基于模式生物斑馬魚研究姜黃抗血管新生的作用及機制

朱宗萍，王繼森，廖 婉*，陳 姣，陳 意，楊青松，李 銳*，馬云桐，傅超美

1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137

2.成都市食品藥品檢驗研究院，四川 成都 610045

血管新生是指在原有血管的基礎上構建新血管的過程。在正常生理狀況下，體內抗血管與促血管因子之間呈動態(tài)平衡；當機體受到過度促血管因子刺激時，會導致異常的過度的病理性血管新生。病理性血管新生是人類惡性腫瘤、心血管疾病和其他疾病發(fā)生發(fā)展的重要進程[1]，癌癥、糖尿病視網(wǎng)膜病變、動脈粥樣硬化、類風濕性關節(jié)炎等70 余種疾病均與血管過度生成有關，因此抗血管新生的研究對于治療血管新生依賴性疾病具有重要意義[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論雖無“血管新生”這一概念，但《素問·脈要精微論》提出“脈”為氣血運行之通道，其中絡脈主血、入血傷絡，可見血管新生相關疾病與中醫(yī)絡脈的病變密切相關，中醫(yī)臨床上多選用活血化瘀類中藥治療絡脈病變[3]。因此，中藥治療病理性血管新生具有一定的理論依據(jù)和優(yōu)勢。

姜黃為姜科植物姜黃Curcuma longaL.的干燥根莖。姜黃屬植物的藥用記載始于《唐本草》[4]，姜黃性辛，味苦、溫，入脾、肝經，可破血行氣、通經止痛，用于治療胸脅刺痛、胸搏心痛、痛經經閉、癥瘕、風濕肩臂疼痛、跌撲腫痛等癥[5]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，姜黃具有抗炎、調血脂、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤等作用[6-7]。姜黃素和揮發(fā)油類成分為姜黃中的主要活性成分，姜黃素能夠通過上調微小核糖核酸-126（microRNA-126，miR-126），負調控血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），抑制磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase，AKT）和酪氨酸激酶2/信號傳導及轉錄激活因子5A（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 5，JAK2/STAT5）信號通路，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用[8]，還能夠通過影響miR-1275 及miR-1246 的靶基因VEGFB 和核轉錄因子-кB（nuclear factor-кB，NF-кB）表達，減少角膜內血管生成[9]。姜黃揮發(fā)油成分β-欖香烯能夠下調原發(fā)性黑色素瘤中血管生成標志物CD34 表達，抑制腫瘤生長[10]。

斑馬魚是輻鰭亞綱鯉科的一種熱帶硬骨魚，原產于南亞地區(qū)[11]。由于其基因組序列與人類具有87%的高度相似性，胚胎透明且實驗周期短，被廣泛應用于藥物研究[12]。flk1-EGFP 轉基因斑馬魚常用于心臟、節(jié)間血管、腦血管系統(tǒng)等研究，熒光顯微鏡下血管的內皮細胞呈綠色熒光，可以直接觀察斑馬魚血管的生成情況，是一種便捷的抗血管新生的體內研究模型[13]。本研究以轉基因熒光斑馬魚為模式生物，探究姜黃抑制斑馬魚胚胎血管新生的作用，并通過網(wǎng)絡藥理學構建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡，結合分子對接技術，以整體性、系統(tǒng)性的角度闡釋姜黃抗血管新生的作用機制，為姜黃防治血管新生依賴性疾病的藥效物質基礎提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

