石淋通顆粒HPLC指紋圖譜研究

占麗琴 馬杰 羅艷

【摘 要】 目的：建立石淋通顆粒HPLC指紋圖譜 并進(jìn)行分析。方法：Agilent zorbax SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm 5 μm）;乙腈-0.4%磷酸水為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)335 nm;柱溫30 ℃。測(cè)定20批石淋通顆粒的指紋圖譜 運(yùn)用相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)、SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析。結(jié)果：構(gòu)建了由10個(gè)共有峰組成的石淋通顆粒HPLC指紋圖譜 指認(rèn)了夏佛塔苷、異夏佛塔苷、新西蘭牡荊苷2三成分 20批次石淋通顆粒的指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度均在0.990以上。 結(jié)論：所建立的指紋圖譜專屬性強(qiáng) 重現(xiàn)性好 能夠?yàn)樵撝苿┑馁|(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 石淋通顆粒;指紋圖譜;夏佛塔苷

Abstract：Objective The HPLC fingerprint of Shilongtong granules was established and analyzed. Methods Agilent zorbax SB-C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm）; Acetonitrile-0.4% phosphoric acid water was eluted equally in mobile phase; Detection wavelength： 335nm; Column temperature： 30 ℃. The fingerprints of 20 batches of Shilintong granules were measured and analyzed by using the similarity evaluation system and SPSS 22.0 software. Results The HPLC fingerprint of Shilintong granules composed of 10 characteristic peaks was constructed， and the three components of Xiafutarin， Isafutarin and New Zealand vitex 2 were identified， The similarity between fingerprints of 20 batches of Shilongtong granules and control fingerprints was above 0.990. Conclusion The established fingerprint has strong specificity and good reproducibility， which can provide the basis for the quality evaluation of this preparation.

Keywords：Shilintong Granules; Fingerprint; Schaftoside

石淋通顆粒為廣金錢草經(jīng)提取加工制成 具有清濕熱、利尿、排石的作用 用于尿路結(jié)石、腎盂腎炎、膽囊炎[1]?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第八冊(cè)及國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-1520-93-1、WS3-B-1520-93-2 、WS3-B-1520-93-3、WS-11044（ZD-1044）-2002-2011Z、國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)修訂批件2000ZFB 0058所附石淋通顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等5個(gè)注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn) 檢驗(yàn)項(xiàng)目較少 無(wú)法全面評(píng)價(jià)其質(zhì)量。而有關(guān)文獻(xiàn)僅對(duì)廣金錢草進(jìn)行夏佛塔苷、總黃酮的含量測(cè)定[2-3]。中藥制劑的成分復(fù)雜 在質(zhì)量控制中采用單一或幾個(gè)成分難以控制其整體質(zhì)量[4-6]。故本實(shí)驗(yàn)建立HPLC指紋圖譜 并確定其中幾個(gè)共有峰的成分 從整體上控制該制劑的整體質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀;AE200 型電子分析天平（德國(guó)梅特勒公司）;KQ-300TZ型超聲波清洗器（300W 30KHZ）;UV-TOC/UF型超純水系統(tǒng)（賽默飛）。 石淋通顆粒來(lái)自20家不同醫(yī)藥公司生產(chǎn)的20批次樣品 編號(hào)S1-S20 批號(hào)：171004、171003、170902、17070008、171002、17110032、1710006、1709009、170301、20170601、1710020、170502、171001、170902、20171110、667001、1709261、20170201、171201、170801）;廣金錢草（批號(hào)：121248-201104） 、夏佛塔苷（批號(hào)：111912-201703）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;新西蘭牡荊苷2（批號(hào)：B21399）、異夏佛塔苷（批號(hào)：B21563）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。乙腈為色譜純;其他試劑均為分析純;水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）;流動(dòng)相：乙腈（A）-0.4%磷酸水（B） 等度洗脫;流速：1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：335 nm;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別取新西蘭牡荊苷2、夏佛塔苷、異夏佛塔苷對(duì)照品適量 精密稱定 加80%甲醇制成濃度分別為13.52 μg/mL、33.04 μg/mL、26.02 μg/mL的溶液 作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品適量（相當(dāng)于廣金錢草2 g） 研細(xì) 精密稱定 置具塞錐形瓶中 精密加80%甲醇25 mL 稱定重量 超聲處理30 min 放冷 再稱定重量 用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量 搖勻 濾過(guò) 取續(xù)濾液 即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL 在 “2. 1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)測(cè)定6次 記錄色譜圖 以夏佛塔苷峰為參照峰 計(jì)算其他特征峰的相對(duì)保留時(shí)間 結(jié)果均小于1.0% 說(shuō)明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批石淋通顆粒 按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液 各精密吸取10 μL 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6次測(cè)定 記錄色譜圖 以夏佛塔苷為參照峰 計(jì)算其他特征峰的相對(duì)保留時(shí)間 結(jié)果均小于1.0% 說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL 在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下于配制后的0、4、8、12、20、24 h進(jìn)樣測(cè)定 記錄色譜圖 以夏佛塔苷為參照峰 計(jì)算其他特征峰的相對(duì)保留時(shí)間 結(jié)果均小于2.0% 說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與分析

