FBXW7α對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中熱休克轉(zhuǎn)錄因子1表達(dá)和定位的影響

孫傲，焦寒，付杰軍

0 引言

熱休克轉(zhuǎn)錄因子1（heat shock transcription factor 1,HSF1）是調(diào)控?zé)嵝菘说鞍祝╤eat-shock proteins,HSPs）表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。細(xì)胞未受刺激時(shí)，HSF1以單體形式在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間穿梭，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，游離的HSF1以三聚體的形式磷酸化，并入核誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄[1]，在熱激過(guò)程中Ser326位點(diǎn)的HSF1磷酸化可以正向調(diào)控轉(zhuǎn)錄。在此期間，HSF1與錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)被蛋白酶體降解，并延遲熱休克反應(yīng)的衰減直到清除受損的蛋白質(zhì)為止[2]。

FBXW7（F-box and WD repeat domain containing 7）是F-box家族的重要成員之一，為SCF（SKP1-Cullin1-F-box）E3泛素連接酶復(fù)合物的靶蛋白識(shí)別組分[3]。FBXW7是繼K-RAS和APC之后研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中最常見(jiàn)的突變基因之一[4]。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中FBXW7的表達(dá)水平低于正常組織，其失活會(huì)誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生[5]。約7.5%的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸腺癌患者中發(fā)現(xiàn)FBXW7錯(cuò)義突變，與結(jié)直腸癌不良預(yù)后有關(guān)[6]。FBXW7介導(dǎo)多種癌蛋白的降解，如NF-κB、c-Myc、Cyclin E、Notch1、c-Jun和Brg1等[7]。FBXW7位于人4號(hào)染色體長(zhǎng)臂（4q31.3）上，分為FBXW7α、FBXW7β和FBXW7γ三個(gè)亞型，其中FBXW7α位于細(xì)胞核中，F(xiàn)BXW7β位于細(xì)胞質(zhì)中，而FBXW7γ位于核仁中[8]。FBXW7α通過(guò)與GSK3β激活的Ser303和Ser307位點(diǎn)磷酸化HSF1結(jié)合，介導(dǎo)HSF1泛素化降解。有研究發(fā)現(xiàn)缺失FBXW7α導(dǎo)致黑色素瘤細(xì)胞核HSF1蛋白表達(dá)水平明顯升高，而對(duì)細(xì)胞質(zhì)HSF1表達(dá)沒(méi)有影響[9]。然而，F(xiàn)BXW7對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞胞質(zhì)和胞核內(nèi)的HSF1在熱刺激后及未刺激狀態(tài)下的表達(dá)定位的調(diào)控尚不清楚。本研究利用細(xì)胞免疫熒光法觀察敲除FBXW7對(duì)溫?zé)岽碳ぜ盎謴?fù)期間HSF1在胞質(zhì)和胞核中的定位的影響，明確FBXW7在HSF1及激活的HSF1在胞核中的表達(dá)定位的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及試劑

人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116、DLD1 及HCT116 WT、HCT116 FBXW7 KO、DLD1 WT及DLD1 FBXW7 KO、真核表達(dá)質(zhì)粒PcDNA3-HAFBXW7α[10]均由美國(guó)哈佛醫(yī)學(xué)院貝斯以色列女執(zhí)事醫(yī)療中心病理系魏文毅教授饋贈(zèng)。FBXW7基因敲除的HCT116和DLD1細(xì)胞由Bert Vogelstein和Christoph Lengauer構(gòu)建，得到Bert Vogelstein的饋贈(zèng)[11]。主要通過(guò)利用細(xì)菌人工染色體（BAC）系統(tǒng)進(jìn)行基因克隆，并通過(guò)Cre/loxP敲除系統(tǒng)和單克隆細(xì)胞篩選獲得FBXW7基因敲除的HCT116和DLD1細(xì)胞[12]。結(jié)直腸癌細(xì)胞均用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、Opti-MEM減血清培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，BCA試劑盒（貨號(hào)P0011）及蛋白質(zhì)提取相關(guān)試劑均購(gòu)自上海碧云天公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000（貨號(hào)L3000075）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)直腸癌細(xì)胞株DLD1接種于6個(gè)60 mm的培養(yǎng)皿中，接種密度以過(guò)夜培養(yǎng)后細(xì)胞融合度為70%～90%為準(zhǔn)。按照Lipofectamine3000說(shuō)明書(shū)提供的操作流程，以O(shè)pti-MEM減血清培養(yǎng)基配制轉(zhuǎn)染試劑及質(zhì)粒工作液，將PcDNA3-HA-FBXW7α真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入DLD1細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染6 h后更換含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 Western blot法檢測(cè)過(guò)表達(dá)FBXW7α基因?qū)SF1蛋白表達(dá)水平的影響