轉基因型flk1-EGFP 品系斑馬魚，購自國家斑馬魚資源中心，由成都中醫(yī)藥大學藥學院斑馬魚實驗平臺培養(yǎng)和繁殖。

1.2 藥材

姜黃飲片（批號20200225）購自成都荷花池中藥材專業(yè)市場春宇藥堂，經成都中醫(yī)藥大學馬云桐教授鑒定為姜科植物姜黃C.longaL.的干燥根莖。

1.3 藥品與試劑

姜黃素（批號wkq19012802）、去甲氧基姜黃素（批號 140815）、雙去甲氧基姜黃素（批號wkq16090905）、芳姜黃酮（批號wkq20082006）、莪術醇（批號wkq16060204）購自四川省維克奇生物科技有限公司，質量分數(shù)均≥98%；二甲基亞砜（DMSO，批號C10843959）購自上海麥克林生化科技有限公司；鏈霉蛋白酶（批號306X014）購自北京索萊寶科技有限公司；VEGF 受體酪氨酸激酶亞群抑制劑PTK787（批號18805，質量分數(shù)為99.97%）購自美國MedChemExpres 公司；MS-222、甲基纖維素購自美國Sigma 公司。

1.4 儀器

斑馬魚培育與繁殖系統(tǒng)（北京愛生科技發(fā)展有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；SMZ-645 型體視顯微鏡、SMZ-1500 型熒光顯微鏡（日本Nikon 公司）。

2 方法

2.1 姜黃抗斑馬魚血管新生作用

2.1.1 供試品溶液的制備

（1）姜黃揮發(fā)油溶液的制備 取姜黃藥材粉末（過2 號篩）100 g，采用水蒸氣蒸餾法提取姜黃揮發(fā)油成分，以含0.1% DMSO 的胚胎培養(yǎng)水作為溶劑，分別配制成質量濃度為100、50、25、10、1 μg/mL的姜黃揮發(fā)油溶液。

（2）姜黃素溶液的制備 取姜黃素1 mg，以含0.1% DMSO 的胚胎培養(yǎng)水作為溶劑，分別配制成質量濃度為100、50、25、10、1 μg/mL 的姜黃素溶液。

（3）姜黃水提液的制備 取姜黃藥材粉末（過5 號篩）1 mg，加10 倍量水，回流提取1 h，濾過，以含0.1% DMSO 的胚胎培養(yǎng)水作為溶劑，分別配制成質量濃度為100、50、25、10、1 μg/mL 的姜黃水提液。

（3）PTK787 溶液的制備 精密稱定PTK787，以含0.1% DMSO 的胚胎培養(yǎng)水作為溶劑，分別配制成質量濃度為0.200、0.100、0.050、0.025 μg/mL的PTK787 溶液。

2.1.2 姜黃揮發(fā)油溶液和姜黃水提液的質量控制

（1）氣相色譜-質譜聯(lián)用（GC-MS）法測定姜黃揮發(fā)油成分 取姜黃藥材的揮發(fā)油100 μL，用正己烷稀釋50 倍，定容至5 mL 量瓶，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，注入氣相色譜儀進行測定[14]。

（2）混合對照品溶液的制備 精密稱定姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、莪術醇、芳姜黃酮于5 mL 量瓶中，加甲醇振搖后定容，得到質量濃度為0.224、0.241、0.238、0.257、0.232 g/L的混合對照品溶液。

（3）超高效液相色譜（UPLC）雙波長法（214 nm、430 nm）測定姜黃水提液成分 取姜黃藥材粉末（過5 號篩）1 g，加10 倍量水，回流提取1 h，經0.45 μm 微孔濾膜濾過，注入超高效液相色譜儀進行測定[15]。

2.1.3 分組與給藥 取受精后24 h 的斑馬魚胚胎，采用鏈霉蛋白酶（0.1 mg/mL）脫膜，隨機分為對照組、姜黃揮發(fā)油組、姜黃素組、姜黃水提液組和PTK787 組，置于含藥液的24 孔板中，每孔10～15粒胚胎，每孔終體積為1.5 mL，培養(yǎng)板于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.1.4 指標觀察 采用0.016% MS-222 麻醉斑馬魚胚胎，調整斑馬魚姿勢，使兩側眼、體節(jié)重合，采用體式熒光顯微鏡進行血管表型觀察，然后于3%甲基纖維素中固定并拍照。觀察完整體節(jié)間血管（intersegmental vessel，ISV）和缺陷ISV 的形態(tài)，以評估姜黃的抗血管生成活性，根據(jù)體節(jié)間血管生成數(shù)目計算抑制率。