2.4.1 石淋通顆粒指紋圖譜的建立與相似度評(píng)價(jià) 取20批石林通顆粒 依“2.2.2” 項(xiàng)方法制備供試品溶液并進(jìn)樣測(cè)定 記錄圖譜 標(biāo)記為S1～S20。20批樣品共標(biāo)出10個(gè)共有峰 經(jīng)與對(duì)照品比對(duì) 指認(rèn)3個(gè)特征峰 分別為新西蘭牡荊苷2（3號(hào)峰）、夏佛塔苷（7號(hào)峰）、異夏佛塔苷（10號(hào)峰） 以7號(hào)峰作為參照峰（S） 計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積 見圖1、表1、表2。

將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012年版） 以S1（171004）樣品為參照 經(jīng)過(guò)多點(diǎn)校正和數(shù)據(jù)匹配后 平均值法生成對(duì)照指紋圖譜R 與對(duì)照指紋圖譜比較20批石淋通顆粒的相似度數(shù)據(jù) 相似度均大于0.990 說(shuō)明石淋通顆粒的質(zhì)量穩(wěn)定 見表3。

2.4.2 石淋通顆粒指紋圖譜的聚類分析 以所得20批樣品指紋圖譜的10個(gè)共有峰的峰面積為變量 導(dǎo)入SPSS 22.0軟件 選用平均組間連接聚類方法 以平方歐式距離法作為樣品間距離計(jì)算方法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析 結(jié)果如圖2所示。當(dāng)分類距離為20時(shí) 20批次石淋通顆?？梢苑譃?大類 S4、S12、S13、S17、S19號(hào)樣品聚為一類;其余樣品聚為一類。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 分別比較甲醇、80%甲醇、50%甲醇的提取效果。結(jié)果表明 80%甲醇的提取溶液中的色譜峰較其他2種提取溶液中的色譜峰更為豐富 因此選擇80%甲醇為提取溶劑。同時(shí)參考廣金錢草在《2015版中國(guó)藥典一部》的含量測(cè)定方法 采用超聲震蕩的提取方法。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 使用PDA檢測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行210～400 nm的全波長(zhǎng)掃描 并對(duì)各波長(zhǎng)下的色譜圖進(jìn)行分析比較。結(jié)果表明 在335 nm下檢測(cè)到峰的數(shù)目較多 各峰分離良好 特征峰明顯且峰形較好 從圖譜中可以盡可能的獲取色譜組分信息以反映體系組成的全貌 因此選定335 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇 由于石淋通顆粒化學(xué)成分簡(jiǎn)單 劑型范圍小 故選擇等度洗脫。在流動(dòng)相的篩選中 考察了乙腈-0.4%磷酸水系統(tǒng)、甲醇-0.4%磷酸水系統(tǒng)。結(jié)果顯示 乙腈-0.4%磷酸水系統(tǒng)的基線更穩(wěn)定 色譜峰個(gè)數(shù)較多 且擁有較好的分離度 因此選擇乙腈-0.4%磷酸水系統(tǒng)為HPLC分析的流動(dòng)相系統(tǒng)。

3.4 色譜柱的選擇 考察3種不同型號(hào)色譜柱：Ecosil C18 （250 mm×4.6 mm×5 μm）、Agilent zorbax SB-C18 （250 mm×4.6 mm×5 μm）、Apollo C18（250 mm×4.6 mm×5 μm） 結(jié)果表明Agilent zorbax SB-C18 （250 mm×4.6 mm×5 μm）柱分離出的色譜峰分離度好 峰數(shù)多 穩(wěn)定性好 故選擇Agilent zorbax SB-C18柱為分析色譜柱。

3.5 參照峰的選擇 廣金錢草標(biāo)準(zhǔn)收錄于《中國(guó)藥典》（2015年版一部） 其含量測(cè)定項(xiàng)目的指標(biāo)成分為夏佛塔苷。石淋通顆粒為廣金錢草的單方制劑 本研究建立的指紋圖譜10個(gè)特征峰中夏佛塔苷的峰面積最大、峰形好 與廣金錢草的指標(biāo)成分一致 最后選擇夏佛塔苷為參照峰（S峰）。在下一階段研究中 可以參考廣金錢草中夏佛塔苷的含量 對(duì)本制劑中的夏佛塔苷進(jìn)行定量研究。

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用HPLC法建立了石淋通顆粒的指紋圖譜 基本反映了該品種的化學(xué)成分全貌 為全面控制石淋通顆粒的質(zhì)量提供一個(gè)新方法。通過(guò)對(duì)指紋圖譜的分析 確定了10個(gè)特征峰 以夏佛塔苷的峰為參照峰（S峰） 計(jì)算各特征峰與S峰的相對(duì)保留時(shí)間 其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%以內(nèi)。具體規(guī)定值為：0.41（峰1）、0.57（峰2）、0.61（峰3）、0.65（峰4）、0.70（峰5）、0.862（峰6）、1.000（峰7，S）、1.237（峰8）、1.289（峰9）、1.455（峰10）。

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（收稿日期：2020-09-08 編輯：陶希睿）