘暴露可導致大鼠睪丸和非人靈長類動物睪丸出血壞死，而急性口服鎘溶液則可引起胃和腸黏膜壞死［7］。同時也有研究報道，濃度大于50 μmol·L-1的氯化鎘會引起腎細胞壞死，而低濃度鎘會引起細胞凋亡［8］。最新的研究也顯示重金屬鎘誘導的氧化應激通過調(diào)控淋巴細胞的miR-216a-PI3K/AKT信號途徑促進細胞凋亡和壞死［9］。此外，關(guān)于骨肉瘤的一項異種移植研究發(fā)現(xiàn)，鎘誘導骨肉瘤壞死并降低骨肉瘤殘余細胞的存活能力［10］。

細胞程序性壞死并不是一個孤立的生物學過程，細胞自噬在細胞程序性壞死過程中發(fā)揮作用。自噬的發(fā)生及發(fā)展受到精密調(diào)控，從自噬相關(guān)基因1（autophagy related gene 1，Atg1）發(fā)現(xiàn)以來，在酵母以及哺乳動物中相繼鑒定出了一系列自噬相關(guān)基因［11］，其中自噬相關(guān)基因8（autophagy related gene 8，Atg8）［哺乳動物中為自噬微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light 3，LC3），包 括LC3A～C］，由于其能結(jié)合到自噬體膜的脂質(zhì)分子上，其活化形式可以作為自噬發(fā)生的標志之一［12］。相反，若細胞或組織中自噬降解底物p62 蛋白積累或陽性，則說明自噬流被阻斷［13］。在神經(jīng)細胞中有研究表明細胞自噬和細胞凋亡可以共同調(diào)控細胞死亡［14］。

為探究鎘誘導細胞程序性壞死的機制，本研究將以小鼠原代神經(jīng)細胞為材料，首先用氯化鎘處理細胞計算其存活率，然后用流式細胞儀分別檢測其細胞周期和細胞程序性壞死相關(guān)基因［受體相互作用絲氨酸蘇氨酸激酶3（receptor interacting serine threonine kinase 3，RIPK3）和混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域蛋白（mixed lineage kinase domain-like，MLKL）］轉(zhuǎn)錄水平，最后檢測自噬相關(guān)蛋白p62 的蛋白表達水平以及p62和LC3-B 蛋白的熒光積累量，探討鎘誘導細胞程序性壞死是否依賴細胞自噬途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

DMEM 培養(yǎng)基（Sigma，美國），NeurobasalTMMedia（Gibco，美國），HBSS 培養(yǎng)基（Gibco，美國），Trypsin（Sigma，美國），胎牛血清（Gibco，美國），p62 抗 體（Sigma，美 國），GAPDH 抗 體 （TransGen Biotech，中國），羊抗鼠IgG-HRP 抗體（TransGen Biotech，中國），GFP-LC3-B 腺病毒、mCherry-p62 腺病毒（Beyotime，中國），氯化鎘（國藥，中國），多聚甲醛（國藥，中國），碘化丙啶（propidium iodide，PI）、臺盼藍、天冬氨酸蛋白酶抑制試劑Pepstatin A、絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶抑制劑Leupeptin（Sigma，美國），RNase A、HEPES、PBS、NaCl、Glycerol、PMSF、Triton-X（上海生工，中國），WB 增強型化學發(fā)光試劑（Vazyme，中國），RNA 提取以及實時熒光定量試劑盒（上海生工，中國），BCA 試劑盒（Beyotime，中國），Annexin V-FITC/PI 雙染試劑盒（BestBio，中國）。

-80℃超低溫冰箱（Thermo，美國），7500 型實時熒光定量PCR 儀（ABI，美國），IX73 型倒置顯微鏡（Olympus，日本），H2050R 高速冷凍離心機（湘儀，中國），二氧化碳培養(yǎng)箱（Salvis，瑞士），全波長酶標儀（Molecular devices，美國），BD LSR Fortessa 流式細胞儀（BD，美國）。

