香附藥材HPLC指紋圖譜研究

蔣莉娟+++皮勝玲++方鐵錚+++姚江雄++++許招懂++++林麗美

[摘要] 目的 建立香附藥材HPLC指紋圖譜，結(jié)合化學(xué)計(jì)量手段，對(duì)多批次藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。 方法 以Kromasil 100-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇（A）-水（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫25℃，對(duì)10批藥材樣品進(jìn)行相似度分析、聚類分析和主成分分析。 結(jié)果 建立了香附藥材專屬性的HPLC指紋圖譜，標(biāo)示了16個(gè)共有指紋峰，10批樣品分為3大類。 結(jié)論 將HPLC指紋圖譜與化學(xué)計(jì)量手段相結(jié)合，可有效對(duì)香附藥材進(jìn)行真?zhèn)舞b別和質(zhì)量評(píng)價(jià)，為提高其整體質(zhì)量控制提供參考。

[關(guān)鍵詞] 香附；高效液相色譜法；指紋圖譜；相似度評(píng)價(jià)；聚類分析；主成分分析

[中圖分類號(hào)] R927.11 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）01（a）-0004-04

S 香附為莎草科植物莎草（Cyperus Rotundus L.）的干燥根莖，具有疏肝解郁、理氣寬中、調(diào)經(jīng)止痛的功效，用于治療肝郁氣滯所致的胸脅脹痛、疝氣疼痛、乳房脹痛、脾胃氣滯、脘腹痞悶、脹滿疼痛、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)之癥，為婦科常用藥[1]?！侗静菥V目》稱之為“氣病之總司，女科之主帥”，主產(chǎn)于山東、浙江、湖南、河南等地，以山東為道地藥材。香附主要含揮發(fā)油類成分，此外還有萜類、黃酮類、酚類、生物堿等化合物[2]。現(xiàn)代藥理研究顯示，香附具有抗炎、抗血小板、降血糖、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗過(guò)敏等作用[3]。指紋圖譜是基于對(duì)中藥物質(zhì)群整體作用的認(rèn)識(shí)，借助于波譜和色譜等技術(shù)獲得中藥化學(xué)成分的光譜或色譜圖，是實(shí)現(xiàn)鑒別中藥真實(shí)性、評(píng)價(jià)質(zhì)量一致性和產(chǎn)品穩(wěn)定性的可行模式，具有信息量大、特征性強(qiáng)、整體性和模糊性等特點(diǎn)[4]。本研究采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）對(duì)10批香附藥材進(jìn)行研究并建立指紋圖譜，旨在為香附藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

KQ-100B型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；T-214型電子分析天平（Denver公司）；Waters e2695高效液相色譜系統(tǒng)，Empower工作站，含四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器（Waters公司）。

1.2 材料

甲醇（Honeywell公司，色譜純）；水為超純水（實(shí)驗(yàn)室制備）。α-香附酮對(duì)照品（批號(hào)：110748200507）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用。10份不同批次或產(chǎn)地的香附藥材樣品均由廣州星群（藥業(yè)）股份有限公司提供，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物教研室王智老師鑒定為莎草科植物莎草的干燥根莖，具體信息見(jiàn)表1。

表1 香附藥材樣品來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B）為流動(dòng)相系統(tǒng)梯度洗脫（0～45 min，40%→80%A；45～60 min，80%A）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：10 μl。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取α-香附酮對(duì)照品適量，加甲醇溶解定容至10 ml，得到濃度為0.0261 mg/ml的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取香附藥材粉末（過(guò)60目篩）約1 g，精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 ml，密塞，稱重，超聲處理（功率160 W，頻率59 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一批（XG140501）藥材粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定指紋圖譜。以7號(hào)峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算樣品中所含16個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.003%～0.130%，相對(duì)峰面積的RSD為0.15%～2.10%，提示儀器的精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（20111201）藥材粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣6次，測(cè)定指紋圖譜?？疾鞓悠分兴?6個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%～0.48%，相對(duì)峰面積的RSD為0.01%～2.77%，提示方法的重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1份（20111201）藥材粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、15、24 h測(cè)定指紋圖譜，考察樣品中所含16個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.10%～0.63%，相對(duì)峰面積的RSD為0.33%～2.74%，提示香附藥材樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 指紋圖譜共有模式的建立 取10批藥材粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μl，記錄HPLC色譜圖（圖1）。采用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2.0版）進(jìn)行分析，生成共有模式指紋圖譜（圖2），其中以峰7為參照物，其余各共有峰與峰7的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積見(jiàn)表2、表3。