2.1.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 23.0 軟件進行單因素方差分析，結果以±s表示。

2.2 基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接探究姜黃抗血管新生的作用機制

2.2.1 姜黃主要成分和靶點的篩選 基于中藥系統(tǒng)藥理學技術平臺（TCMSP），以口服生物利用度＞30%且類藥性＞0.10 為篩選條件，對姜黃的成分進行篩選，同時結合相關文獻，確定姜黃的主要成分。采用 TCMSP 數(shù)據(jù)庫及 PharmMapper 服務器（http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitfile.html）檢索獲取活性成分對應的靶點并取合集，應用Uniprot（https://sparql.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫，檢索得到靶點名稱對應的基因命名，用作后續(xù)研究。

2.2.2 抗血管新生靶點的預測與篩選 以“antiangiogenesis”“anti-angiogenesis”和“inhibits angiogenesis”為關鍵詞，在Gene Cards 數(shù)據(jù)庫（http://www.genecards.org/）和 OMIM 數(shù)據(jù)庫（http://www.omim.org）中檢索得到與抗血管新生相關的靶點，運用Venny 平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將姜黃主要成分對應的靶點與抗血管新生相關的靶點進行映射，得到姜黃抗血管新生的交集靶點。

2.2.3 “藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡的構建 將姜黃的主要成分和抗血管新生作用靶點導入Cytoscape 3.7.1 軟件，構建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡。通過network analyzer 和cytoNCA 插件對網(wǎng)絡結構進行分析，并計算網(wǎng)絡參數(shù)，包括度值、介數(shù)以及緊密度，篩選出姜黃抗血管新生的主要活性成分及其主要靶點等信息。

2.2.4 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡的構建 將姜黃抗血管新生的靶點導入String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），種屬選擇“Homo sapiens”，交互作用選擇＞0.4 的靶點，并隱藏游離的節(jié)點。采用R 語言計算PPI 網(wǎng)絡中每個靶點的連接節(jié)點數(shù)量，輸出可視化柱狀圖，用以確定PPI 網(wǎng)絡中的核心基因，并導入Cytoscape 3.7.1 軟件，構建姜黃抗血管新生的PPI 網(wǎng)絡，按度值大小進行分類和排序。

2.2.5 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（ Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將姜黃抗血管新生的靶點輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），對姜黃抗血管新生的靶點進行GO 富集分析以及KEGG通路富集分析，設定閾值P＜0.05，篩選排名靠前的生物過程和通路，采用R語言以及Cytoscape 3.7.1軟件繪制可視化圖形。

2.2.6 分子對接模擬 選擇度值排名前8 的活性成分作為配體，“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡中度值排名前5 的核心靶點和PPI 網(wǎng)絡中度值排名前5 的核心基因作為受體，采用AutoDock vina 軟件進行分子對接，得到結合能和結合位點，并作熱圖分析。

3 結果

3.1 姜黃揮發(fā)油溶液和姜黃水提液的質量控制

姜黃揮發(fā)油GC-MS 總離子流色譜圖見圖1-A，定性分析結果見表1，芳姜黃酮是姜黃揮發(fā)油的主要成分，質量分數(shù)高達29.52%。采用UPLC 雙波長法對姜黃水提液進行定性，如圖1-B、C 所示，430 nm 處檢測出姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素，214 nm 處檢測出芳姜黃酮和莪術醇。

圖1 姜黃揮發(fā)油GC-MS 總離子流色譜圖 (A)、姜黃水提液 (B) 及混合對照品溶液 (C) 色譜圖Fig.1 GC-MS total ion flow chromatogram of volatile oil of C.longa (A), chromatography of decoction of C.longa (B), and mixed reference substances solution (C)