1.2 原代小鼠神經(jīng)元的分離和培養(yǎng)

取妊娠10～12 d 的ICR 小鼠（25～30 g）脫臼處死，用75%的乙醇浸泡15 min，在生物安全柜中取出小鼠子宮，放置于4℃預冷的HBSS 中備用。然后迅速取出胎鼠再在解剖鏡下剝離大腦皮質(zhì)置于培養(yǎng)皿中。將上述組織剪碎后轉(zhuǎn)移至離心管中，用體積分數(shù)0.01%的胰酶消化至組織塊逐漸消失。取等量的含10% FBS 的DMEM輕輕吹打終止消化，100×g離心5 min，棄上清，用1 mL NeurobasalTMMedia重懸細胞并計數(shù)。取1×106個細胞接種于經(jīng)10 ng·L-1多聚賴氨酸包被過的6 孔板中培養(yǎng)，體積2 mL。每48 h進行培養(yǎng)基半量換液，經(jīng)3次換液后即可用于后續(xù)實驗［15］。本實驗已通過邵陽學院實驗動物倫理委員會審批（無編號）。

1.3 臺盼藍染色檢測細胞存活率

取1×106個小鼠原代神經(jīng)元細胞接種到含2 mL 培養(yǎng)液的12 孔板中（經(jīng)10 ng·L-1多聚賴氨酸包被），培養(yǎng)2 d 后用10 μmol·L-1氯化鎘（用超純水配制）處理2、4、6、12、24、48 h，用臺盼藍染色法計算細胞存活率。實驗組和對照組各設6個重復孔。

1.4 流式細胞分析細胞周期和細胞程序性壞死

取1×106個小鼠原代神經(jīng)元細胞培養(yǎng)24 h 后，分別用10 μmol·L-1氯化鎘處理24、48 h。胰酶消化并離心收集細胞，棄上清，用預冷PBS 洗細胞兩次，加入預冷70%乙醇固定。然后離心去上清并用1 mL 的PBS洗一次，加入500 μL PBS（含40 mg·L-1PI、100 mg·L-1RNase A），4℃避光處理30 min 后用流式細胞儀檢測細胞周期。

通過Annexin V-FITC/PI 雙染試劑盒檢測細胞程序性壞死水平，將10 μmol·L-1氯化鎘處理48 h，細胞消化重懸后，1×PBS清洗3次，然后200 μL的1×PBS重懸，依次加入Annexin V-FITC及PI染色液，室溫孵育30 min后用流式細胞儀檢測細胞程序性壞死狀況。

1.5 實時熒光定量PCR 法檢測細胞程序性壞死相關(guān)基因

參照試劑盒（上海生工）的說明書進行了RNA 提取以及實時熒光定量。引物序列如下，Actin正向引物：5’-CAACGAGCGGTTCCGATG-3’，Actin反向引物：5’-GCCACAGGATTCCATACCCA-3’；RIPK3正向引物：5’-GAAGACACGGCACTCCTTGGTA-3’，RIPK3反向引物：5’-GGTGGTTCTTGA TG ACGGAGTTC-3’；MLKL正向引物：5’-CTGAGGGAACTGCTGGATAGAG-3’，MLKL反向引物：5’-TAGTCGTCGAGGTCAAAGGAGC-3’?；蚍崔D(zhuǎn)錄和擴增程序如下：50℃反轉(zhuǎn)錄5 min，95℃預變性3 min，95℃變性10 s，60℃退火、延伸，采集熒光信號30 s，共擴增40 個循環(huán)。

