青蒿素類化合物抗腫瘤作用激活機制的研究進(jìn)展

廖 媛，王鈺婷，羅賢強，羅開麗，萬少翔，卿 晨

昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500

青蒿素來源于菊科植物黃花蒿Artemisia annuaL.，是一種含有過氧橋的倍半萜內(nèi)酯類化合物，極大地改善了瘧疾的治療效果[1]。多年來，人們對青蒿素類化合物的研究并沒有止步于抗瘧作用，其在抗腫瘤、抗寄生蟲病（除瘧疾外）、抗病毒及抗炎等方面也具有藥理活性[2]。青蒿素為無色針狀結(jié)晶，味苦，可溶于有機溶劑，在對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾后得到了抗瘧活性更好的雙氫青蒿素，為了改善雙氫青蒿素分子中化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的半縮醛結(jié)構(gòu)，經(jīng)進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)修飾得到了蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿琥酯等溶解性更好的化合物[3]。青蒿素類化合物的共性是其分子中均存在一個過氧橋結(jié)構(gòu)，研究表明，過氧橋是青蒿素發(fā)揮藥理活性的必需結(jié)構(gòu)，失去過氧橋結(jié)構(gòu)后其藥理活性顯著降低[4]。自青蒿素被發(fā)現(xiàn)以來，研究人員就努力探索青蒿素的抗瘧作用機制，希望更合理地應(yīng)用青蒿素類化合物，減少瘧原蟲對青蒿素耐藥性的發(fā)生，并為青蒿素的多種藥理學(xué)作用研究提供依據(jù)。

在抗腫瘤研究方面，2003年，美國國家癌癥研究所以包括白血病、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、前列腺癌和乳腺癌在內(nèi)的55 株腫瘤細(xì)胞株為模型，對青蒿素類化合物青蒿琥酯的細(xì)胞毒活性進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)其對各類腫瘤細(xì)胞都有一定的抑制作用，尤其對白血病和結(jié)直腸癌細(xì)胞株的抑制活性更高[5]。這一結(jié)果也是近20年來青蒿素類化合物抗腫瘤研究的重要基礎(chǔ)。

從已有研究結(jié)果看，青蒿素對正常人組織細(xì)胞的體外抑制作用較小，因而認(rèn)為其安全性較好[6-7]。在抗腫瘤實驗中，也發(fā)現(xiàn)若將青蒿素與有效的激活劑聯(lián)用，被激活后的青蒿素效果會比單獨給藥（無激活劑）時更好[2,8]。由于腫瘤細(xì)胞復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境，使得影響青蒿素激活的因素和青蒿素的作用靶點未有結(jié)論。在抗瘧機制中，瘧原蟲消化紅細(xì)胞釋放出大量亞鐵離子（Fe2+）和血紅素，這類還原物質(zhì)使青蒿素過氧橋斷裂，生成碳自由基；并通過抑制瘧色素形成，使蛋白質(zhì)烷基化等方式殺死瘧原蟲[9]。腫瘤細(xì)胞是一類生長失控的快速增殖細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)的血紅素及Fe2+是其生長增殖所必需的。研究顯示，腫瘤細(xì)胞內(nèi)血紅素及Fe2+的含量普遍較正常細(xì)胞高，可能成為青蒿素類化合物發(fā)揮抗腫瘤作用的生物學(xué)基礎(chǔ)[10-11]。多年來，對青蒿素發(fā)揮療效的生物學(xué)基礎(chǔ)及激活機制的探索從未止步，希望發(fā)現(xiàn)青蒿素類化合物的特點和優(yōu)勢，為發(fā)揮其多方面的臨床作用、拓展其應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。本文對近年來有關(guān)腫瘤細(xì)胞中青蒿素及其類似物激活因素的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為深入研究其抗腫瘤作用提供依據(jù)。