3.2 姜黃抗斑馬魚血管新生作用

如圖2 和表2 所示，與對照組相比，各給藥組斑馬魚節(jié)間血管生成缺失且雜亂，呈斷裂趨勢；各給藥組均具有抑制斑馬魚血管新生的作用，且呈劑量相關性。當劑量為100、50、25、1 μg/mL 時，血管生成抑制率排序為姜黃素＞姜黃揮發(fā)油＞姜黃水提液；當劑量為10 μg/mL 時，血管生成抑制率排序為姜黃揮發(fā)油＞姜黃素＞姜黃水提液；當劑量為1 μg/mL 時，各給藥組斑馬魚血管新生抑制率均較低，個別呈現(xiàn)無抑制作用。此外，各劑量給藥組均無致胚胎死亡和致胚胎畸形的趨勢。

表1 姜黃揮發(fā)油成分鑒定Table 1 Identification of ingredient in volatile oil of C.longa

圖2 姜黃揮發(fā)油、姜黃素和姜黃水提液對斑馬魚血管新生的影響 (×100)Fig.2 Effect of volatile oil of C.longa, curcumin and decoction of C.longaon zebrafish angiogenesis (× 100)

3.3 基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接探究姜黃抗血管新生的作用機制

3.3.1 姜黃主要成分的篩選 TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索出姜黃化學成分52 個，通過口服生物利用度＞30%且類藥性＞0.10，共篩選得到活性成分14 個。通過查閱文獻，發(fā)現(xiàn)姜黃素、β-欖香烯等成分雖然口服生物利用度差，但具有較好的生物活性和類藥性，因此，整合數(shù)據(jù)后共得到活性成分21 個，見表3。

表2 姜黃揮發(fā)油、姜黃素和姜黃水提液對斑馬魚血管新生的影響 ( ± s , n=6)Table 2 Effect of volatile oil of C.longa, curcumin and decoction of C.longaon zebrafish angiogenesis ( ± s , n=6)

表2 姜黃揮發(fā)油、姜黃素和姜黃水提液對斑馬魚血管新生的影響 ( ± s , n=6)Table 2 Effect of volatile oil of C.longa, curcumin and decoction of C.longaon zebrafish angiogenesis ( ± s , n=6)

與對照組比較：*P＜0.05*P< 0.05 vs control group

組別 質量濃度/(μg·mL-1) 血管生成數(shù)/條 血管生成抑制率/% 對照 — 22±2 — PTK787 0.025 12±3* 46.21±12.33 0.050 5±1* 77.27±4.06 0.100 2±1* 90.91±4.97 0.200 0±1* 99.24±1.85 姜黃揮發(fā)油 1 18±1* 18.18±5.74 10 16±1* 26.52±5.31 25 12±3* 43.94±11.73 50 10±2* 53.03±10.62 100 6±1* 73.48±6.04 姜黃素 1 19±2* 15.91±8.50 10 13±4* 40.15±20.41 25 8±2* 65.15±8.93 50 5±2* 77.27±9.53 100 3±1* 86.36±4.98 姜黃水提液 1 20±2 10.61±9.81 10 19±3* 15.91±12.44 25 16±2* 28.79±7.42 50 13±3* 41.67±11.99 100 10±2* 54.55±7.04

表3 姜黃主要活性成分Table 3 Main active ingredients of C.longa

3.3.2 潛在靶點的預測 采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫及PharmMapper 數(shù)據(jù)庫得到姜黃21 個活性成分對應的靶點，刪除重復靶點，得到靶點950 個。以相關性分數(shù)≥5 為篩選條件，刪除重復靶點，得到與抗血管新生相關靶點1416 個。利用Venny 平臺對其進行交集，得到106 個抗血管新生相關的潛在靶點。

