炮制對草烏中烏頭類生物堿經(jīng)皮吸收的影響及其貼劑的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)

王啟隆，劉 超，權(quán) 鵬，方 亮*，王延年*

1.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110000

2.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110000

草烏是毛茛科植物北烏頭Aconitum kusnezoffiiReichb.的干燥塊根?！吨袊幍洹?020年版記載草烏具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛的功能，用于風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛及麻醉止痛等[1]。烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭堿（BAC）、苯甲酰新烏頭堿（BMA）和苯甲酰次烏頭堿（BHA）被認(rèn)為是草烏中具有主要藥理作用的烏頭類生物堿（aconitine alkaloids，AAs）[2]。因?yàn)椴轂蹙哂泻芨叩亩拘裕耘R床上經(jīng)常將草烏炮制后使用，草烏炮制后毒性較高的雙酯型AAs（烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿）水解成毒性較低的單酯型AAs（BAC、BHA、BMA），毒性大大降低[3]。

經(jīng)皮給藥系統(tǒng)（transdermal drug delivery system，TDDS）是最適合草烏的給藥方案之一。一方面，由于角質(zhì)層對藥物透過皮膚有較高的屏障作用，使藥物的經(jīng)皮滲透量有限，提高了草烏的用藥安全性。另一方面，6 種AAs 注射后半衰期均小于1 h[4]，因此能維持血藥濃度相對穩(wěn)定的貼劑，滿足草烏的長效鎮(zhèn)痛、抗炎作用。而且經(jīng)皮給藥也可減少給藥頻率，患者可自行給藥，提高患者依從性[5]。以往研究，炮制草烏只是用來減弱其毒性[6]。但是很少提及炮制對草烏中6 種AAs 經(jīng)皮吸收的影響，以及比較分別含有生、制草烏提取物的貼片的療效。壓敏膠分散型貼劑是制備工藝簡單和生產(chǎn)成本較低的一種貼劑。壓敏膠層既發(fā)揮貼敷皮膚的作用，又具有形成藥物儲(chǔ)庫、控制藥物釋放的作用，適合中藥的特點(diǎn)[7]。本研究分別將生、制草烏提取物制成壓敏膠分散型貼劑。通過體外透皮實(shí)驗(yàn)，探討生、制草烏提取物中6 種AAs 的透皮行為差異，并優(yōu)化透皮貼片處方。最后，考察含生、制草烏提取物的最佳貼片抗炎、鎮(zhèn)痛效果的差異。

1 材料與儀器

1.1 試劑與藥材

生草烏（批號(hào)170528）購自安徽亳州中藥材市場，經(jīng)沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥炮制與制藥研究室主任王延年副教授鑒定為毛茛科植物北烏頭A.kusnezoffiiReichb.的干燥塊根。對照品烏頭堿（批號(hào)17110910）、新烏頭堿（批號(hào)17111010）、次烏頭堿（批號(hào)17111310）、BAC（批號(hào)17102610）、BMA（批號(hào)18032406）、BHA（批號(hào)18032807）購自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，6 種對照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在 98%以上。DURO-TAK?87-2287、87-4098、87-2852，德國漢高公司；ScotchPak? 9744防黏層和CotranTM9707 背襯層，美國3M 公司；油酸，上海麥克林生化有限公司；氮酮，上海阿拉丁試劑有限公司；Transcutol?P（TP）、Labrafil?M 1944 CS（LM）、Plurol?Oleique CC497（POCC）和CapryolTM90（CP），法國Gattefossé公司；辛癸酸甘油酯（glycerol monocaprylocaprate，ODO），河南鄭州河食品科技有限公司；NKA-II 型號(hào)大孔吸附樹脂，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；弗氏完全佐劑（complete Freund’s adjuvant，CFA），美國Sigma- Aldrich 公司；雙氯芬酸二乙胺貼劑，韓國Samyang生物制藥有限公司，72 mg/30 cm2。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar 雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g；KM 雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g；大鼠和小鼠均購自沈陽藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)沈陽藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：No.SYPU- IACUC-C2019-12-14-207 和 No.SYPU-IACUC- C2019- 12-20-107。