1 Fe2+對青蒿素類化合物的激活作用

1995年，Lai 等[10]用雙氫青蒿素聯(lián)合轉(zhuǎn)鐵蛋白作用于人急性淋巴母細(xì)胞白血病MOLT-4 細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)其能有效抑制MOLT-4 細(xì)胞的增殖，而且兩者的聯(lián)用對正常人淋巴細(xì)胞的影響較小；之后在乳腺癌細(xì)胞和正常乳腺細(xì)胞中的實驗也得到了相似的結(jié)果[6]。轉(zhuǎn)鐵蛋白的功能是結(jié)合外周血中的鐵離子（Fe3+），將Fe3+通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，隨即在細(xì)胞內(nèi)還原物質(zhì)作用下，F(xiàn)e3+還原成為Fe2+，繼而參與DNA 合成等細(xì)胞活動[12]。對青蒿素類化合物在Fe2+依賴下發(fā)揮抗腫瘤作用機制的研究也發(fā)現(xiàn)，在白血病、宮頸癌等細(xì)胞中存在的Fe2+確實與青蒿素的激活相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)了Fe2+催化的過氧橋是通過發(fā)生芬頓反應(yīng)生成活性氧（reactive oxygen species，ROS），從而發(fā)揮破壞腫瘤細(xì)胞的作用[13-14]。此后根據(jù)腫瘤細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白的高表達(dá)及腫瘤細(xì)胞的高鐵環(huán)境，陸續(xù)開展青蒿素激活機制的研究，并認(rèn)為轉(zhuǎn)鐵蛋白、氧化鐵納米材料等可作為青蒿素的載體，實現(xiàn)針對腫瘤細(xì)胞的靶向給藥，并在一定程度上提高了青蒿素的抗腫瘤效果[15]。這些研究結(jié)果支持游離鐵激活青蒿素發(fā)揮抗腫瘤作用的推測。Efferth 等[16]用甘氨酸硫酸亞鐵聯(lián)合青蒿素作用于人急性淋巴細(xì)胞白血病T 淋巴CCRF-CEM 細(xì)胞株和人星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤U373 細(xì)胞株，兩者的生長都受到了明顯的抑制，認(rèn)為此效果是由于Fe2+介導(dǎo)了青蒿素的激活。但也強調(diào)，即使沒有外源性Fe3+的供應(yīng)，青蒿素、青蒿琥酯也仍然具有活性，但由于細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)的不同，其抗腫瘤作用也存在很大差異。幾年后，該團(tuán)隊擴(kuò)大實驗對象，用36 株腫瘤細(xì)胞研究了Fe2+與青蒿琥酯發(fā)揮細(xì)胞毒活性的關(guān)系，這些細(xì)胞株包括結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、頭頸部腫瘤等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯單用和聯(lián)用對大部分腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，但其中的11 株腫瘤細(xì)胞在聯(lián)用甘氨酸硫酸亞鐵時的半數(shù)抑制濃度并沒有比單用青蒿琥酯低，提示Fe2+對青蒿素的激活并不是普遍發(fā)生在腫瘤細(xì)胞中[17]。

關(guān)于Fe2+激活青蒿素類化合物，其在抗腫瘤方面的研究晚于在抗瘧作用中的研究，實際的情況及得到的結(jié)果也更為復(fù)雜。因此，目前Fe2+激活青蒿素類化合物發(fā)揮抗腫瘤作用的假說尚不能確定。