收集轉(zhuǎn)染24 h后的DLD1細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液RIPA提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，通過(guò)10%SDS-PAGE分離蛋白，采用90V電壓將分離蛋白條帶轉(zhuǎn)移到活化的PVDF膜。用含5%脫脂牛奶的TBST溶液封閉膜1.5 h，然后加入兔抗人HSF1（CST，貨號(hào)4356，1:1000）、兔抗人pHSF1Ser326單克隆抗體（Invitrogen，貨號(hào)MA5-32105，1:1000）及鼠抗人β-actin（CST，貨號(hào)3700，1:1000）、HA（Sigma，貨號(hào)H9658，1:1000）單克隆抗體4℃孵育過(guò)夜；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（CST，貨號(hào)7076，1:5000）及羊抗兔 IgG（CST，貨號(hào)7074，1:5000）。滴加化學(xué)發(fā)光HRP底物ECL發(fā)光液（Millipore，貨號(hào)WBKLS0500），使用MiniChemi 610Plus型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Western blot法檢測(cè)FBXW7對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中HSF1蛋白表達(dá)的影響

收集HCT116WT、HCT116 FBXW7 KO、DLD1 WT及DLD1 FBXW7 KO細(xì)胞,加入細(xì)胞裂解液RIPA提取細(xì)胞總蛋白，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行42℃水浴溫?zé)岽碳? h，并在37℃培養(yǎng)恢復(fù)30 min和60 min，用核蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞核蛋白和胞質(zhì)蛋白。用BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，通過(guò)10%SDS-PAGE分離蛋白，采用90V電壓將分離蛋白條帶轉(zhuǎn)移到活化的PVDF膜。用含5%脫脂牛奶的TBST溶液封閉膜1.5 h，然后加入兔抗人HSF1（CST，貨號(hào)4356，1:1000）、兔抗人pHSF-1Ser326單克隆抗體（Invitrogen，貨號(hào)MA5-32105，1:1000）及鼠抗人β-actin（CST，貨號(hào)3700，1:1000）、Lamin A/C（CST，貨號(hào)4777，1:1000）單克隆抗體4℃孵育過(guò)夜；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（CST，貨號(hào)7076，1:5000）及羊抗兔IgG（CST，貨號(hào)7074，1:5000），滴加化學(xué)發(fā)光HRP底物ECL發(fā)光液（Millipore，貨號(hào)WBKLS0500），使用MiniChemi 610Plus型化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)FBXW7對(duì)激活的HSF1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)定位的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116 WT、HCT116 FBXW7 KO、DLD1 WT及DLD1 FBXW7 KO細(xì)胞，制備細(xì)胞爬片。待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，進(jìn)行42℃水浴溫?zé)岽碳? h，并在37℃培養(yǎng)恢復(fù)30 min和60 min，用4%多聚甲醛溶液室溫固定20 min；用0.3%Triton X-100室溫通透20 min；3%BSA室溫封閉1 h；加入兔抗人HSF1（CST，貨號(hào)4356，1:200）和pHSF1Ser326單克隆抗體（Invitrogen，貨號(hào)MA5-32105，1:200）4℃過(guò)夜；加入Alexa Fluor 488標(biāo)記（Invitrogen，貨號(hào)A-11008，1:400）及Alexa Fluor 555標(biāo)記（Invitrogen，貨號(hào)A-21428，1:400）的羊抗兔IgG，避光反應(yīng)2 h；加入DAPI熒光封片劑對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色及封片，熒光顯微鏡（日本奧林巴斯BX53）觀察HSF1的表達(dá)位置變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果數(shù)據(jù)以（）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FBXW7α 基因過(guò)表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞中pHSF1Ser326蛋白的表達(dá)水平

與對(duì)照組相比，DLD1細(xì)胞轉(zhuǎn)染PcDNA3-HA-FBXW7α真核表達(dá)質(zhì)粒后，pHSF1Ser326蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P=0.0003），見(jiàn)圖1。提示FBXW7α可以靶向下調(diào)HSF1的蛋白表達(dá)水平。

圖1 轉(zhuǎn)染后DLD1細(xì)胞中pHSF1Ser326蛋白的表達(dá) (n=3)Figure 1 Expressions of pHSF1Ser326 protein decreased in DLD1 cells after transfection (n=3)

2.2 缺失FBXW7對(duì)HSF1和pHSF1Ser326蛋白在胞質(zhì)和胞核表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，DLD1 FBXW7 KO細(xì)胞的HSF1總蛋白的表達(dá)水平高于DLD1 WT細(xì)胞（P=0.029），HCT116 FBXW7 KO細(xì)胞的HSF1總蛋白的表達(dá)水平高于HCT116 WT細(xì)胞（P=0.039）；HCT116 FBXW7 KO細(xì)胞中pHSF1Ser326總蛋白的表達(dá)水平顯著高于HCT116 WT細(xì)胞（P=0.019），見(jiàn)圖2A。進(jìn)一步采用細(xì)胞免疫熒光法觀察到FBXW7 KO細(xì)胞中HSF1和pHSF1Ser326主要聚集在胞核，在胞質(zhì)中僅有少量表達(dá)。結(jié)果表明，F(xiàn)BXW7的缺失導(dǎo)致HSF1和pHSF1Ser326總蛋白表達(dá)水平顯著升高，并且主要在胞核中表達(dá)，見(jiàn)圖2B～C。