1.3 儀器

Chromaster 型高效液相色譜儀，日本Hitachi公司；TSY-1 多功能擴(kuò)散儀，沈陽藥科大學(xué)和延邊大學(xué)聯(lián)合研制；Xiang Yi H-2050R 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；AL-104電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；FE20 型實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；CJJ-6 六聯(lián)磁力攪拌器，上海君竺儀器有限公司；TB-1 實(shí)驗(yàn)用框式涂布器，上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司；SZ-96 自動(dòng)純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠；科德士寵物用電推剪，深圳科德士電子廠；Braun3770 貼面剃須刀，博朗上海有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 生草烏的炮制

根據(jù)《中國藥典》2020年版方法將生草烏進(jìn)行炮制[1]。將生草烏用飲用水沖洗干凈，然后用飲用水浸泡72 h，直至內(nèi)無白干心。將草烏放入沸水中煮5 h，切成2 mm 左右的薄片，放入40 ℃的烘箱中烘干。

2.2 6 種AAs 的提取

根據(jù)文獻(xiàn)方法[8]分別從生草烏和制草烏中提取6 種AAs，用75%乙醇分別溶解生草烏和制草烏粉末（10 mL 溶劑∶1 g 藥材粉末），超聲提取40 min。提取液經(jīng)大孔吸附樹脂柱富集純化，得到的樣品真空干燥。獲得的淡黃色粉末經(jīng)HPLC 分析。生草烏中烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿總量為0.23%，BMA、BAC 和BHA 的總量為0.021%。制草烏中BMA、BAC 和BHA 的總量為0.063%，烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿總量為0.018%，均符合《中國藥典》2020年版標(biāo)準(zhǔn)。AAs 在經(jīng)過富集純化后得到的生草烏提取物粉末和制草烏提取物粉末中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為59.3%、59.1%。經(jīng)過炮制，BAC、BMA和BHA 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別由3.8%、9.2%、0.4%提高至22.7%、32.9%、2.1%，而烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別由19.6%、24.3%、2.0%降低至0.5%、0.6%、0.3%。

2.3 壓敏膠分散型貼劑的制備工藝

采用溶劑蒸發(fā)法分別制備包含生草烏和制草烏提取物的貼片[9]。將生、制草烏提取物及“2.6.2”項(xiàng)中所選6 種化學(xué)滲透增強(qiáng)劑（油酸、LM、CP、POCC、TP、氮酮，用量均為10%）分別按質(zhì)量加入適量乙醇中，室溫下與壓敏膠攪拌2 h，得到混合均勻的藥物-壓敏膠混合物。然后用實(shí)驗(yàn)室涂層裝置將得到的混合物涂在ScotchpakTM9744 防黏層上。將涂好的防黏層在室溫下放置15 min，然后在50 ℃的烘箱中烘15 min 以除去溶劑。然后將背襯（ScotchpakTM9707）覆蓋在烘干后的防黏層上。最后將藥物-壓敏膠層裁剪成0.95 cm2進(jìn)一步使用。

2.4 6 種AAs 分析方法的建立

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。根據(jù)《中國藥典》2020年版稍加修改，流動(dòng)相為乙腈-四氫呋喃（25∶15，A）和0.1 mol/L 醋酸銨（每升純化水中加入冰醋酸0.5 mL，B）；梯度洗脫條件：0～16 min，6%～20% A；16～50 min，20%～25% A；50～60 min，25%～6% A；體積流量1 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積20 μL；檢測波長235 nm。

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密稱取6 種AAs 對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度均為400 μg/mL 的6種對照品的母液，分別精密移取6 種對照品母液各1 mL 置于同一10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得混合對照品溶液。

分別精密移取混合對照品溶液0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 mL 至100 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品系列溶液。照“2.4.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行HPLC 檢測，見圖1。

圖1 6 種AAs 混合對照品 (A)、生草烏樣品 (B) 和制草烏樣品 (C) 的HPLC 圖Fig.1 HPLC of six AAs mixed reference substances (A), AKR sample (B) and AKRC sample (C)