2 血紅素對青蒿素類化合物的激活作用

近年來，研究較多的另一類青蒿素類化合物的激活因素是血紅素。血紅素是含有Fe2+的卟啉類化合物，廣泛參與細(xì)胞代謝，也是許多蛋白如血紅蛋白、肌紅蛋白、細(xì)胞色素P450、過氧化物酶及細(xì)胞色素C 等的輔基，細(xì)胞色素中的血紅素還參與線粒體電子傳遞鏈/線粒體呼吸鏈（mitochondrial electron transport chain，ETC）的電子傳遞[18]。血紅素還是具有潛在殺傷作用的一類生物因子，過多游離的血紅素會形成ROS，通過氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷細(xì)胞膜、破壞組織細(xì)胞[19]。紅細(xì)胞內(nèi)期的瘧原蟲吞食血紅蛋白以滿足其對大量氨基酸的需求，消化血紅蛋白后產(chǎn)生的血紅素在食物泡中的濃度可達(dá)到 0.4 mol/L[1]。如此多的血紅素勢必會損傷瘧原蟲體內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)，于是瘧原蟲就將血紅素打包成瘧原素，減小游離血紅素濃度，達(dá)到存活的目的[1]。研究表明，即使是從形成瘧原素過程中漏出的少量游離血紅素也可有效地激活青蒿素[20]。正常人體的外周血和正常細(xì)胞內(nèi)的血紅素濃度都受到嚴(yán)格的調(diào)節(jié)和控制，維持在0.2～0.6 μmol/L 的較低水平。研究顯示，腫瘤細(xì)胞中的血紅素含量要高于正常細(xì)胞，這有利于腫瘤細(xì)胞的生長增殖[21-22]。

20 世紀(jì)90年代，Yang 等[23]在研究青蒿素發(fā)揮抗瘧作用中的激活因素時發(fā)現(xiàn)，青蒿素可與細(xì)胞色素C、血紅蛋白結(jié)合，在體外可使蛋白烷基化，而不與不含血紅素的珠蛋白反應(yīng)，表明青蒿素在血紅素的作用下產(chǎn)生自由基，并獲得烷基化蛋白質(zhì)的能力。此后的研究證明，在抗腫瘤中血紅素是激活青蒿素的主要及重要因子[11]。在體外，Zhang 等[24]采用血紅素、氯化血紅素、血紅蛋白和亞鐵氰化物分別與青蒿素在特定的情況下進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果顯示，血紅素能在更短的時間內(nèi)與青蒿素發(fā)生反應(yīng)，并且表示血紅素也可能是激活青蒿素發(fā)揮抗腫瘤作用的主要因素。

根據(jù)血紅素的生物合成途徑，以線粒體中甘氨酸和琥珀酰輔酶 A 在 5-氨基乙酰丙酸合成酶（aminolevulinic acid synthase，ALAS）作用下合成5-氨基乙酰丙酸（aminolevulinic acid，ALA）為起始，經(jīng)由一系列生物合成反應(yīng)，最終生成血紅素（圖1）[11]。琥珀酰丙酮（succinyl acetone，SA）是研究血紅素合成途徑常用的阻斷劑，它通過抑制ALA 縮合成原卟啉使后續(xù)步驟無法進(jìn)行，導(dǎo)致血紅素合成失敗[25]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的快速增殖不僅與血紅素的含量增加有關(guān)，其細(xì)胞內(nèi)的甘氨酸和ALAS 同樣比正常細(xì)胞內(nèi)的水平要高[11,26]?；谝陨显?，Gerhard課題組[27]將雙氫青蒿素分別與ALA、原卟啉Ⅺ、轉(zhuǎn)鐵蛋白聯(lián)用增加其對MOLT-4 細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，并用SA 阻止其細(xì)胞毒性，結(jié)果表明，ALA 這個由限速酶合成且為血紅素合成途徑的上游分子，在與雙氫青蒿素聯(lián)用后的效果最好，而SA 與雙氫青蒿素聯(lián)合應(yīng)用后，則大部分逆轉(zhuǎn)了雙氫青蒿素的細(xì)胞毒性。之后，該研究組在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實雙氫青蒿素聯(lián)合ALA能在MOLT-4細(xì)胞中產(chǎn)生大量ROS，因而發(fā)揮更強的細(xì)胞毒活性作用[28]。Wang 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，將青蒿琥酯與ALA 聯(lián)用，在體內(nèi)外均能抑制結(jié)直腸癌HCT-116 細(xì)胞株及其移植瘤的生長，通過比較HCT-116 細(xì)胞和正常結(jié)腸上皮CDC841 細(xì)胞株內(nèi)的血紅素含量發(fā)現(xiàn)，ALA 通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血紅素的合成，增強青蒿琥酯對HCT-116 細(xì)胞的細(xì)胞毒性。青蒿素二聚體是2 分子青蒿素母核通過不同連接子連接起來的一類化合物，其中含有2 個過氧橋結(jié)構(gòu)[29]。Stockwin 等[30]在研究青蒿素二聚體（NSC724910 和NSC735847）對人早幼粒白血病HL-60 細(xì)胞株和前列腺癌PC-3 細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性中也發(fā)現(xiàn)血紅素的調(diào)控對激活二聚體十分重要，鈷卟啉能增強血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）活性，使其加快對血紅素的代謝，從而抑制青蒿素二聚體的活性；鋅卟啉抑制HO，則增強了青蒿素二聚體的毒性。另外，有研究通過干擾ALAS 等血紅素合成途徑的酶來研究血紅素對青蒿素的激活作用，也得到了相似的結(jié)果[31]。腫瘤細(xì)胞中血紅素對青蒿素的激活效率比鐵更高，但目前研究采用的腫瘤細(xì)胞株模型總體還較少，要確認(rèn)血紅素是青蒿素激活因素的假說還有很多工作要做。