2.5.2 共有峰的確定 10批香附生成的對(duì)照指紋圖譜標(biāo)定了16個(gè)共有峰，具體見(jiàn)圖2。對(duì)照品溶液的色譜圖見(jiàn)圖3，經(jīng)與對(duì)照品對(duì)照，指認(rèn)15號(hào)峰為α-香附酮。

2.5.3 指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià) 上述10批香附藥材相似度計(jì)算結(jié)果依次為0.999、0.988、0.966、0.996、0.981、 0.771、0.997、0.913、0.996、0.975，除批次為20111201的香附藥材相似度為0.771外，其余批次相似度均>0.9，提示香附藥材樣品具有良好相似性。

2.6 聚類分析

將10批香附藥材HPLC指紋圖譜中16個(gè)色譜峰的峰面積與樣品號(hào)建立矩陣，導(dǎo)入SPSS軟件，采用組間聯(lián)接法，以歐氏距離的平方為測(cè)度，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，得到香附藥材的聚類分析圖（圖4）。結(jié)果顯示，10批樣品可分為三大類，S1、S2、S3、S4、S6、S7、S8、S9聚為一類，S5、S10分別單獨(dú)聚為一類。聚類結(jié)果顯示，藥材各批次間成分總體差異較小。

2.7 主成分分析

采用SPSS軟件對(duì)10批香附藥材樣品進(jìn)行主成分分析，具體見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，S1、S2、S3、S4、S6、S7、S8、S9集中分布在一個(gè)區(qū)域，各樣品相互之間距離較近；S5、S10與其他樣品相距較遠(yuǎn)，樣品可分為3大類。該圖直接反映了各批次樣品之間的差異大小，與聚類分析結(jié)果一致。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)比較了245、254、265、300和320 nm波長(zhǎng)下的色譜圖[5-9]，結(jié)果在254 nm檢測(cè)條件下出峰較多，各峰吸收均勻，峰形較好，故選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-0.5%冰乙酸水、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.5%冰乙酸水不同流動(dòng)相體系[10-14]，結(jié)果顯示甲醇-水能對(duì)樣品中各成分實(shí)現(xiàn)較好的分離，因此流動(dòng)相組成選擇甲醇-水；還考察了25、30、35℃柱溫條件下各色譜峰的分離情況，結(jié)果顯示，不同柱溫下色譜峰略有區(qū)別，當(dāng)溫度升高時(shí)，部分峰發(fā)生相對(duì)位移與合并，使分離度降低，因此選擇柱溫25℃；此外，本實(shí)驗(yàn)比較了Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm）、LiChrospher■100 RP-18 endcapped（5 μm）Hibar■RT 250-4.6、Athena C18120A（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）4種不同型號(hào)的色譜柱，結(jié)果顯示，Kromasil柱各色譜峰的分離度、峰形較其他色譜柱好，因此本實(shí)驗(yàn)選擇Kromasil色譜柱。

3.2 提取方法的考察

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)提取溶劑（甲醇、50%甲醇、75%甲醇、乙醇、50%乙醇、75%乙醇）、提取方式（超聲、加熱回流）、提取時(shí)間（15、30、45、60 min）及提取體積（10、20、25、30 ml）進(jìn)行了考察[15-18]，基于出峰數(shù)目和峰面積最終選用甲醇超聲提取30 min，提取體積10 ml，該方法提取較為完全，提取效率最高。

3.3 相似度結(jié)果分析

10批不同批次或產(chǎn)地的香附藥材HPLC指紋圖譜相似度較高，除批次20111201的香附藥材相似度為0.771外，其余批次的相似度均>0.9，提示藥材主要成分構(gòu)成基本一致，藥材質(zhì)量穩(wěn)定。主成分分析與聚類分析的結(jié)果相互佐證，結(jié)果一致，藥材樣品可聚為三類，S3和S10與其他樣品相距較遠(yuǎn)，提示三類藥材質(zhì)量存在一定差異。