以進(jìn)樣質(zhì)量濃度值為橫坐標(biāo)（X），峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為BMAY＝18 558X＋545.28，R2＝0.999 8，線性范圍0.42～39.91 μg/mL；BACY＝17 127X＋3 667.9，R2＝1.000 0，線性范圍0.41～41.20 μg/mL；BHAY＝14 691X＋2 074.4，R2＝ 0.999 9，線性范圍0.42～40.20 μg/mL；新烏頭堿Y＝18 914X－1 484.5，R2＝0.999 8，線性范圍0.39～39.10 μg/mL；次烏頭堿Y＝16 612X＋3170，R2＝ 0.999 8，線性范圍0.41～41.20 μg/mL；烏頭堿Y＝17 481X－639.5，R2＝0.999 6，線性范圍0.41～39.60 μg/mL；結(jié)果表明6 種AAs 在線性范圍均呈良好線性關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)所用HPLC 的檢測限為0.05 μg/mL。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 配制低、中、高質(zhì)量濃度（1.00、5.00、25.00 μg/mL）的由6 種AAs 組成的混合對照品溶液。在同1 d 平行操作6 次測定3 種不同質(zhì)量濃度混合對照品溶液峰面積，并代入“2.4.2”項(xiàng)中線性回歸方程，求得樣品質(zhì)量濃度，計(jì)算出RSD，得到該方法的日內(nèi)精密度。3 種不同質(zhì)量濃度混合對照品溶液同法連續(xù)測定3 d，根據(jù)相同的方法計(jì)算，即得到該方法的日間精密度。低、中、高質(zhì)量濃度樣品的日內(nèi)精密度RSD 為烏頭堿1.21%、1.75%、1.13%，次烏頭堿1.25%、1.69%、1.81%，新烏頭堿1.32%、1.57%、0.89%，BAC 1.28%、1.87%、1.15%，BHA 1.31%、0.75%、1.93%，BMA 1.26%、1.73%、1.29%；日間精密度RSD 為烏頭堿1.57%、1.16%、1.36%，次烏頭堿1.65%、1.88%、1.21%，新烏頭堿1.42%、1.17%、1.89%，BAC 1.78%、0.67%、1.25%，BHA 1.61%、1.35%、1.83%，BMA 1.86%、1.53%、1.79%。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)分析方法日內(nèi)精密度和日間精密度均達(dá)到分析要求（RSD＜2%）。

人文精神的最終表現(xiàn)為人文關(guān)懷，在悅納自己、理解自己、自尊自愛的基礎(chǔ)上，學(xué)會(huì)理解他人，尊重他人，產(chǎn)生利他心理。這是初中學(xué)生人格發(fā)展的高級(jí)階段，實(shí)際的習(xí)得還需要通過日常的學(xué)習(xí)生活慢慢體會(huì)。在這種情況下，教師就必須對自己的教學(xué)行為有較高的要求，通過建立良好的師生關(guān)系，為學(xué)生樹立一個(gè)“理解他人、尊重他人、關(guān)懷他人”的行為典范，以此凸顯人文精神。例如，教師在教學(xué)之后，可以就某一問題與學(xué)生進(jìn)行討論，主動(dòng)為學(xué)生提供幫助；在學(xué)生提出問題時(shí)應(yīng)明確地、耐心地解答；在課下遇到有困難的學(xué)生應(yīng)給予支持和關(guān)懷等。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將“2.2”項(xiàng)提取出的生、制草烏溶液分別在提取后的0、2、4、8、12、24、36、48 h 在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。生草烏提取液中6 種AAs 峰面積RSD 分別為烏頭堿0.82%、次烏頭堿0.67%、新烏頭堿0.85%、BAC 1.04%、BHA 1.11%、BMA 0.76%。制草烏提取液中6 種AAs 峰面積RSD 分別為烏頭堿1.02%、次烏頭堿0.79%、新烏頭堿0.91%、BAC 1.11%、BHA 1.34%、BMA 1.20%。結(jié)果表明生、制草烏提取液中的6 種AAs 均在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取“2.2”項(xiàng)下同一時(shí)間提取出的生、制草烏溶液6 份，按“2.4.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，生草烏提取液中6 種AAs 質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD 分別為烏頭堿1.01%、次烏頭堿1.15%、新烏頭堿1.22%、BAC 1.38%、BHA 1.21%、BMA 1.36%，制草烏提取液中6 種AAs 質(zhì)量分?jǐn)?shù)RSD 分別為烏頭堿0.91%、次烏頭堿1.19%、新烏頭堿0.98%、BAC 1.05%、BHA 0.84%、BMA 0.96%，RSD 均小于2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含5 mg 6 種AAs的草烏樣品2 g，共9 份，3 份為1 組，分別精密加入含不同質(zhì)量（4、5、6 mg）的6 種AAs 混合對照品溶液。按“2.2”項(xiàng)下的超聲提取40 min 操作，得低、中、高質(zhì)量濃度供試品溶液，在“2.4.1”項(xiàng)色譜條件分析測定，結(jié)果見表1。

