脂肪干細胞與富血小板血漿治療大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎療效比較

樓袁美 嚴佳民 邱天文 楊錦熒 單樂天*

膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）是一種常見的慢性和進行性骨代謝疾病，是影響老年人生活質(zhì)量并引起疼痛反復發(fā)作甚至殘疾的常見原因之一。目前尚無治愈KOA的方法，大多數(shù)研究旨在減輕痛苦和防止功能衰退［1］。富血小板血漿（PRP）是可作用于自體的濃縮血小板。PRP提供的超生理量的必需生長因子可提供再生刺激，促進低愈合潛力組織的修復［2］。脂肪干細胞（ADSCs）通過釋放多種生長因子和細胞因子而起到旁分泌、抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能，具有顯著的成軟骨作用［3］。研究證明，PRP和ADSCs均可起到治療和修復骨關(guān)節(jié)炎的作用。本研究旨在比較PRP和ADSCs對KOA病變中疼痛和軟骨損傷的影響，以尋求醫(yī)治膝骨關(guān)節(jié)炎最佳的措施。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠32只，無特定病原體（SPF）級，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，體重（200±20）g，生產(chǎn)許可證號：SCKK（滬）2007-0005，在浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心進行實驗。實驗過程符合醫(yī)學動物實驗倫理委員會標準。實驗時間2019年6 月至2020年1月。

1.2 試劑及儀器 IMDM液體培養(yǎng)基（美國sigma公司），戊巴比妥鈉，PBS磷酸鹽緩沖液（賽默飛世爾生物化學制品有限公司），胎牛血清，青鏈霉素混合液，0.25%胰蛋白酶-EDTA，Ⅳ型膠原酶（美國Worthington）碘乙酸（美國sigma公司），0.9%氯化鈉注射液（中國），4%甲醛溶液，EDTA脫鈣液（中國Solarbio公司），足底熱輻射測痛儀（西安峰嵐儀器廠），DK-S12型恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司），SW-CJ-1F層流超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），AXiovent200熒光倒置顯微鏡（BX20）（日本Olympus公司），德國Eppendof冷凍離心機（5804R）（上海艾本德中國有限公司），全自動多功能酶標儀（美國BioTek公司），YLS-3E電子壓痛儀（安和盟天津科技發(fā)展有限公司），CO2細胞培養(yǎng)箱（3111）（美國Thermo公司）。

1.3 實驗方法 （1）PRP制備及質(zhì)量控制：從SD大鼠外周血中分離制備PRP。隨機選取4只SD大鼠，用0.2%戊巴比妥麻醉，每只大鼠心內(nèi)采血5~6 ml，將20 ml外周血收集到抗凝真空管中，以800 g離心10 min，收集血漿部分，在1000 g離心5 min，得到血小板。然后取出大部分血漿，留下3 ml血漿，使血小板再懸浮，制成1×106個/ml濃度的PRP。（2）ADSCs制備及質(zhì)量控制：從SD大鼠腹股溝脂肪組織中分離制備ADSCs。隨機選取4只SD大鼠，用0.2%戊巴比妥麻醉，無菌條件下從大鼠腹股溝脂肪組織中收集脂肪組織（1.5 g），置于含Hank' s的培養(yǎng)皿中并用磷酸鹽緩沖液（PBS）反復洗滌3~5次，在5 min內(nèi)將脂肪組織切成條。將Ⅳ型膠原酶溶于PBS中，使其濃度在25 ml中為0.12%，用于消化脂肪組織。消化過程在37 ℃水浴下進行，混合物需搖動1次/15 min。反應(yīng)完成后，加入25 ml Hank's中和膠原酶活性。用100 μm的細胞篩過濾所得溶液，以1300 r/min離心6 min，去除上清液。將細胞接種于25 cm×25 cm培養(yǎng)瓶中，放置在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培育。1 h后換液，定時察看細胞生長情況。換液1次/3 d，1周后傳代。給藥前收集第3代ADSCs，再次離心重懸，制成1×106個/ml濃度的ADSCs。（3）大鼠分組、造模及干預：將32只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、PRP組、ADSCs組，每組各8只。向空白組大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)各注射25 mg/ml生理鹽水50 μl，模型組、PRP組、ADSCs組用同樣方法注射25 mg/ml碘乙酸50 μl，以造KOA模型。造模1周后向ADSCs組大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射50 μl ADSCs，PRP組注射50 μl PRP，空白組和KOA模型組注射50 μl生理鹽水，1次/周，共注射8次。（4）大鼠壓痛閾值測定：大鼠壓痛閾值用YLS-3E電子壓痛儀測定。用固定桶固定大鼠，使其保持舒適和安靜的狀態(tài)，將YLS-3E電子壓痛儀的扁型頭向大鼠后足背施壓，當大鼠因疼痛開始鳴叫或掙扎時停止施壓，此時顯示的壓力值即為大鼠的壓痛閾值，再測量另一側(cè)。在模型復制后第1周、第4周、第8周測定壓痛閾值。（5）大鼠熱痛閾值測定：大鼠熱痛閾值用足底熱輻射測痛儀測定。熱痛實驗于壓痛實驗結(jié)束6 h后進行，將大鼠置于透明有機玻璃箱內(nèi)，保持室溫于23~27 ℃。等待大鼠安靜后（停止梳理毛發(fā)和探索性活動），置大鼠左后足底中央于測痛儀的“十”字形標記，注意需避開足墊，然后開啟儀器，當溫度超過大鼠的忍受程度，出現(xiàn)抬腿回避，將此段時間間隔作為大鼠的熱痛閾值，再測定另一側(cè)足底。每間隔5~6 min再測定一次，各3次，并取平均值。實驗時將熱痛閾值測定的時間上限設(shè)定為20 s，溫度上限設(shè)定為35 ℃，防止大鼠被熱輻射燙傷［22］。（6）膝關(guān)節(jié)組織病理學分析：造模干預8周，最后一次測定痛閾值后，將所有大鼠斷頸處死。取4組大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)并置于4%多聚甲醛中固定48 h，EDTA脫鈣4周，乙醇逐級脫水，浸蠟包埋后在切片機上沿膝關(guān)節(jié)矢狀面將脛骨外側(cè)平臺軟骨下松質(zhì)骨和股骨外側(cè)髁軟骨下松質(zhì)骨沿下肢縱軸方向切片，切片厚度為5 μm，切片常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)自來水沖洗后進行HE染色、封片。光學顯微鏡下觀察膝關(guān)節(jié)組織病理學改變，依照OARSI評分標準進行評分。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，比較采用單因素方差分析或重復測量設(shè)計的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠壓痛閾值測定結(jié)果 見表1。

