硒對(duì)芥藍(lán)硫代葡萄糖苷含量與組分的影響

李偉強(qiáng) 李 陽(yáng) 王麗麗 郁有健 朱祝軍

（浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 311300）

芥藍(lán)（Brassica albograbraL.H.Bailey）是十字花科蕓薹屬一年生或二年生草本植物，以帶葉的菜薹為食用部位，是我國(guó)的特產(chǎn)蔬菜之一，其營(yíng)養(yǎng)豐富，尤其是硫代葡萄糖苷含量較高。硫代葡萄糖苷（glucosinolates，簡(jiǎn)稱硫苷）是一類(lèi)在植物體內(nèi)合成的含硫、含氮次生代謝產(chǎn)物，主要存在于十字花科植物中，它們的降解產(chǎn)物使得植物具有香、苦、辛辣等味道，是十字花科蔬菜風(fēng)味和氣味形成的主要前體物質(zhì)（Bones &Rossiter，2006）。目前鑒定出來(lái)的硫苷種類(lèi)已經(jīng)超過(guò)200 種，研究表明大多數(shù)硫苷降解產(chǎn)物具有抗菌、抗蟲(chóng)以及抗癌等功能（Masahiko et al.，2014；何玲莉 等，2018）。硫苷在癌癥的預(yù)防等方面能夠發(fā)揮極大的作用，其被攝入人體后通過(guò)腸道的酶解作用分解為異硫氰酸酯，而異硫氰酸酯與致癌物代謝激活的抑制作用有關(guān)（Keum et al.，2004）。硫苷合成與調(diào)控受多種因素的影響，在硫苷合成的不同階段受到眾多基因調(diào)控，同時(shí)也受到外部多種因素影響，如外源非生物和生物脅迫以及各種植物激素等（程坤 等，2010；王軍偉，2019）。陳微（2017）在研究外源激素對(duì)蘿卜肉質(zhì)根硫苷含量的影響中發(fā)現(xiàn)，外源茉莉酸甲酯可以增加蘿卜肉質(zhì)根硫苷的累積，而外源脫落酸處理則抑制蘿卜肉質(zhì)根硫苷的累積。Jasper 等（2020）在研究溫度對(duì)芝麻菜硫苷含量的影響中發(fā)現(xiàn)，高溫能夠增加芝麻菜硫苷的累積，但植株生長(zhǎng)和生物量顯著降低。

硒（selenium，Se）是一種重要的稀有元素，對(duì)于植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育及人體和動(dòng)物維持機(jī)體健康、抗癌等方面具有重要作用（李頌 等，2014；許月明 等，2018）。適量的硒元素能夠促進(jìn)植株在逆境下的生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)植物的抗性。研究表明，適宜濃度的硒可以促進(jìn)番茄、葉用萵苣、菠菜、普通白菜等蔬菜作物的生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)，且能提高植株的抗逆性，但過(guò)量的硒對(duì)植株卻有毒害作用（Yu &Gu，2007；韓亞文 等，2014；Pezzaressa et al.，2017）。李樂(lè)等（2020）研究表明，適宜濃度的硒處理可以增加番茄可溶性固形物含量，改善果實(shí)品質(zhì)，提高產(chǎn)量和礦物質(zhì)元素含量。Rouhollah 等（2020）研究表明，葉面噴施適量硒溶液可以提高葡萄葉片礦質(zhì)元素含量，改善植株?duì)I養(yǎng)平衡和抗氧化能力，提高耐鹽性。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)不同濃度亞硒酸鈉處理的芥藍(lán)植株中硫苷組分及含量進(jìn)行測(cè)定和分析，旨在探索硒對(duì)芥藍(lán)硫苷含量與組分的影響，以期為育種和栽培實(shí)踐中高品質(zhì)芥藍(lán)的培育和改良提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理方法

供試芥藍(lán)品種為大筍遲花（汕頭市利農(nóng)種業(yè)有限公司），硒試劑為亞硒酸鈉（Na2SeO3）。試驗(yàn)于2019 年11 月在浙江農(nóng)林大學(xué)進(jìn)行，芥藍(lán)種子播于人工氣候室的培養(yǎng)蛭石中，生長(zhǎng)至3～4 片真葉時(shí)挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，移栽到10 L 的塑料箱中，每箱定植6 株；采用Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液在人工氣候室中進(jìn)行培養(yǎng)，光周期為16 h/8 h（晝/夜，下同），溫度為26 ℃/24 ℃，每周更換2 次營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)4周后進(jìn)行不同濃度硒處理。設(shè)置亞硒酸鈉濃度分別為0（CK）、0.5、5、50 μmol · L-1，每處理3 次重復(fù)，每重復(fù)1 箱。培養(yǎng)48 h 后取樣進(jìn)行硫苷含量測(cè)定，分別采收地上部和根部，迅速用液氮冷凍，真空冷凍干燥后粉碎，超低溫（-80 ℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 硫苷提取及測(cè)定方法