3 線粒體對青蒿素類化合物的激活作用

雖然血紅素激活青蒿素后表現(xiàn)出了較好的抗腫瘤效果，但加入腫瘤細(xì)胞的血紅素劑量卻需要認(rèn)真推敲，因為血紅素是細(xì)胞內(nèi)多種重要蛋白的輔基，可多方面參與細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，其含量的異常與多種疾病相關(guān)。Kalainayakan 等[32]的研究指出，直接增加線粒體內(nèi)的血紅素會促使肺癌復(fù)發(fā)。在腫瘤細(xì)胞中，線粒體作為青蒿素的激活因素也是一大研究熱點。釀酒酵母是研究線粒體的經(jīng)典模式生物之一，2005年，Li 等[33]從該模型中發(fā)現(xiàn)青蒿素可以使線粒體膜電位去極化，干擾ETC 后，青蒿素的作用效果下降。之后他們對給藥2 h 后伯氏瘧原蟲感染小鼠的紅細(xì)胞進(jìn)行了分離，從中檢測到瘧原蟲線粒體的去極化，加入還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸脫氫酶抑制劑（抑制ETC）后與青蒿素聯(lián)用減弱了青蒿素的抗瘧疾效果[34]。這是提出血紅素、Fe2+是青蒿素激活因素觀點后的又一新發(fā)現(xiàn)。為繼續(xù)深入研究，Sun 等[35]培養(yǎng)了一種酵母血紅素合成途徑中的合成酶HEM2基因敲除酵母株，分別在發(fā)酵和非發(fā)酵培養(yǎng)基上培育，酵母在非發(fā)酵培養(yǎng)基上需要線粒體的呼吸作用，發(fā)酵培養(yǎng)基中則不需要線粒體進(jìn)行呼吸作用。在發(fā)酵培養(yǎng)基上，只有血紅素高低表現(xiàn)出對青蒿素敏感性的變化，但在非發(fā)酵培養(yǎng)基上0.1 μmol/L 青蒿素可抑制HEM2基因敲除酵母的生長，正常酵母則需要在5 μmol/L 時才能出現(xiàn)相同抑制效果，因此認(rèn)為線粒體激活較少的青蒿素，就能達(dá)到一定的抑制作用，而血紅素會讓青蒿素迅速消耗，使依賴線粒體（可能是ETC）激活的部分隨之減少。實驗中，雖然HEM2基因敲除的酵母血紅素合成途徑被阻斷，但檢測到其在有無青蒿素時的呼吸活性并無變化，說明ETC 及其中的血紅素沒有受到青蒿素的影響[35]。以上結(jié)果提示，在某些生物（酵母和瘧原蟲）中，增加血紅素的合成并不一定能增強青蒿素的活性，線粒體也可能激活青蒿素并介導(dǎo)更靈敏的殺傷方式。Mercer 等[36]以缺乏功能性ETC 的人宮頸癌HeLa ρ0 細(xì)胞株和正常HeLa 細(xì)胞株為模型，發(fā)現(xiàn)雖然大劑量的青蒿琥酯對HeLa ρ0細(xì)胞株仍有細(xì)胞毒活性，但正常的HeLa 細(xì)胞對青蒿琥酯更敏感，而HeLa ρ0 細(xì)胞株和正常HeLa 細(xì)胞株中的碳自由基含量大致相同，說明ETC 是介導(dǎo)青蒿琥酯發(fā)揮作用的部分原因。但ETC 是否是青蒿素類化合物的激活因素還有待進(jìn)一步探討。