圖2 FBXW7的缺失導(dǎo)致結(jié)直腸癌細(xì)胞中HSF1和pHSF1Ser326主要在胞核中累積Figure 2 Loss of FBXW7 resulted in accumulation of HSF1 and pHSF1Ser326 mainly in nucleus of CRC cells

2.3 缺失FBXW7對(duì)溫?zé)岽碳ず驢SF1在胞核中累積時(shí)間的影響

對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞42℃溫?zé)岽碳こ掷m(xù)1 h，并在37℃培養(yǎng)指定時(shí)間。細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示，溫?zé)岽碳ぜ?xì)胞后HSF1在細(xì)胞核中表達(dá)迅速增強(qiáng)，恢復(fù)30 min后，HCT116 WT和DLD1 WT細(xì)胞中的核HSF1表達(dá)逐漸恢復(fù)至未刺激水平，F(xiàn)BXW7 KO的兩種細(xì)胞中HSF1在核中表達(dá)較強(qiáng)，恢復(fù)60 min后仍然可以看到在核中表達(dá)較強(qiáng)，見(jiàn)圖3。表明FBXW7的缺失導(dǎo)致溫?zé)岽碳ぜ?xì)胞后HSF1恢復(fù)至未刺激水平的時(shí)間延長(zhǎng)。

圖3 FBXW7的缺失使溫?zé)岽碳ぜ?xì)胞后HSF1在胞核中累積時(shí)間延長(zhǎng)Figure 3 Loss of FBXW7 prolonged accumulation of HSF1 in nucleus after warm stimulation

2.4 FBXW7調(diào)控激活的HSF1在胞質(zhì)和胞核中的表達(dá)定位

對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞分別進(jìn)行42℃溫?zé)岽碳こ掷m(xù)1 h，并在37℃恢復(fù)指定時(shí)間。Western blot結(jié)果顯示，溫?zé)岽碳ず?7℃恢復(fù)培養(yǎng)60 min組（Recovery 60 min組）和37℃培養(yǎng)對(duì)照組（Untreated組）的DLD1 WT細(xì)胞中的pHSF1Ser326蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.305），即恢復(fù)60 min后DLD1 WT細(xì)胞逐漸恢復(fù)至未刺激水平。與Untreated組相比，Recovery 60 min組的DLD1細(xì)胞的FBXW7 KO細(xì)胞核中pHSF1Ser326蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（P=0.007），HCT116細(xì)胞的FBXW7 KO細(xì)胞核中pHSF1Ser326蛋白表達(dá)水平也顯著上調(diào)（P=0.002），見(jiàn)圖4A～B。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，溫?zé)岽碳ず驠BXW7 KO細(xì)胞中的pHSF1Ser326在細(xì)胞核中表達(dá)均高于WT細(xì)胞，37℃培養(yǎng)60 min后，HCT116 WT和DLD1 WT細(xì)胞恢復(fù)至未刺激水平，F(xiàn)BXW7 KO細(xì)胞中的pHSF1Ser326在胞核中表達(dá)仍然很強(qiáng)，在胞質(zhì)中表達(dá)較弱，見(jiàn)圖4C～D。以上結(jié)果表明，熱激后HSF1表達(dá)水平恢復(fù)受阻可能與缺失FBXW7不能降解核HSF1有關(guān)，F(xiàn)BXW7可能調(diào)控激活及衰減期間的HSF1在胞質(zhì)和胞核中的表達(dá)定位。

圖4 FBXW7調(diào)控激活的HSF1在胞質(zhì)和胞核中的表達(dá)定位Figure 4 FBXW7 regulated the expression and the localization of activate HSF1 in cytoplasm and nucleus.