2.5 體外經(jīng)皮透過實(shí)驗(yàn)

2.5.1 離體鼠皮的制備和體外透皮實(shí)驗(yàn) 參考本課題組前期研究進(jìn)行透皮實(shí)驗(yàn)[10]。雄性Wistar 大鼠用0.20 mg/mL 烏拉坦iv 麻醉，用寵物修剪器剃除其腹部的粗毛，再用剃須刀剃除殘余的短毛。在麻醉狀態(tài)下將大鼠脫頸椎處死后，立刻用彎剪刀剪下腹部皮膚并去除皮下的脂肪組織。通過顯微鏡檢查皮膚的完整性，用生理鹽水清洗皮膚，-70 ℃冷凍保存，1 周內(nèi)用完。使用多功能透皮擴(kuò)散儀（體積3.5 mL，有效擴(kuò)散面積1.77 cm2）做體外透皮實(shí)驗(yàn)。制備的大鼠皮膚夾在供體室和接收室之間，將皮膚固定在擴(kuò)散池上，角質(zhì)層面向上，以pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液（PBS）為接收液，池內(nèi)置磁力攪拌子，轉(zhuǎn)速約600 r/min，保持透皮儀內(nèi)溫度恒定為32 ℃。在2、4、6、8、10、12、24 h 取2.0 mL 接收液樣品后，立即將相同體積的新鮮接收液加入接收室中，以維持室內(nèi)的漏槽條件。樣品在0 ℃、16 000 r/min 離心7 min，再用HPLC 法分析上清液。計(jì)算藥物單位面積累積滲透量（Qn）。

表1 生草烏和制草烏提取液中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、BAC、BHA 和BMA 的回收率 (n = 3)Table 1 Recoveries of aconitine, hypaconitine, mesaconitine, BAC, BHA and BMA in AKR and AKRC extract (n = 3)

V為擴(kuò)散池的體積（3.5 mL），Vi為每次取樣的體積，Ci和Ci－1分別為第i次和第i－1 次取樣時(shí)接收液中的藥物質(zhì)量濃度，A為有效擴(kuò)散面積（0.95 cm2）

2.5.2 生、制草烏中6 種AAs 的經(jīng)皮滲透性差異比較 在本實(shí)驗(yàn)中，選擇ODO 作為藥物溶劑，因?yàn)镺DO 被證實(shí)對藥物沒有經(jīng)皮滲透增強(qiáng)作用，且溶解度參數(shù)接近壓敏膠（pressure-sensitive adhesive）[11]。分別將提取的生、制草烏粉末過飽和溶解在ODO中，來探究炮制草烏對其6 種AAs 的經(jīng)皮滲透的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有BMA 被檢測到，表明BMA 是6種AAs 中最容易透過皮膚的。此外，BMA 是生草烏和制草烏中最重要的生物活性成分之一。因此，以BMA 24 h 的Qn（Q24）為指標(biāo)來篩選最佳處方。制草烏供給液中BMA 的Q24（5.51±0.69）μg/cm2顯著高于生草烏供給液中BMA 的Q24（2.53±0.31）μg/cm2（P＜0.05）。