硫苷的提取及測(cè)定參照Krumbein 等（2005）的方法，并經(jīng)過(guò)Zhu 等（2015）改良。稱取0.25 g 凍干樣品，加入70%甲醇溶液4 mL，同時(shí)加入5 mmol · L-1的金蓮葡糖硫苷（applichem，USA）200 μL 作為內(nèi)標(biāo)。75 ℃水浴鍋水浴10 min，然后5 800 r · min-1離心10 min，收集上清液；剩余沉淀繼續(xù)用70%甲醇提取2 次，合并上清液，定容至10 mL。取5 mL 粗提液，用DEAE Sephadex A25（Amersham Biosciences，Sweden）固相萃取柱進(jìn)行萃取，待提取液全部流出小柱后加入200 μL 硫酸酯酶（Sigma-Aldrich，USA），室溫反應(yīng)12 h，然后用5 mL 超純水洗脫，洗脫液用0.45 mm 濾膜過(guò)濾。

采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定樣品的硫苷組分與含量。進(jìn)樣量為20 μL；色譜柱為C-18 反相柱（250 mm × 4 mm，5 μm，Bischoff，Germany），柱溫30 ℃。流動(dòng)相A（Milli-Q 超純水）和B（乙腈，Tedia 公司）呈梯度變化：0 min，乙腈0；45 min，乙腈20%；46 min，乙腈100%。檢測(cè)波長(zhǎng)為229 nm，流速1 mL · min-1。根據(jù)液相色譜圖對(duì)硫苷各組分進(jìn)行鑒定，硫苷含量根據(jù)內(nèi)標(biāo)的值和響應(yīng)因子進(jìn)行計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥藍(lán)地上部和根中硫苷組分分析

芥藍(lán)0 μmol · L-1亞硒酸鈉處理的HPLC 測(cè)定結(jié)果及詳細(xì)信息見(jiàn)圖1 和表1。由圖1 和表1 可知，芥藍(lán)地上部和根中分別檢測(cè)到9 種和8 種硫苷組分，其中IBE、PRO、SIN、RAA 和NAP 為脂肪族硫苷，4OH、GBC、4ME 和NEO 為吲哚族硫苷；地上部和根中均未檢測(cè)到芳香族硫苷。

表1 芥藍(lán)地上部和根中的硫苷組分

2.2 不同濃度硒處理對(duì)芥藍(lán)總硫苷含量的影響

由表2 可知，不同濃度亞硒酸鈉處理對(duì)芥藍(lán)植株不同部位總硫苷含量的影響不同。與對(duì)照相比，5 μmol · L-1亞硒酸鈉處理的芥藍(lán)地上部和根部總硫苷含量均顯著增加；0.5 μmol · L-1和50 μmol · L-1亞硒酸鈉處理的地上部總硫苷含量顯著高于對(duì)照，而根部總硫苷含量顯著低于對(duì)照。

不同濃度亞硒酸鈉處理對(duì)芥藍(lán)植株不同部位的脂肪族硫苷和吲哚族硫苷含量影響也不同（表2）。3 種濃度亞硒酸鈉處理芥藍(lán)地上部脂肪族硫苷含量均顯著高于對(duì)照，而吲哚族硫苷含量均與對(duì)照無(wú)顯著差異。5 μmol · L-1亞硒酸鈉處理芥藍(lán)根部吲哚族硫苷含量顯著高于對(duì)照，而0.5 μmol · L-1和50 μmol · L-1亞硒酸鈉處理顯著低于對(duì)照；3 種濃度亞硒酸鈉處理的芥藍(lán)根部脂肪族硫苷含量與對(duì)照均無(wú)顯著差異。

表2 不同濃度硒處理對(duì)芥藍(lán)地上部和根中總硫苷、脂肪族硫苷、吲哚族硫苷含量的影響 μmol · g-1（DW）

2.3 不同濃度硒處理對(duì)芥藍(lán)中各硫苷組分含量的影響

由表3 可知，不同濃度亞硒酸鈉處理對(duì)芥藍(lán)不同部位硫苷組分含量有重要影響。地上部的IBE、PRO、SIN、4ME、NEO 等5 種硫苷含量均隨著亞硒酸鈉濃度的提高呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢(shì)，其中IBE、SIN 和4ME 在5 μmol · L-1亞硒酸鈉處理時(shí)含量達(dá)到最高值，分別是對(duì)照的2.86、4.77 倍和1.68 倍；RAA 在3 個(gè)亞硒酸鈉濃度處理下均檢測(cè)不到。根部不同濃度亞硒酸鈉處理對(duì)各硫苷組分含量的影響程度均小于對(duì)地上部的影響，其中3 種濃度亞硒酸鈉處理的PRO、SIN、NAP、GBC 含量均與對(duì)照無(wú)顯著差異。