1.6 自噬相關(guān)蛋白p62和LC3-B 蛋白檢測

1.6.1 蛋白免疫印跡法檢測p62 蛋白含量原代神經(jīng)元細胞培養(yǎng)24 h 后，分 別用5、10、20 μmol·L-1氯化鎘處理24 h 后用離心管收集細胞，預冷PBS 沖洗兩次，加入1 mL 預冷的裂解緩沖液［含50 mmol·L-1HEPES（pH=7.4）、137 mmol·L-1NaCl、10% Glycerol、1%TritonX-100、Pepstatin A（1 mg·L-1）、Leupeptin（1 mg·L-1）、PMSF（1 mmol·L-1）］置于冰上，超聲裂解10 s，冰浴10 min。13 000×g，4℃離心10 min，取上清，用BCA試劑盒（碧云天）測定蛋白濃度［16］。一抗p62、GAPDH按照1∶3 000的比例用PBST 進行稀釋，4℃孵育過夜。經(jīng)PBST 漂洗后，二抗羊抗鼠IgG-HRP以1∶4 000進行稀釋，室溫孵育2 h，用PBST漂洗后進行檢測。

1.6.2 顯微熒光觀察法檢測p62 和LC3-B 蛋白積累水平將5×106個小鼠原代神經(jīng)元細胞接種到含2 mL 培養(yǎng)基的6 孔板（已用多聚賴氨酸包被）上培養(yǎng)1 d，然后用GFP-LC3-B、mCherry-p62 腺病毒感染細胞24 h，用于標記LC3-B、p62（熒光顯微鏡下分別顯示為綠色熒光、紅色熒光）。用10 μmol·L-1氯化鎘處理上述細胞，每個處理組設6 個平行重復，處理完畢后將所含有細胞的蓋玻片用PBS 漂洗3次，用4%多聚甲醛于室溫固定45 min，PBS 漂洗3 次，封片，于熒光顯微鏡下成像拍照［17］。饑餓細胞（即營養(yǎng)匱乏，用HBSS 培養(yǎng)基代替DMEM 培養(yǎng)基）作為陽性對照。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 鎘離子導致原代小鼠神經(jīng)元細胞活力降低

如圖1所示，經(jīng)臺盼藍染色以及統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，用鎘離子處理4 h 后，實驗組較對照組細胞存活率明顯下降（P＜0.05）。

圖1 不同染毒時間10 μmol·L-1氯化鎘處理組小鼠原代神經(jīng)元細胞存活率（n=6）Figure 1 Survival rate of mouse primary neurons treated with 10 μmol·L-1 CdCl2 for different exposure time (n=6)

2.2 鎘離子導致細胞周期停滯G0期

如圖2所示：對照組49.62%細胞停留在G0―G1期，10 μmol·L-1鎘離子處理24 h 組60.88%細胞停留在G0―G1期，處理48 h組82.94%細胞停留在G0―G1期。

圖2 鎘離子處理后小鼠原代神經(jīng)元經(jīng)細胞周期檢測結(jié)果Figure 2 Cell cycle of mouse primary neurons after treatment with cadmium ions

2.3 鎘離子處理導致神經(jīng)元細胞程序性壞死

相對于對照組而言，經(jīng)10 μmol·L-1鎘離子處理48 h后，細胞出現(xiàn)PI 單染陽性的水平明顯提高（47.50%）（圖3A、3B）。進一步熒光定量PCR 結(jié)果顯示，經(jīng)鎘離子處理后，細胞程序性壞死相關(guān)基因RIPK3以及MLKL的mRNA水平是對照組的6.9 倍和3.7 倍（圖3C）。

圖3 小鼠原代神經(jīng)元經(jīng)鎘離子處理48 h后細胞程序性壞死水平Figure 3 Cell necroptosis of mouse primary neurons after treatment with cadmium ions for 48 h

2.4 鎘離子處理導致神經(jīng)元細胞自噬流阻斷

蛋白免疫印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4A），經(jīng)5、10、20 μmol·L-1氯化鎘處理24 h后小鼠原代神經(jīng)元細胞自噬相關(guān)蛋白p62 表達分別上調(diào)（587±17）%、（609±14）%、（893±16）%。進一步，熒光檢測細胞自噬流的關(guān)鍵指標LC3-B發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，經(jīng)10 μmol·L-1氯化鎘處理后GFP-LC3-B斑點數(shù)量明顯增多，熒光強度提高約3.24倍（圖4B）。GFP-LC3-B和mCherry-p62熒光位置能完全疊加，鎘離子處理組GFP-LC3-B 和mCherry-p62 熒光斑點數(shù)量和亮度高于對照組、陽性對照組（圖4C）。