3.3.3 “藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡的構建 “藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡如圖3 所示，黃色代表姜黃，綠色代 表姜黃主要活性成分，粉色代表抗血管相關靶點，顏色越淺，節(jié)點越小，其度值越小?！八幬?成分-靶點”網(wǎng)絡圖共有126 個節(jié)點，其中靶點106 個，姜黃主要活性成分19 個，通過CytoNCA 插件分析發(fā)現(xiàn)姜黃抗血管新生最主要的前8 種活性成分分別為姜黃素、去甲氧基姜黃素、莪術醇、雙去甲氧基姜黃素、豆甾醇、吉馬酮、β-欖香烯和芳姜黃酮。以2 倍中位數(shù)值共選取28 個靶點作為核心靶點，包括前列腺素G/H 合酶2/1（prostaglandin G/H synthase 2/1，（PTGS2/PTGS1）、維生素D3 受體（vitamin D3 receptor，VDR）、孕激素受體（progesterone receptor，PGR）、維甲酸受體-α（retinoic acid receptor-α，RXRA）等。

圖3 姜黃“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡圖Fig.3 “Drug-component-target” network of C.longa

3.3.4 PPI 網(wǎng)絡的構建與分析 如圖4 所示，PPI網(wǎng)絡共有106 個節(jié)點、1181 條邊，平均節(jié)點度為22.3，平均局部聚類系數(shù)為0.576。節(jié)點越大，顏色由淺黃到橙色，表明靶點度值越大，AKT1、血清白蛋白（albumin，ALB）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3，CASP3）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）等靶點位于網(wǎng)絡的核心位置，在PPI 網(wǎng)絡中發(fā)揮關鍵調控作用。根據(jù)二倍中位數(shù)值進行篩選，得到PPI 網(wǎng)絡核心基因21 個，采用R語言可視化為柱狀圖。

圖4 姜黃抗血管新生PPI 網(wǎng)絡圖及核心基因柱狀圖Fig.4 PPI network of C.longa anti-angiogenesis and core gene column

3.3.5 GO 功能與KEGG 通路分析 借助DAVID數(shù)據(jù)平臺對網(wǎng)絡圖中的28 個核心靶點以及21 個PPI 核心基因進行GO 富集分析，共得到226 個GO條目，其中生物過程條目159 個、細胞組成條目27個、分子功能條目40 個。根據(jù)P＜0.01，取排名前10 的條目制作條形圖見圖5。姜黃抗血管生成涉及RNA 聚合酶II 啟動子的轉錄起始、信號轉導、受體酪氨酸蛋白激酶erbB-2（receptor tyrosine-protein kinase erbB-2，ERBB2）信號通路、細胞凋亡及增殖過程的調控、血管內皮生長因子受體信號通路等生物過程，細胞膜、細胞質、細胞核、高爾基體等細胞組成，酶結合、類固醇激素受體活性、蛋白質酪氨酸激酶活性、血紅素結合、蛋白結合、胰島素受體結合、鋅離子結合等分子功能。

圖5 姜黃抗血管新生GO 分析Fig.5 GO analysis of C.longa anti-angiogenesis

采用DAVID 數(shù)據(jù)平臺進行KEGG 通路分析， 共富集到116 條通路，根據(jù)P＜0.05，取P值最小的前20 條通路，采用R 語言繪制氣泡圖，Cytoscape 3.7.1 繪制“靶點-通路”圖，如圖6 所示，姜黃抗血管新生主要涉及VEGF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、FoxO 信號通路、雌激素信號通路、催乳素信號通路、甲狀腺激素信號通路等，同時姜黃活性成分還參與了前列腺癌、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥、動脈粥樣硬化、乳腺癌、膀胱癌、激活血小板、結直腸癌等信號通路，可見姜黃能夠通過抗血管新生機制來改善動脈粥樣硬化、腫瘤等疾病。

圖6 姜黃抗血管新生KEGG 分析和“靶點-通路”圖Fig.6 KEGG analysis of C.longa anti-angiogenesis and “target-pathway” network