3 討論

熱休克反應(yīng)（heat shock response,HSR）是一種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，可防止由于溫?zé)岽碳ぁ⑷毖?、?xì)胞內(nèi)pH值波動(dòng)或暴露于重金屬等的刺激引起的蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊。HSR由轉(zhuǎn)錄因子HSF1誘導(dǎo)熱休克蛋白的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在未受刺激的細(xì)胞中，HSF1處于失活狀態(tài)；當(dāng)受到應(yīng)激刺激時(shí)，HSF1在細(xì)胞核中被磷酸化，形成同源三聚體，結(jié)合DNA并激活熱休克基因轉(zhuǎn)錄[1]。HSF1的激活和恢復(fù)期間受到多種翻譯后修飾的調(diào)節(jié)，尤其是磷酸化對(duì)HSF1調(diào)控轉(zhuǎn)錄具有重要作用。Ser121、Ser303、Ser307以及Ser363磷酸化負(fù)調(diào)控HSF1的轉(zhuǎn)錄活性，而mTOR、MEK和P38 MAPK可以催化Ser326的磷酸化從而激活HSF1[13]?；|(zhì)中磷酸化HSF1的激活與卵巢癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病和骨髓瘤患者的預(yù)后不良有關(guān)[14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核中HSF1的表達(dá)水平增高與結(jié)直腸癌、乳腺癌、腎癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移和不良的生存率有關(guān)[15]。因此，深入研究激活后的HSF1在細(xì)胞核中的表達(dá)水平及定位對(duì)腫瘤的治療具有重要意義。

既往研究表明，F(xiàn)BXW7對(duì)HSF1的泛素化和降解與腫瘤細(xì)胞耐藥有關(guān)[16]。在胃癌中，細(xì)胞核中的代謝酶PDK3以破壞HSF1磷酸化的方式阻止FBXW7介導(dǎo)的HSF1蛋白酶體降解，PDK3與HSF1相互作用形成正反饋回路以促進(jìn)糖酵解[17]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，ERK1/2在耐藥細(xì)胞中可降低FBXW7的表達(dá)，并且通過(guò)抑制HSF1的泛素化降解導(dǎo)致MDR1的轉(zhuǎn)錄激活[18]。FBXW7參與HSF1靶向腸缺血再灌注期間的泛素化和降解，表明FBXW7可能是抑制腸缺血再灌注期間腸黏膜凋亡的潛在治療靶標(biāo)[19]。Nikos等[9]發(fā)現(xiàn)HSF1可以與FBXW7α結(jié)合，是FBXW7α的泛素化底物，通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺失FBXW7的結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116在基礎(chǔ)狀態(tài)下，核HSF1蛋白的表達(dá)水平增高，胞質(zhì)HSF1蛋白表達(dá)無(wú)變化；而溫?zé)岽碳ず蟮腍SF1蛋白在核中表達(dá)水平顯著增高，且熱休克反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)；他們還發(fā)現(xiàn)缺失FBXW7導(dǎo)致黑色素瘤細(xì)胞WM39的核HSF1表達(dá)水平明顯升高，而對(duì)細(xì)胞質(zhì)HSF1表達(dá)無(wú)影響，溫?zé)岽碳ず蠛薍SF1蛋白表達(dá)水平增強(qiáng)，恢復(fù)期間缺失FBXW7的WM39細(xì)胞中的HSF1在核中累積[9]。HSF1在胞核中的累積是由于HSF1在胞質(zhì)和胞核中的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)移變化，還是溫?zé)岽碳r(shí)FBXW7不調(diào)控HSF1的降解，導(dǎo)致HSF1在核中累積，還尚不清楚。

本研究采用細(xì)胞免疫熒光法對(duì)敲除FBXW7的結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行42℃溫?zé)岽碳げ⒂^察HSF1的表達(dá)定位，此細(xì)胞免疫熒光HSF1的定位結(jié)果與文獻(xiàn)[9]所報(bào)道的缺失FBXW7導(dǎo)致HSF1蛋白在核中累積的Western blot結(jié)果一致。為進(jìn)一步探討FBXW7是否調(diào)節(jié)激活的HSF1在胞核中的表達(dá)和定位，通過(guò)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲除FBXW7的細(xì)胞溫?zé)岽碳げ⒒謴?fù)37℃培養(yǎng)30 min后，pHSF1Ser326在胞核中的表達(dá)仍較強(qiáng)，表明缺失FBXW7導(dǎo)致細(xì)胞核中的HSF1降解受阻。有研究表明，HSF1基礎(chǔ)表達(dá)主要在細(xì)胞核內(nèi)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，Western blot實(shí)驗(yàn)表明HSF1在胞質(zhì)有較強(qiáng)的表達(dá)，而免疫熒光實(shí)驗(yàn)卻顯示HSF1主要定位在細(xì)胞核。這可能是由于分離細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)所用的裂解液造成的，大多數(shù)以單體形式存在的HSF1可能在裂解作用下從細(xì)胞核中提取出來(lái)，而三聚體的HSF1在提取過(guò)程中仍與細(xì)胞核DNA緊密結(jié)合[20]。

綜上所述，本研究證實(shí)了FBXW7可調(diào)控HSF1及激活的磷酸化HSF1在胞質(zhì)和胞核中的表達(dá)和定位。推測(cè)FBXW7可能成為結(jié)直腸癌治療的潛在分子調(diào)控靶點(diǎn)。