表1 4組大鼠熱痛閾值比較［s，（±s）］

表1 4組大鼠熱痛閾值比較［s，（±s）］

注：與空白組比較，*P<0.01；與KOA模型組比較，#P<0.01

組別 造模后第1周 造模后第4周 造模后第8周空白組 17.47±2.52 16.64±3.38 14.20±2.54 KOA模型組 11.09±1.42* 10.79±1.43* 10.95±1.72*ADSCs組 10.93±1.74* 12.30±1.51*# 12.49±1.39*#PRP組 12.05±1.88* 12.64±1.51*# 12.40±1.23*#

2.2 4組大鼠熱痛閾值測定結(jié)果 見表2。

表2 4組大鼠壓痛閾值比較［g，（±s）］

表2 4組大鼠壓痛閾值比較［g，（±s）］

注：與空白組比較，*P<0.01；與KOA模型組比較，#P<0.01；與ADSCs組比較，&P<0.05

組別 造模后第1周 造模后第4周 造模后第8周空白組 856.25±72.92 768.75±103.20 782.50±94.90 KOA模型組 536.25±55.31* 526.25±58.88* 514.58±65.80*ADSCs組 515.93±38.00* 536.25±49.88*# 592.18±58.40*#PRP組 525.06±47.03* 566.59±74.76*# 631.87±84.94*#&

2.3 組織病理學和OARSI評分結(jié)果 病理學結(jié)果：與空白組相比較，KOA模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面明顯存在殘缺，損害處軟骨細胞顯著缺失，軟骨面明顯變薄，軟骨下骨出現(xiàn)纖維化退行性變；PRP組或ADSCs組治療均可改善KOA模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨損害，鏡下可觀察到大量的軟骨細胞，軟骨表面平整。其中ADSCs組軟骨仍有少量軟骨細胞丟失，軟骨層輕度變薄，仍可見少量肥大軟骨細胞，軟骨下骨有少量纖維化退變；PRP組軟骨基本復原，軟骨面增厚（見圖1）。OARSI評分結(jié)果：KOA模型組OARSI評分高于空白組、RPR組和ADSCs組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），PRP組OARSI評分高于ADSCs組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