3.3.6 分子對接驗證 對度值排名前8 的活性成分與網(wǎng)絡圖中的核心靶點以及PPI 網(wǎng)絡中的核心基因進行分子對接，最低結合能熱圖見圖7，橫坐標為核心靶點，縱坐標為姜黃的活性成分及抗血管新生臨床常用藥物索拉菲尼，顏色的深淺代表最低結合能大小，活性成分與靶點的最低結合能均小于0，表明配體與受體可以自發(fā)結合。吉馬酮10 個核心靶點的結合能均小于-5.0 kJ/mol，豆甾醇與6 個核心靶點的結合能均小于-5.0 kJ/mol，β-欖香烯、芳姜黃酮與核心靶點的結合能力也較好，莪術醇與7 個核心靶點的結合能均小于-5.0 kJ/mol。各主要活性成分與關鍵靶點的分子對接模擬圖見圖8，莪術醇與VDR 的結合能力最好，對其做構象簇聚類分析見圖9，莪術醇與VDR 在LYS-321 結合位點處形成 最優(yōu)構象。簇分析發(fā)現(xiàn)，在-4.8 kJ/mol 處聚類最多，且所有構象結合能均小于0，表明莪術醇與VDR 結合較好。姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素雖是姜黃抗血管新生度值較高的活性成分，但與核心靶點的結合能普遍較低，可能與其水溶性差、生物利用度較低有關。

圖7 姜黃主要活性成分與關鍵靶點結合能熱圖Fig.7 Heat map of binding energy between major active components of C.longa and key targets

圖8 姜黃主要活性成分與關鍵靶點分子對接模擬圖Fig.8 Simulation diagram of docking between main active components of C.longa and key targets

圖9 莪術醇-VDR 集成構象交互直方圖與分子對接圖Fig.9 Curcumol-VDR integrated conformation interaction histogram and molecular docking diagram

4 討論

斑馬魚是研究血管生成的新型模式生物，其血管發(fā)育開始于原腸胚形成時期，與包括人類在內的高級脊椎動物非常相似，并貫穿于整個生命過程[16]。flk1-EGFP 轉基因斑馬魚是一種在血管內皮細胞表面表達GFP 熒光信號的轉基因動物，在藍色熒光下其血管呈綠色。普通哺乳動物如鼠、家兔等的血管深藏體內不易觀察，解剖行為會對血管造成一定的破壞；經典血管模型雞胚絨毛尿囊膜模型雖具有一定的透明度，但其尿囊膜本身存在的血管會影響藥物作用后新生血管計數(shù)，且雞和人的種屬差異也會使體外實驗結果和臨床試驗結果存在較大差異[17]。斑馬魚因與人類基因的高度相似性及其胚胎獨特的光學清晰度，成為了體內血管動態(tài)生成研究的高通量、高效率的優(yōu)勢模式生物。本研究基于模式生物斑馬魚比較姜黃揮發(fā)油、姜黃素和姜黃水提液對血管的抑制作用，預實驗發(fā)現(xiàn)藥物質量濃度為1000、500、100、1 μg/mL 時，各給藥組均對斑馬魚血管生成有抑制作用；藥物質量濃度為1000、500 μg/mL時具有明顯的致畸作用，還有較強的胚胎致死作用，因此，本研究選取1～100 μg/mL 的質量濃度研究姜黃揮發(fā)油、姜黃素和姜黃水提液對斑馬魚血管新生的抑制作用。

