花生紅衣中原花青素的提取工藝與活性研究

呂 筱，鄭天元，韋新月，竇子珊，代紫，高晨佳，蔡 冉，孟琬星，王汝華，3

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)（天津）有限公司，天津 300457；3.天津科技大學(xué)食品科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，天津 300457）

0 引言

花生（Arachis hypogaeaL.）屬豆科（Leguminosae sp.）落花生屬植物，又稱長(zhǎng)果、泥豆等，是使用廣泛的一種堅(jiān)果，在我國(guó)山東省和河南省生長(zhǎng)最佳[1]。花生紅衣是花生的種皮，因絕大多數(shù)花生品種的種皮為紅色而得名。原花青素是其主要活性成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌抗炎和免疫調(diào)節(jié)等多種活性功能[2-3]。原花青素廣泛存在于植物的果皮、種子、花和葉片中，是一大類天然多酚化合物的總稱[4]。由于其無(wú)毒且安全性較好，具有很強(qiáng)的抗氧化活性，可以有效清除人體內(nèi)的自由基，從而可以起到抗衰老、保護(hù)心腦血管等效果，因此可應(yīng)用于功能性食品等多種領(lǐng)域。原花青素具有多個(gè)酚羥基，可以在人體內(nèi)釋放H+，與自由基競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合，終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而避免脂質(zhì)氧化分解。Ariga T[5]的研究表明，原花色素的抗氧化活性在水性體系中比維C或維E強(qiáng)得多，且純度越高抗氧化能力越強(qiáng)。超聲波法提取廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物及生物活性物質(zhì)提取等領(lǐng)域[6-9]，是最常見(jiàn)的原花青素提取方式[10-12]。試驗(yàn)的目的是立足于有機(jī)溶劑浸提法，對(duì)花生紅衣的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并且探究原花青素的抗氧化功能，旨在降低成本、提高得率，為花生紅衣的綜合利用和深加工提供了新途徑，實(shí)現(xiàn)資源高效率利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生紅衣，乳山市金果花生制品有限公司提供，原料產(chǎn)地山東煙臺(tái)。

石油醚、無(wú)水乙醇、甲醇、鹽酸、硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等，天津市化學(xué)試劑一廠提供；香蘭素、水楊酸、維C、沒(méi)食子酸、原花青素標(biāo)準(zhǔn)品、Tris-HCl等，北京索萊寶科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-3200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；5418 R型微型冷凍離心機(jī)，艾本德中國(guó)有限公司產(chǎn)品；FC型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品；IKA RV8型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，艾卡儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；FE20型酸度計(jì)、ML104型電子天平，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；BILON6-180B型超聲波清洗器，上海比郎儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花生紅衣原花青素的提取

取花生紅衣，使用搖擺式粉碎機(jī)將花生紅衣粉碎，并將花生紅衣粉用80目標(biāo)準(zhǔn)分樣篩過(guò)篩，取篩分后花生紅衣粉，稱質(zhì)量，按料液比1∶15（g∶mL）加入石油醚，于30℃振蕩恒溫水槽中脫脂5 h，抽濾，脫脂后的花生紅衣置于通風(fēng)櫥中自然風(fēng)干，稱重后于4℃冰箱中冷藏密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 花生紅衣原花青素含量測(cè)定

采用香草醛-鹽酸法測(cè)定原花青素含量[13]。以葡萄籽原花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1～0.5 mg/mL）為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=6.774X+0.028 2，R2=0.998 5），測(cè)量樣品于波長(zhǎng)500 nm處吸光度。花生紅衣樣品中的原花青素含量表示為毫克葡萄籽原花青素當(dāng)量每克干原料（mg PC/g DM）。

1.3.3 花生紅衣原花青素提取的工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)（圖1）的結(jié)果，選取提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）、料液比（C）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）4個(gè)因素在3個(gè)水平上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。其他條件為超聲功率100 W，提取次數(shù)3次，測(cè)定各組試驗(yàn)中粗提物的原花青素含量，計(jì)算得率后分析結(jié)果，得到最優(yōu)提取工藝。

1.3.4 花生紅衣粗提物的純化

在最佳提取工藝條件下獲得的原花青素粗提物進(jìn)行旋蒸除凈乙醇。稱取5 g新的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行干燥處理，并浸泡在95%的乙醇溶液中2～4 h。蒸餾水洗去乙醇后濕法裝柱（1 cm×10 cm層析柱），再用2倍體積蒸餾水洗柱床。取20 mL粗提物上樣，靜置一段時(shí)間等待吸附飽和，再用2倍體積蒸餾水洗柱床，然后使用60%乙醇洗脫。收集流出液，觀察顏色規(guī)律。洗脫液旋轉(zhuǎn)除凈乙醇，凍干，得到原花青素純化干物質(zhì)。測(cè)定所得純化干物質(zhì)質(zhì)量，取0.01 mg樣品，溶于1 mL甲醇后，按香草醛-鹽酸法測(cè)定原花青素含量，得到樣品純度。