2.6 生、制草烏貼劑的處方篩選

2.6.1 壓敏膠的篩選 由于壓敏膠是透皮貼劑的最主要成分之一，在本研究中選擇3 種市售聚丙烯酸酯壓敏膠（DURO-TAK?87-2852、87-4098、87- 2287）進(jìn)行考察。生、制草烏提取物均與壓敏膠以1∶10 的比例混合，分別得到含有10%生、制備草烏提取物的混合物。再將得到的混合物制成透皮貼劑。透皮貼片的Q24見表2。結(jié)果顯示，壓敏膠為DURO-TAK?87-4098 的生、制草烏提取物透皮貼片中BMA 累積滲透量均顯著高于DURO-TAK?87-2287、87-2852。

表2 壓敏膠種類篩選結(jié)果 (± s, n = 4)Table 2 Screening results of pressure-sensitive adhesive type (± s, n= 4)

表2 壓敏膠種類篩選結(jié)果 (± s, n = 4)Table 2 Screening results of pressure-sensitive adhesive type (± s, n= 4)

與處方DURO-TAK? 87-4098 比較：*P＜0.05*P < 0.05 vs DURO-TAK? 87-4098

壓敏膠 生草烏Q2 4 /(μg·cm-制2) 草烏 DURO-TAK? 87-4098 1.36±0.15 3.20±0.15 DURO-TAK? 87-2287 0.91±0.11* 2.11±0.24* DURO-TAK? 87-2852 0.73±0.10* 1.62±0.18*

2.6.2 貼劑中促透劑的篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了6 種滲透促進(jìn)劑（10%）對生、制草烏中BMA 的促透作用。發(fā)現(xiàn)油酸對生、制草烏中的BMA 滲透促進(jìn)作用均最大，滲透增強(qiáng)比（ER）分別為4.57、9.93。進(jìn)一步探索油酸用量對生、制草烏提取物中BMA皮膚滲透性的影響，結(jié)果見表3。10%、15%的油酸用量的Q24均明顯高于5%油酸且10%、15%油酸用量的Q24無顯著性差異。為了減少壓敏膠與化學(xué)促進(jìn)劑潛在副作用，選擇使用10%油酸。

表3 滲透促進(jìn)劑篩選結(jié)果 (± s, n = 4)Table 3 Screening results of permeation enhancers (± s, n = 4)

表3 滲透促進(jìn)劑篩選結(jié)果 (± s, n = 4)Table 3 Screening results of permeation enhancers (± s, n = 4)

處方 生草Q烏24 / (μg·cm制-2草) 烏 生草烏E R制 草烏 10%油酸 6.21±0.88 31.79±4.38 4.57 9.93 10% LM 3.13±0.46 21.54±1.04 2.30 6.73 10% CP 3.28±0.42 13.23±1.83 2.41 4.13 10% POCC 2.56±0.35 5.34±0.78 1.88 1.67 10% TP 2.33±0.36 4.21±0.57 1.71 1.32 10%氮酮 1.92±0.26 3.75±0.43 1.41 1.16 空白組 1.36±0.15 3.21±0.16 1.00 1.00 5%油酸 3.12±0.38 16.86±2.13 2.29 5.27 15%油酸 6.87±0.79 33.57±4.45 5.05 10.49

表4 生、制草烏貼劑的最佳處方Table 4 Optimal formulation of patches of AKR and AKRC extract

2.7 含生、制草烏提取物的透皮貼劑的藥效學(xué)比較研究

2.7.1 抗炎活性評(píng)估 采用CFA 誘導(dǎo)的大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型來評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)透皮貼片的抗炎活性。取雄性Wistar 大鼠30 只，隨機(jī)分為5 組，每組6只。按如下方式處理：（1）空白對照組：不給予貼劑；（2）陰性對照組：給予不含藥物的空白貼片（30 cm2）；（3）陽性對照組：給予雙氯芬酸二乙胺貼劑（6 cm2，含雙氯芬酸二乙胺14.70 mg）；（4）生草烏貼劑：給予生草烏透皮貼劑（30 cm2，含AAs 17.30 mg）；（5）制草烏貼劑：給予制草烏透皮貼劑（30 cm2，含AAs 17.30 mg）。注射CFA 前測量大鼠雙側(cè)后爪的體積作為基線值。空白對照組大鼠的雙側(cè)后爪注射生理鹽水0.1 mL，其他組分別注射CFA 0.1 mL。注射CFA 后，在0.5、3、5、7、9、11 d 測量足爪體積。在第5 天，除空白對照組外，其余組均在大鼠腹部皮膚上貼上對應(yīng)的透皮貼片，貼敷7 d。各組大鼠足腫脹度（S）按下式計(jì)算。