圖1 外源性調(diào)節(jié)因素對腫瘤細(xì)胞內(nèi)血紅素合成途徑的影響Fig.1 Effects of exogenous modulators on heme biosynthetic pathway in tumor cells

在許多研究中發(fā)現(xiàn)，青蒿素類化合物在單用或聯(lián)合抗腫瘤藥物時可以破壞腫瘤細(xì)胞的線粒體，顯著降低線粒體膜電位[37-38]。線粒體膜電位的損傷可以激活腫瘤細(xì)胞的內(nèi)源性凋亡途徑，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[39]。還有部分文獻(xiàn)報道，青蒿素類化合物增加腫瘤細(xì)胞的ROS 不一定能引起細(xì)胞凋亡，它們甚至不會改變細(xì)胞ROS 的含量，這可能由于細(xì)胞的生理環(huán)境不同造成[38,40]。因此，線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能是青蒿素類化合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的一種穩(wěn)定方式。通過將青蒿素靶向輸送到線粒體（血紅素的合成部位），結(jié)果發(fā)現(xiàn)在線粒體聚集的青蒿素有更強的抗腫瘤作用[41]。Sun 等[42]還提出靶向線粒體后，青蒿素在增強抗腫瘤作用的同時會減弱其抗酵母及抗瘧疾的能力。以上結(jié)果表明線粒體很可能與血紅素是通過不同的途徑增強了青蒿素的作用，線粒體可以使青蒿素發(fā)揮更強的抗腫瘤作用，并且是青蒿素直接的，但不是唯一的靶點，ETC 與青蒿素的敏感性緊密相關(guān)。