圖1 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理切片（HE染色，×100）

表3 4組大鼠OARSI評分比較（±s）

表3 4組大鼠OARSI評分比較（±s）

注：與空白組、RPR組和ADSCs組比較，*P<0.01；與ADSCs組比較，#P<0.05

組別 OARSI評分空白組 0.94±0.70 KOA模型組 4.30±1.63*ADSCs組 2.66±0.90 PRP組 1.83±1.00#

3 討論

目前KOA的臨床治療方法包括非甾體類抗炎藥（NSAIDS）、皮質(zhì)類固醇和透明質(zhì)酸（HA）等藥物治療，手術(shù)治療以關(guān)節(jié)置換為主［4］。但傳統(tǒng)保守醫(yī)學治療旨在控制癥狀而不是改變疾病本身，藥物的益處有限且具有不良的毒副作用，手術(shù)治療甚至會導致患者的持續(xù)性疼痛或功能喪失［5］。PRP治療具有操作簡單、經(jīng)濟、微創(chuàng)等優(yōu)點，可提供天然濃縮的自體生長因子（GFs），用于增強組織再生，還可被用作ADSCs的生長因子和分化因子的來源，已被證明在早期膝關(guān)節(jié)炎中具有改善疾病的作用［6］。ADSCs的免疫原性低、來源豐富、易獲得，和其他種類的MSC同樣具有成軟骨作用，能夠修復損傷的軟骨，因而可用于治療進行性發(fā)展的骨關(guān)節(jié)炎。

MOUSSA等［7］研究發(fā)現(xiàn)PRP能夠?qū)е孪リP(guān)節(jié)炎模型軟骨細胞MMP3，MMP13，ADAMTS-6，IL-6和Sox-2下降，同時提高TGF-β，Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖的程度，從而調(diào)節(jié)軟骨細胞生存力和保護軟骨基質(zhì)，抑制軟骨退行性變。TAKAGI［8］等研究發(fā)現(xiàn)ADSCs能降低兔KOA模型軟骨細胞MMP-1，MMP-13和ADAMTS-4的表達，從而抑制Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖的降解，抑制關(guān)節(jié)軟骨退變。但是隨著時間的推移，ADSCs在關(guān)節(jié)內(nèi)的營養(yǎng)減弱，反而引起更為嚴重的OA。

有研究認為脂肪干細胞治療骨關(guān)節(jié)炎的證據(jù)有限，用SVF形式制備ADSCs治療骨關(guān)節(jié)炎時，有>50%研究使用PRP或纖維蛋白或PRP和纖維蛋白作為輔助［9］。有研究表明，MSC在高濃度細胞因子和白細胞存在的炎癥環(huán)境中，其細胞活力、成軟骨和成脂肪分化潛能下降，甚至對MSC的增殖和分化能力產(chǎn)生不良影響，且誘導細胞凋亡，損害MSC對關(guān)節(jié)炎癥的功效和治療潛力［10-11］。且干細胞采集也比PRP所需的簡單抽血更具侵襲性，這可能增加MSC治療患者發(fā)生感染或并發(fā)癥的可能性［12］。研究認為PRP通過激活α顆粒并使其蛋白如PDGF、TGF-β等脫粒與膝關(guān)節(jié)內(nèi)的膠原、破骨細胞和軟骨細胞上的受體結(jié)合，分泌生長因子和抗炎細胞因子，以促進軟骨基質(zhì)合成和組織再生，從而保護軟骨細胞。由于關(guān)節(jié)內(nèi)干細胞存在，上述機制將更加強烈和有效，干細胞發(fā)揮其旁分泌和營養(yǎng)作用，還能夠分化成新的關(guān)節(jié)軟骨細胞。通過這條途徑延長PRP的作用時間，放大PRP的效應(yīng)，從而更有效地修復軟骨損傷。

本研究結(jié)果顯示，在造模8周后，PRP組和ADSCs組的疼痛閾值較模型組均有提高，提示PRP和ADSCs可緩解KOA模型大鼠的膝關(guān)節(jié)炎癥，提高痛閾。在第4周和第8周，PRP組的壓痛閾值較ADSCs組高，表明PRP治療效果優(yōu)于ADSCs組。在大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理OARSI評分中，PRP組和ADSCs組OARSI評分均低于KOA模型組，表明PRP和ADSC均能修復KOA模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨的損害。PRP組OARSI評分低于ADSCs組，表明PRP修復效果優(yōu)于ADSCs組。

綜上所述，PRP和ADSCs均可提高KOA大鼠的痛閾，表明大鼠關(guān)節(jié)軟骨逐漸修復，但PRP治療KOA的效果比ADSCs的治療效果好。證明PRP對改善KOA動物模型膝關(guān)節(jié)炎癥疼痛，促進關(guān)節(jié)軟骨修復有較大的優(yōu)越性，且具備較高的安全性和療效。