本研究構建“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡，分析姜黃活性成分與靶點的相互作用關系，預測得到8 個姜黃抗血管新生關鍵活性成分，其中姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素屬于姜黃素類，芳姜黃酮、吉馬酮、β-欖香烯、莪術醇為倍半萜類，豆甾醇為植物甾醇類[4]。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃活性成分具有明顯的血管新生調控作用。3 種姜黃色素類成分均能下調 VEGF、黏附分子-1（intercellular adhesion molecul-1，ICAM-1）[18]和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表達[19]，抑制血管瘤內皮細胞 HemECs、人臍靜脈內皮細胞HUVEC 的增殖[20]。姜黃揮發(fā)油組分能夠明顯抑制人肺微血管內皮細胞增殖，且明顯對雞胚絨毛尿囊膜血管生成抑制作用[21]。芳姜黃酮為姜黃揮發(fā)油中的特征性成分，其含量最高可達姜黃揮發(fā)油類成分的50%[22]，能夠抑制人微血管內皮細胞HMEC-1增殖及其成管萌芽管的形成，且對斑馬魚胚胎和C57BL/6 小鼠的血管形成均有明顯的抑制作用[23]。吉馬酮抑制血管新生研究多集中在腫瘤領域，能夠通過降低 VEGF 表達，調控非小細胞肺癌NCI-H1770 細胞的增殖和凋亡[24]。莪術醇能夠下調NF-κB 和VEGF 表達，從而抑制人肺癌A549 細胞增殖[25]， 還可通過調控環(huán)氧合酶-2（ cyclooxygenase-2 ， COX-2 ） / 前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）/VEGF 信號通路，抑制結直腸癌裸鼠移植瘤生長[26]。β-欖香烯能夠明顯抑制胃癌干細胞GCSCs 腫瘤微血管的生成[27]。豆甾醇能夠下調腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）mRNA 表達水平，抑制小鼠腫瘤血管生成和膽管癌移植瘤生長[28]。

PTGS2 和VDR 是“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡中的關鍵靶點。PTGS2 是COX 的誘導型即刻反應基因，是花生四烯酸合成前列腺素類物質的關鍵性限速酶，主要參與炎性反應、動脈粥樣硬化、腫瘤新生等多種信號轉導[29]。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2 可能以VEGF為重要介質誘導結直腸癌血管生成[30]，目前雖有較多關于姜黃干預血管新生的研究，但姜黃通過PTGS 調控血管新生的報道較少，有待進一步驗證。VDR 與RXR 形成異源二聚體，抑制人血管內皮細胞的凋亡，對糖尿病合并動脈粥樣硬化具有一定的保護作用[31]。對姜黃的靶點進行PPI 映射并構建網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)AKT1 和ALB 是核心靶點，AKT1 負責調節(jié)代謝、細胞增殖和血管生成，姜黃素能夠通過下調AKT 表達，抑制大鼠實驗性脈絡膜新生血管生成[32]。ALB 負責調節(jié)血液的膠體滲透壓，目前有關ALB 直接調節(jié)血管新生的報道較少，但ALB 能夠影響血管通透性，高通透性血管有利于腫瘤細胞和炎性細胞的浸潤以及促血管生成因子的生成和局部聚集，提示后續(xù)可對此進行深入研究。

GO 功能和KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，姜黃能夠通過作用于PI3K-Akt信號通路、VEGF信號通路、乳腺癌、膀胱癌、結直腸癌等通路，調節(jié)蛋白質自身磷酸化、信號轉導、細胞增殖、酶結合、血紅素結合等功能。姜黃對癌癥具有明顯的改善作用，能夠抑制腫瘤細胞的增殖、遷移，還能夠延緩動脈粥樣硬化進程，但其研究多集中在姜黃單一成分或單一通路上，忽略中藥的多成分、多靶點以及中醫(yī)整體觀的理念，本研究從整體性及系統(tǒng)性的角度闡釋姜黃抗血管生成的作用。

綜上所述，姜黃揮發(fā)油、姜黃素和姜黃水提液均具有明顯的抗斑馬魚血管新生的作用，姜黃素類、倍半萜類和植物甾醇類成分可能是姜黃抗血管生成的主要活性成分，可與AKT、ALB、CASP3、PEGS2、VDR、PGR 等靶點以氫鍵作用結合，通過RNA 調控、蛋白質自身磷酸化、細胞功能等調節(jié)PI3K-Akt信號通路、VEGF 信號通路以及癌癥通路等，從而發(fā)揮抑制血管生成的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突