4 結(jié)語

鐵、血紅素、線粒體都是細(xì)胞內(nèi)不可分割的組成部分，后者更是包含了前者。許多實驗設(shè)計將三者的作用割裂開來，欲探索單一因素對青蒿素類化合物的激活機制，但都難以獲得全面的解釋（圖2）。血紅素已被證明是青蒿素重要的激活因素和靶蛋白，在不同生物體內(nèi)都可在一定程度上激活青蒿素，因此被認(rèn)為是介導(dǎo)青蒿素細(xì)胞毒活性的基礎(chǔ)[27,35]。研究還證實腫瘤細(xì)胞內(nèi)是一個高鐵環(huán)境，游離的鐵來源于其細(xì)胞膜表面高表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白，但腫瘤細(xì)胞線粒體中的鐵卻低于正常細(xì)胞，進(jìn)一步降低了鐵對青蒿素激活的可能性[43]。Efferth 等[5]研究顯示，腫瘤細(xì)胞甚至同一組織來源的腫瘤細(xì)胞其轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)量都存在差異，且外源性的Fe2+不能激活所有細(xì)胞株中的青蒿素，僅可以提高某些腫瘤細(xì)胞中青蒿素的活性。后來的研究解釋，如果外源性鐵的加入沒有參與血紅素的合成，則不會增強青蒿素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[27,36,44]。也有研究表明不能否認(rèn)非血紅素鐵對青蒿素的激活作用，Stocks 等[45]的研究證明了這部分鐵可以穩(wěn)定青蒿素與靶蛋白的加成物。外源性鐵的加入對青蒿素類化合物在不同腫瘤細(xì)胞中加成效果不同，而鐵螯合劑與青蒿素類化合物聯(lián)用時，卻能在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)青蒿素的抗腫瘤作用。因為鐵螯合劑不僅減少了游離鐵和血紅素中鐵的部分，還可抑制ETC 的活性，從多方面阻斷青蒿素的激活[34]。ETC 由復(fù)合物I～Ⅳ、電子載體泛醌組成，電子從復(fù)合物I或Ⅱ進(jìn)入泛醌，經(jīng)過 復(fù)合物Ⅲ和Ⅳ，轉(zhuǎn)移到分子氧而產(chǎn)生水，是細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的場所[46]。血紅素參與ETC 復(fù)合物Ⅱ～Ⅳ的組成，對電子傳遞、線粒體呼吸起著關(guān)鍵作用[32]。目前還沒有證實ETC 是青蒿素發(fā)揮抗腫瘤作用的激活因子，但已有文獻(xiàn)表明，功能性的ETC 一方面為青蒿素的激活提供還原動力，另一方面還可促進(jìn)產(chǎn)生更多的ROS 以達(dá)到共同殺傷細(xì)胞的效果[35-36]。

圖2 青蒿素類化合物抗腫瘤作用的激活機制Fig.2 Activation mechanism of artemisinin and its derivatives in anti-tumor effects

青蒿素的抗腫瘤作用機制在學(xué)術(shù)界一直沒有統(tǒng)一的認(rèn)識。普遍認(rèn)為過氧橋基團(tuán)是青蒿素的藥效基團(tuán)，沒有過氧橋的化合物既不能與血紅素結(jié)合，也不能發(fā)揮較強的抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用[23]。但也有研究顯示沒有過氧橋的新型青蒿素衍生物也有一定的抗腫瘤活性，青蒿素二聚體更好的抗腫瘤活性也不能僅通過2 個過氧橋來解釋[30,47]。在抗瘧疾的研究中發(fā)現(xiàn)，大部分青蒿素類化合物必須由某種因素激活才能產(chǎn)生氧自由基，進(jìn)而重排為更具活性的碳自由基，發(fā)揮抗瘧作用[45]。大部分研究也證明青蒿素產(chǎn)生的ROS 是引起細(xì)胞死亡的主要原因，但是Lu 等[38]的研究表明雙氫青蒿素誘導(dǎo)HL-60 細(xì)胞線粒體損傷和細(xì)胞凋亡是通過激活絲裂原活化蛋白激酶信號通路，而與ROS 無關(guān)，因為細(xì)胞內(nèi)ROS 的含量沒有變化，并認(rèn)為雙氫青蒿素在不同細(xì)胞內(nèi)不一定都能產(chǎn)生ROS，可能與細(xì)胞的不同生物學(xué)背景有關(guān)[48]。

目前，針對青蒿素類化合物復(fù)雜的激活機制研究結(jié)果大多數(shù)來源于瘧原蟲或酵母模型，但是，腫瘤細(xì)胞是一個比瘧原蟲更復(fù)雜的生物學(xué)環(huán)境，單從線粒體及其功能來看，不同物種間就存在差異，這可能是很難對青蒿素的激活機制下定論的原因。由于青蒿素類化合物用于抗腫瘤方面的劑量大于抗瘧的劑量，因此發(fā)現(xiàn)安全的小分子化合物，以低劑量的形式高效地激活血紅素合成途徑或增敏青蒿素對線粒體的抑制作用，可能是今后的一個研究方向，旨在使青蒿素這個抗瘧藥發(fā)揮抗腫瘤作用切實可行。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突