1.3.5 體外抗氧化活性的測(cè)定

參照浦娜娜[14]的方法測(cè)定花生紅衣樣品的總還原力。對(duì)DPPH自由基的清除試驗(yàn)參考Kamiloglu S等人[15]的方法并稍作修改。超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定參考Mathew S等人[16]的方法并稍作修改。清除羥自由基的測(cè)定參考Goncalves S等人[17]的方法并稍作修改。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。使用Microsoft excel 2010和Origin 9.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單向方差分析（ANOVA），并用SPSS 17.0通過(guò)Duncan的多范圍測(cè)試計(jì)算樣本平均值之間差異的顯著性，p＜0.05表示差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素提取單因素試驗(yàn)

不同因素對(duì)花生紅衣原花青素提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同因素對(duì)花生紅衣原花青素提取率的影響

由圖1（a）可知，原花青素得率隨著時(shí)間變化呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)，并在超聲提取時(shí)間20 min時(shí)，達(dá)到最大值6.63%±0.77%。這是由于超聲時(shí)間越長(zhǎng)，原花青素的溶解量就越多，提取率也會(huì)隨之升高，而提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致導(dǎo)致花生紅衣的纖維素網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)松散，將原花青素限制在內(nèi)部，導(dǎo)致得率下降[18]。由圖1（b）可知，原花青素得率隨著溫度升高呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢(shì)，并在提取溫度30℃時(shí)，達(dá)到最大值6.05%±0.34%。隨著溫度增高導(dǎo)致細(xì)胞脫水，細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，分子運(yùn)動(dòng)的速度加快，從而導(dǎo)致溶出的速度變快，原花青素得率升高[19]。然而，隨著溫度的進(jìn)一步增高，會(huì)加速原花青素氧化的進(jìn)程，同時(shí)雜質(zhì)也會(huì)增加，影響后續(xù)的純化過(guò)程，并且高溫會(huì)加速提取溶劑的揮發(fā)，影響提取效果同時(shí)造成浪費(fèi)。由圖1（c）可知，原花青素得率呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢(shì)，并且在料液比1∶16（g∶mL）時(shí)，達(dá)到最大值6.97%±0.76%。這是由于溶劑的用量增大，提取率也會(huì)隨之有較明顯的升高，原花青素的率達(dá)到最大之后降低，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能的原因是在一定量的提取劑中，原花青素已經(jīng)基本溶出，如果仍繼續(xù)加大提取劑的用量，不僅會(huì)造成提取劑的浪費(fèi)并增加成本，還反而會(huì)因?yàn)樘崛┦褂眠^(guò)量，使超聲波的能量傳遞及空化效應(yīng)減弱，從而使原花青素得率降低[20-21]。在使用低體積分?jǐn)?shù)乙醇作為提取劑時(shí)，出現(xiàn)了難以抽濾的情況，可能的原因是體積分?jǐn)?shù)低于50%的乙醇溶液可提取出某些分子量較大的物質(zhì)，造成抽濾困難，因此提取劑濃度不能過(guò)低。由圖1（d）可知，原花青素得率呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢(shì)，并且在體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，達(dá)到最大值5.29%±1.45%。這可能是因?yàn)樗臉O性較大，乙醇的極性較小，乙醇溶液的極性會(huì)隨著體積分?jǐn)?shù)的增大而逐漸下降，因此在極性降低至一定程度后，原花青素在其中的溶解量會(huì)減少。

2.2 正交試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選定提取時(shí)間、提取溫度、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)4個(gè)因素的最優(yōu)條件設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，其他試驗(yàn)條件為，超聲功率100 W，提取3次，每組試驗(yàn)均進(jìn)行3次。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)L9（34）設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表2 正交試驗(yàn)L9（34）設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2可知，花生紅衣中原花青素最優(yōu)提取條件為提取時(shí)間17.5 min，提取溫度為30℃，料液比1∶16（g∶mL），提取劑為70%的乙醇溶液，超聲功率100 W的條件下，提取3次。由極差分析可以看出各因素對(duì)花生紅衣中原花青素提取影響的主次順序?yàn)榱弦罕龋–）＞提取溫度（B）＞提取時(shí)間（A）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）。料液比對(duì)提取得率影響較大。選取最優(yōu)提取條件提取原花青素，重復(fù)3次，得率為7.82%±0.02%。