表3 不同濃度硒處理對(duì)芥藍(lán)中各硫苷組分含量的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用高效液相色譜法在芥藍(lán)地上部和根中分別檢測(cè)到9 種和8 種硫苷組分，其中IBE、PRO、SIN、RAA 和NAP 為脂肪族硫苷，4OH、GBC、4ME 和NEO 為吲哚族硫苷，沒(méi)有檢測(cè)到芳香族硫苷。此前，何洪巨等（2002）在芥藍(lán)中共檢測(cè)到7 種硫苷，分別屬于脂肪族硫苷和吲哚族硫苷兩大類(lèi)；陳新娟（2006）在芥藍(lán)葉和薹中共檢測(cè)到10 種硫苷，未檢測(cè)到芳香族硫苷；司雨等（2009）在不同品種芥藍(lán)中共檢測(cè)到9 種硫苷，也未檢測(cè)到芳香族硫苷。研究表明，不同十字花科蔬菜所含硫苷組分和含量有所不同，甚至同一亞種的不同品種之間硫苷組分與含量也有較大差異（Farnham et al.，2004；Sun et al.，2011）。本試驗(yàn)中檢測(cè)到的9 種硫苷包括了何洪巨等（2002）檢測(cè)到的7 種硫苷，但未檢測(cè)到陳新娟（2006）檢測(cè)到的5-甲基亞硫酰丁基硫苷，且與司雨等（2009）檢測(cè)到的硫苷組分也有所不同，這可能是由于試驗(yàn)所用的芥藍(lán)品種不同而導(dǎo)致的。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，5 μmol · L-1亞硒酸鈉處理的芥藍(lán)地上部和根中總硫苷含量均顯著高于對(duì)照，但對(duì)不同部位各硫苷組分含量的調(diào)控具有不同作用，地上部IBE、SIN、NAP、4OH 和4ME 的含量比對(duì)照顯著增加，而根部?jī)HIBE 和4ME 含量顯著增加。研究表明，外源葡萄糖和茉莉酸甲酯處理能顯著提升芥藍(lán)硫苷及抗氧化活性物質(zhì)的累積（苗慧瑩 等，2018）；25 μmol · L-1外源硒處理能夠提高青花菜幼苗中硫苷的含量，并促進(jìn)其化學(xué)防御物質(zhì)的累積（Avila et al.，2013）。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的外源硒處理能夠顯著提高芥藍(lán)植株不同組織器官中的硫苷含量，推測(cè)其化學(xué)防御體系和抗氧化能力也會(huì)受到一定影響。此外，十字花科蔬菜的苦味來(lái)源于PRO、SIN、GBC、4ME 和NAP，其中SIN是導(dǎo)致十字花科蔬菜具有特殊辛辣味的主要物質(zhì)（Schonhof et al.，2010；Bell et al.，2018）。本試驗(yàn)中，芥藍(lán)植株地上部PRO、NEO 含量在50 μmol · L-1亞硒酸鈉處理時(shí)有所下降，而IBE、SIN、4ME 含量各濃度亞硒酸鈉處理均增加，推測(cè)硒處理能夠通過(guò)影響芥藍(lán)中不同硫苷組分的含量進(jìn)而使芥藍(lán)的風(fēng)味得以改變，需要進(jìn)一步深入研究來(lái)揭示其具體會(huì)產(chǎn)生何種變化。

此前對(duì)十字花科作物中硫苷的抗癌性已有較多研究，SIN、RAA 和4OH 等被證明具有防癌及抗癌作用，其中4OH 的降解產(chǎn)物吲哚-3-甲醇具有抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用（Jie et al.，2014；Tripathi et al.，2015；Asuncion et al.，2018）。Almuhayawi 等（2020）研究表明，高CO2濃度處理可以提高青花菜硫苷水平從而使其累積的抗癌活性物質(zhì)含量升高。本試驗(yàn)中，芥藍(lán)地上部只在對(duì)照中檢測(cè)到RAA，根部未檢測(cè)到RAA；地上部及根部的4OH 含量均在5 μmol · L-1亞硒酸鈉處理時(shí)達(dá)到最高值。表明適宜濃度的外源硒處理能明顯增加芥藍(lán)中4OH 的含量，但不能提升RAA 的含量。研究結(jié)果能夠?yàn)榻窈笊a(chǎn)實(shí)踐中培育具有較高抗癌活性物質(zhì)的芥藍(lán)等十字花科蔬菜作物提供一定的參考。