3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

不同批次或產(chǎn)地的香附藥材HPLC指紋圖譜既有共性又存在差異，主要色譜峰的整體面貌基本一致，但各峰峰面積有所不同，這說(shuō)明環(huán)境因素會(huì)對(duì)藥材質(zhì)量產(chǎn)生一定影響，是否與生長(zhǎng)環(huán)境、土壤條件等因素有關(guān)有待進(jìn)一步考察[19-21]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用指紋圖譜和聚類分析、主成分分析相結(jié)合的方法進(jìn)行研究，能夠更全面、準(zhǔn)確地判別藥材的真?zhèn)闻c優(yōu)劣，可有效用于香附藥材的質(zhì)量控制與鑒定。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：241.

[2] 周中流，尹文清，張華林，等.香附化學(xué)成分研究[J].中草藥，2013，44（10）：1226-1230.

[3] 徐曉婷，鄧志鵬，仲浩，等.香附化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].齊魯藥事，2012，31（8）：473-475.

[4] 李強(qiáng)，杜思邈，張忠亮，等.中藥指紋圖譜技術(shù)進(jìn)展及未來(lái)發(fā)展方向展望[J].中草藥，2013，44（22）：3095-3102.

[5] 盧君蓉，李文兵，王世宇，等.香附醋制前后香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮的含量比較[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（20）：24-27.

[6] 王世宇，李文兵，盧君蓉，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地香附藥材中香附烯酮、圓柚酮和α-香附酮[J].中成藥，2015，37（3）：588-591.

[7] 季寧平，盧君蓉，李文兵，等.不同醋制方法對(duì)香附中指標(biāo)成分含量的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21（7）：5-7.

[8] 徐媛，張文娟，王慶偉，等.香附不同炮制品HPLC指紋圖譜研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，8（31）：29-32.

[9] 高景莘，夏厚林，吳遠(yuǎn)波.香附藥材HPLC指紋圖譜研究及相似度評(píng)價(jià)[J].中國(guó)中醫(yī)藥咨訊，2010，2（14）：240-241.

[10] 趙新慧，宿樹(shù)蘭，段金廒，等.香附藥材質(zhì)量相關(guān)性分析研究[J].藥物分析雜志，2008，28（2）：187-192.

[11] 童黃錦，白發(fā)平，汪小莉，等.不同產(chǎn)地白芍藥材的指紋圖譜研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，29（9）：1326-1329.

[12] 徐昌艷，張麗艷，汪毅，等.苗藥矮地茶的HPLC指紋圖譜研究[J].中藥材，2014，37（9）：1570-1573.

[13] 孫蓮，嚴(yán)寒信，賈曉琴.HPLC同時(shí)測(cè)定蕪菁子藥材中槲皮素和山奈酚含量及其指紋圖譜的研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2014，31（11）：1347-1351.

[14] 閔會(huì)，吳健，胡江寧，等.不同貝母的指紋圖譜鑒別研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（34）：12051-12052.

[15] 魏剛，順慶生，戴亞峰，等.霍山石斛HPLC特征圖譜研究[J].中成藥，2014，36（12）：2642-2644.

[16] 焦豪妍，王英，陳麗莉，等.廣東道地藥材何首烏HPLC指紋圖譜研究[J].中國(guó)藥業(yè)，2014，23（23）：58-61.

[17] 何卓琳，王帥，孟憲生，等.基于指紋圖譜的益母草膠囊質(zhì)量控制方法研究[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2013，20（32）：7-9.

[18] 毛健，劉振杰.余甘子葉藥材的 HPLC 指紋圖譜研究[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2014，21（17）：11-14.

[19] 王黎，高蘇亞，李華.不同產(chǎn)地葛根的HPLC指紋圖譜及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（18）：10782-10784.

[20] 甘秀海，梁志遠(yuǎn)，姜金仲，等.冷水花藥材的HPLC指紋圖譜研究及指標(biāo)成分含量測(cè)定[J].中藥材，2015，38（2）：275-278.

[21] 孫冬梅，丘思蘭，李素梅，等.銀杏葉藥材HPLC指紋圖譜研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2015，42（2）：366-368.

（收稿日期：2015-08-12 本文編輯：祁海文）