其中Vn和Vt分別是大鼠注射CFA 前后的足趾體積

貼片的抗炎作用如圖2 所示。雖然這些貼片是應(yīng)用于非炎癥區(qū)域的，但是與陰性對照組相比，陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組在9 d 和11 d 仍表現(xiàn)出明顯抑制爪腫脹效應(yīng)（P＜0.05）。此外，制草烏組的抗炎作用明顯優(yōu)于生草烏組（P＜0.05）。各組間兩側(cè)后足抑腫程度比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。因此，炮制增強(qiáng)了草烏貼劑的抗炎作用，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證局部應(yīng)用生、制草烏透皮貼劑后，AAs 主要通過血液循環(huán)傳遞藥物至關(guān)節(jié)組織，從而達(dá)到治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用[12]。

圖2 造模后左、右后足足趾腫脹度變化曲線 (n = 6)Fig.2 Profiles of swelling degree of left and right feet after CFA injection (n = 6)

2.7.2 鎮(zhèn)痛作用評(píng)估 采用小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)探究生、制草烏貼片的鎮(zhèn)痛作用差異。選用體質(zhì)量在18～22 g 雄性KM 小鼠50 只。在小鼠腹部相同位置剃毛，給藥前不麻醉。將小鼠隨機(jī)分為5 組，每組10 只，按如下處理：（1）空白對照組：不給藥；（2）陰性對照組：給予不含藥物的空白貼片（4.5 cm2）；（3）陽性對照組：給予雙氯芬酸二乙胺貼劑（4.5 cm2，雙氯芬酸二乙胺11.05 mg）；（4）生草烏貼劑組：給予生草烏透皮貼劑（4.5 cm2，AAs 2.6 mg）；（5）制草烏貼劑組：給予制草烏透皮貼劑（4.5 cm2，AAs 2.6 mg）。給藥3 h 后，去除貼劑，將每只小鼠ip 0.2 mL 醋酸溶液（1%）以引起扭體反應(yīng)，并記錄20 min 內(nèi)的扭體次數(shù)（W），計(jì)算疼痛抑制率來評(píng)估止痛效果。一般認(rèn)為，疼痛抑制率高于50%，表明鎮(zhèn)痛制劑是有效的[13]。如表5 所示，生、制草烏組與空白對照組相比均顯著減少了扭體次數(shù)（P＜0.05）。而且發(fā)現(xiàn)制草烏貼劑的鎮(zhèn)痛效果比生草烏貼劑更顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，炮制增強(qiáng)了草烏貼劑的鎮(zhèn)痛作用。

Wc和Wt分別是空白對照組和實(shí)驗(yàn)組的平均扭體次數(shù)

表5 生、制草烏貼劑對醋酸所致疼痛的鎮(zhèn)痛作用 (± s,n = 10)Table 5 Analgesic effect of AKR patch and AKRC patch on pain induced by acetic acid (± s, n = 10)

表5 生、制草烏貼劑對醋酸所致疼痛的鎮(zhèn)痛作用 (± s,n = 10)Table 5 Analgesic effect of AKR patch and AKRC patch on pain induced by acetic acid (± s, n = 10)

與空白對照組比較：*P＜0.05；與生草烏組比較：#P＜0.05*P < 0.05 vs blank control group; #P < 0.05 vs AKR group

組別 劑量/mg W 疼痛抑制率/% 空白對照 - 45±10 - 陰性對照 - 40±8 11.8 陽性對照 11.05 8±4* 83.4 生草烏 2.60 18±4* 61.8 制草烏 2.60 6±3*# 87.3