圖4 鎘離子染毒后小鼠原代神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白表達Figure 4 Expressions of autophagy-related proteins in mouse primary neurons after treatment with cadmium ions

3 討論

鎘離子污染引起的人群健康風險近年來越來越受到學者們的重視［18］，其不僅可以影響基因表達，抑制DNA 損失修復，也可導致細胞凋亡、壞死以及氧化應激反應等［19］。然而，鎘引起神經(jīng)細胞程序性壞死的具體機制仍有待深入研究。本研究發(fā)現(xiàn)鎘離子可通過抑制小鼠原代神經(jīng)細胞的自噬流進而引起細胞程序性壞死。當小鼠原代神經(jīng)細胞經(jīng)10 μmol·L-1鎘離子處理后，細胞活性在4 h 后開始降低，且處理時間越長，細胞活力降低越明顯（圖1）。本研究推測細胞活力降低的原因主要有二：其一，細胞周期檢測結(jié)果顯示，10 μmol·L-1鎘離子處理24 h 或48 h 分別有60.88%或82.94%停留在G0―G1 期，無法進入S 期（圖2）；其二，細胞程序性壞死檢測結(jié)果顯示，經(jīng)鎘離子處理的細胞，其細胞程序性壞死率可達47.50%（圖3），證實鎘離子能導致神經(jīng)細胞損傷，降低細胞活力。

目前，對細胞程序性壞死機制的研究主要集中在腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）介導的通路［20］。TNF首先與其受體腫瘤壞死因子受體1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）結(jié)合，然后招募RIPK1、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TNF receptorassociated factor 2，TRAF2）、凋亡抑制蛋白1/2（cellular inhibitor of apoptosis protein-1/2，cIAP1/2）以及線性泛素鏈組裝復合物（linear ubiquitin chain assembly complex，LUBAC）等蛋白形成復合物I，其解聚可進一步形成復合物 II-a、II-b 和 II-c，前兩者與細胞凋亡相關(guān)，而 II-c又稱壞死體，則與細胞程序性壞死有關(guān)［21］。細胞程序性壞死的過程依賴激酶RIPK1、RIPK3 以及MLKL 的表達［22］。本研究發(fā)現(xiàn)鎘離子處理神經(jīng)元細胞后，細胞出現(xiàn)了大量的碎片化，其細胞程序性壞死率可達47.50%，同時，經(jīng)鎘離子處理后RIPK3以及MLKL轉(zhuǎn)錄水平也明顯上升（圖3B），說明鎘暴露確實導致了細胞程序性壞死。此研究為明確鎘離子引起神經(jīng)元細胞程序性壞死提供了較直接的依據(jù)。

另外，本研究證明了鎘離子引起小鼠原代神經(jīng)細胞程序性壞死的機制與細胞自噬密切相關(guān)。當用鎘離子處理小鼠原代神經(jīng)細胞后，p62 蛋白表達水平明顯上升，同時通過熒光觀察發(fā)現(xiàn)GFP-LC3-B 和mCherry-p62 斑點的數(shù)量也明顯增多（圖4）。p62 以及GFP-LC3-B常被作為自噬流的檢測指標，細胞內(nèi)p62表達上升以及GFP-LC3-B 數(shù)量增多，通常提示自噬流受阻。因此，本研究結(jié)果說明鎘離子誘導的神經(jīng)細胞程序性壞死與自噬流阻滯有關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果表明鎘離子可通過誘導小鼠神經(jīng)細胞自噬流阻滯進而促進細胞程序性壞死。但鎘離子經(jīng)細胞自噬依賴途徑誘導細胞死亡過程中的分子機制尚未完全明確，仍需進一步探究。