2.3 花生紅衣原花青素粗提物的純化

對(duì)粗提物干物質(zhì)使用香草醛-鹽酸法進(jìn)行純度測(cè)定，所得純度為34.28%±0.12%。使用AB-8型大孔吸附樹(shù)脂分離純化，測(cè)定洗脫曲線（見(jiàn)圖2（a））。純化后原花青素純度為76.85%±0.24%，純度較比未純化前提升42.57%，純度比較結(jié)果（見(jiàn)圖2（b））。

原花青素粗提物的分離純化見(jiàn)圖2。

圖2 原花青素粗提物的分離純化

2.4 原花青素的抗氧化活性研究

原花青素的抗氧化活性見(jiàn)圖3。

圖3 原花青素的抗氧化活性

分別測(cè)定質(zhì)量濃度為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL的粗提物、純化物樣品的總還原力、超氧陰離子自由基的清除率、羥基自由基的清除率。測(cè)定質(zhì)量濃度為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL的粗提物、純化物樣品的對(duì)DPPH自由基的清除率。均以0.2 mg/mL維C溶液為對(duì)照。由圖3（a）可知，在質(zhì)量濃度0.1～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，未純化與純化后的原花青素溶液的總還原力隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，在0.5 mg/mL質(zhì)量濃度下達(dá)到最大，最大值為分別0.718±0.021和0.685±0.014。相同作用質(zhì)量濃度下未純化原花青素清除率與純化原花青素總還原力無(wú)顯著性差異，總還原力隨原花青素質(zhì)量濃度的升高而升高。相同質(zhì)量濃度下花生紅衣中原花青素的總還原力略低于維C，當(dāng)原花青素質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL時(shí)，與0.2 mg/mL的陽(yáng)性對(duì)照維C總還原力能力相當(dāng)。由圖3（b）可知，在0.1～0.5 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，未純化與純化后的原花青素溶液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增大而增大，在0.5 mg/mL質(zhì)量濃度下達(dá)到最大，最大值分別為31.94%±5.1%和33.04%±5.2%。其中，未純化原花青素清除率略低于純化原花青素清除率。在同樣的質(zhì)量濃度下，花生紅衣中原花青素對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果低于維C。由圖3（c）可知，在質(zhì)量濃度0.1～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，未純化與純化后的原花青素溶液對(duì)羥基自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增大而增大，在質(zhì)量濃度0.5 mg/mL時(shí)達(dá)到最大，最大值分別為33.80%±6.22%和39.97%±3.72%。其中，未純化原花青素清除率略低于純化原花青素清除率。在同樣的質(zhì)量濃度下，花生紅衣中原花青素對(duì)羥基自由基的清除效果低于維C。由圖3（d）可知，在質(zhì)量濃度0.01～0.02 mg/mL范圍內(nèi)，未純化與純化后的原花青素溶液對(duì)DPPH自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增大而增大，在質(zhì)量濃度0.03～0.05 mg/mL范圍內(nèi)，對(duì)DPPH自由基的清除率幾乎趨于恒定，在0.05 mg/mL質(zhì)量濃度時(shí)達(dá)到最大，最大值分別為91.58%±0.14%和92.08%±0.01%。在同樣的質(zhì)量濃度下，未純化原花青素清除率與純化原花青素清除率無(wú)顯著性差異。花生紅衣中原花青素對(duì)DPPH自由基的清除效果遠(yuǎn)高于維C。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)論證，可知料液比對(duì)花生紅衣中原花青素的提取影響較大，因此在工業(yè)生產(chǎn)中可嚴(yán)格控制提取過(guò)程中的料液比，適當(dāng)改變其他條件來(lái)降低成本、提高得率，實(shí)現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)利益最大化。經(jīng)過(guò)分析得出花生紅衣中提取原花青素的最優(yōu)提取工藝：超聲功率100 W，提取溫度30℃，提取時(shí)間17.5 min，按料液比1∶16（g∶mL）加入70%乙醇溶液作為提取劑，提取3次，合并濾液。在最優(yōu)工藝條件下，花生紅衣中提取原花青素的得率為7.82%±0.02%。將原花青素粗提物純化后，純度可達(dá)到76.85%±0.24%，較未純化提升42.57%，同時(shí)抗氧化活性也有一定的提升，在工業(yè)上具有純化價(jià)值。因此，花生紅衣作為生產(chǎn)廢料的再利用價(jià)值較高，花生紅衣原花青素可作為一種天然抗氧化劑，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、保健品和醫(yī)藥領(lǐng)域。