3 討論

多年來，草烏因其顯著的藥效和不良反應(yīng)受到人們的關(guān)注。更是許多中藥處方的主要成分[14]。烏頭堿、HAC 和MAC 是草烏的主要有毒成分。在之前的研究中僅證明炮制草烏可以降低其毒性[15]。然而，炮制草烏是否也能改善其中6 種主要AAs 的經(jīng)皮吸收，并提高其療效仍不清楚。在本研究中，將草烏制成貼劑，使其緩慢和少量地進(jìn)入體內(nèi)，這增加了藥物的安全性和藥效持續(xù)時(shí)間。

然而，以往的文獻(xiàn)很少提及AAs 在草烏中的透皮滲透性差異。因?yàn)樗幬镌谄つw中的擴(kuò)散是被動(dòng)擴(kuò)散，依賴于濃度梯度，而且藥物的相對分子質(zhì)量越小，越容易滲透到皮膚中[16]。而BMA 在生、制草烏中是最豐富的成分之一，在AAs 中相對分子質(zhì)量僅大于BHA。因此，推測BMA 在AAs 具有最強(qiáng)的透皮滲透性。通過藥物溶液的體外透皮實(shí)驗(yàn)證實(shí)了此猜想。

本實(shí)驗(yàn)考察了貼劑中壓敏膠種類、化學(xué)促透劑種類及其濃度、藥物含量對生、制草烏提取物經(jīng)皮滲透量的影響。其中 DURO-TAK?87-2287 和DURO-TAK?87-2852 2 個(gè)壓敏膠均顯著低于DURO-TAK?87-4098 的Q24。這可能因?yàn)檫@2 種壓敏膠中的羥基和羧基與BMA 中的羥基存在氫鍵相互作用，使BMA 從壓敏膠中的釋放能力降低[9]。油酸是考察的6 種化學(xué)促透劑中效果最好的，原因可能是油酸中的羧基與BMA 的羥基形成氫鍵，破壞了DURO-TAK?87-4098 壓敏膠中的酯基與BMA的羥基之間的氫鍵相互作用，從而促進(jìn)貼劑中的藥物釋放[17]。

由于BMA 呈堿性，可與油酸形成離子對，形成了中性分子，從而增強(qiáng)其經(jīng)皮滲透性。此外，油酸可與角質(zhì)層的細(xì)胞間脂質(zhì)相互作用，破壞脂質(zhì)排列，從而增加細(xì)胞間脂質(zhì)的流動(dòng)性，增強(qiáng)藥物的經(jīng)皮滲透能力[9]。雖然通過溶液系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)只能檢測到BMA，但仍需要對最佳貼劑中其他5 種AAs 的累積透皮量進(jìn)行測定。

在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)含制草烏提取物最佳貼片中AAs 的Q24約為含生草烏提取物最佳貼片的2 倍。因?yàn)樵诓轂跖谥坪?，在本?shí)驗(yàn)所用的擴(kuò)散池模型中幾乎不吸收的毒性AAs 含量降低，而在AAs 中具有最強(qiáng)透皮性BMA 含量增加，從而增強(qiáng)了草烏中AAs 的經(jīng)皮透過量。因此，炮制草烏不僅降低了毒性AAs 的含量，而且促進(jìn)了AAs 的經(jīng)皮吸收。對于透皮貼劑，藥物經(jīng)皮吸收的結(jié)果通常與體內(nèi)治療效果密切相關(guān)，活性藥物成分累積滲透量越多，通常治療效果好[18]。因此，AAs 經(jīng)皮滲透量較高的制草烏貼劑的鎮(zhèn)痛和抗炎效果應(yīng)優(yōu)于生草烏貼劑，該推論在藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證。因此，炮制草烏不僅可以提高其用藥安全性，而且可以提高在皮膚外部使用草烏時(shí)的有效性。

本實(shí)驗(yàn)制備了分別含有生、制草烏提取物的壓敏膠分散型透皮貼片，顯示出良好的鎮(zhèn)痛抗炎作用。而且，發(fā)現(xiàn)BMA 在AAs 中具有最強(qiáng)的經(jīng)皮滲透性。因此，炮制草烏提高了草烏貼片的有效性和安全性。制備的含制草烏提取物的透皮貼片可作為治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的候選藥物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突